滿天星莖腐病中一種新病原菌的分離與鑒定

關(guān)鍵詞：滿天星；莖基腐；南方鐮孢菌

中圖分類號：S436.8 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

滿天星（Gypsophila paniculata L.），原名為重瓣絲石竹，別名霞草、白孔雀草、絲石竹等，原產(chǎn)地中海沿岸，在我國原產(chǎn)于新疆北部及西部，生于海拔1000～1500 m 地區(qū)。系石竹科絲竹屬的一年生草本花卉，是當(dāng)今世界最流行的鮮切花配花之一[1-3]。重瓣滿天星花不育，生產(chǎn)上采用扦插種植，但該方法繁殖系數(shù)低，無法滿足市場需求，組培快繁是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗的主要途徑[3-4]。滿天星的用途廣泛，根、莖可供藥用，集觀賞、藥用于一體[5]。云南省昆明地區(qū)的滿天星種植始于20 世紀(jì)90 年代初，經(jīng)過20 多年的發(fā)展已成為云南省主栽鮮切花之一，云南昆明是全國種植面積最大的地區(qū)之一，產(chǎn)品銷往全國各地，部分遠(yuǎn)銷我國臺灣、香港，以及新加坡、馬來西亞、菲律賓等地[6-7]。

鐮刀菌屬（Fusarium spp.）是世界性的重要病原真菌之一，寄主植物達(dá)100 余種，侵染包括糧食作物、經(jīng)濟作物、藥用植物及觀賞植物等，主要為害植物的根、莖、花等部位，引起植物的根腐、莖腐、穗腐等多種病害，在世界范圍內(nèi)造成許多毀滅性的植物病害，如黃色鐮刀菌（F.culmorum）造成的甘蔗頂腐病，串珠鐮刀菌（F.moniliforme）造成的巴拿馬香蕉萎蔫病，以及茄病鐮刀菌（F. solani）導(dǎo)致世界范圍的根腐病等[8]。鐮刀菌侵染寄主植物維管束系統(tǒng)，產(chǎn)生毒素為害作物，導(dǎo)致作物枯萎死亡，降低作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟損失。據(jù)統(tǒng)計，全世界每年因鐮刀菌引起的農(nóng)產(chǎn)品損失高達(dá)數(shù)百億美元[9-11]。

禾谷鐮刀菌是一個復(fù)合種Fusarium graminearumspecies complex（FGSC），從O’DONNELL等[12]采用宗系譜法（GCPSR）劃分種至今，已經(jīng)至少確認(rèn)由16 個種構(gòu)成，包括亞洲鐮孢菌（F.austroamericanum）、南方鐮孢菌（F. meridionale）、布氏鐮孢菌（F. boothii）、禾谷鐮孢菌（F. graminearumsensu stricto）、蒲葦鐮孢菌（F. cortaderiae）等。禾谷鐮孢復(fù)合種（FGSC）是禾谷作物的重要病原菌，如小麥赤霉病（FHB）主要由禾谷鐮孢復(fù)合種（FGSC）引起，是小麥的一種重大的真菌流行病害，造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)[13-14]。其中禾谷鐮孢菌是世界范圍內(nèi)小麥赤霉病最常見的致病菌，但據(jù)張昊[15]報道南方鐮孢菌也能引起我國小麥赤霉病，另外ZHOU 等[16]報道南方鐮孢菌是引起玉米穗腐病的主要致病菌之一，周潔等[17]報道南方鐮孢菌還能引起魔芋干腐病。

滿天星病害種類較多，常見病害有真菌性病害，包括由鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的黑斑病，由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病，由Erysiphe buhrii 引起的白粉病，由疫霉屬（Phytophthora spp.）、腐霉屬（Pythiumspp.）、絲核菌屬（Rhizoctonia spp.）以及鐮刀菌屬引起的莖腐病、根腐病等腐爛病。除真菌性病害外，還有由細(xì)菌引起的冠癭病等，以及由支原體、病毒和線蟲引起的病害。由鐮刀菌屬引起的滿天星莖腐病，早期癥狀出現(xiàn)莖基部周圍變色，上部葉片輕微萎蔫，晚期癥狀出現(xiàn)冠腐、根腐，嚴(yán)重萎蔫，最終導(dǎo)致植株死亡，造成經(jīng)濟損失[18]。在國外關(guān)于該病的報道較多，國內(nèi)鮮有報道，目前已報道的滿天星莖腐病主要由尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）[19]、黃色鐮刀菌[20]、茄病鐮刀菌[21]、禾谷鐮孢菌[21]引起，但未見南方鐮孢菌引起滿天星莖腐病的相關(guān)報道，這是我國首次報道由南方鐮孢菌引起滿天星莖腐病。因此，本文從滿天星莖腐病的發(fā)病癥狀、病原物的分離與鑒定等方面對滿天星莖腐病進(jìn)行研究，為今后花卉生產(chǎn)的病害預(yù)防與控制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病樣采集 2021 年3 月在云南省昆明市西山區(qū)?？阪?zhèn)（24.80°N， 102.60°E）采集滿天星（云星4 號）莖腐病樣品，分裝到自封袋后帶回實驗室，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

康乃馨葉片培養(yǎng)基（CLA）：康乃馨葉片剪成3～5 mm 小段，濕熱滅菌，將滅菌的康乃馨葉片在無菌操作臺中放入水瓊脂固體培養(yǎng)基中，每皿5～6 片。

綠豆液體培養(yǎng)基：稱取綠豆30 g，綠豆洗凈后放入沸水中煮至開花，用紗布過濾，自然pH，將濾液用蒸餾水定容至1000 mL后分裝到100 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采用稍作改良的常規(guī)組織分離法[22]，從滿天星莖部切下約10 mm×3 mm 的病害組織，清水洗凈表面雜質(zhì)，用70%酒精浸泡30 s，再用0.5%次氯酸鈉漂洗2 min，最后用滅菌水漂洗3 次，濾紙片吸干，將病組織接入PDA 培養(yǎng)基，置于25 ℃下恒溫培養(yǎng)3～5 d。待菌落長出后，挑取菌落至新的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，純化后菌種置于?80 ℃保存，備用，將該菌株命名為KMHK4-2。

1.2.2 病原菌的致病性檢測 根據(jù)柯赫氏法則，分別用滿天星組培苗和盆栽苗進(jìn)行致病性試驗。

（1）滿天星組培苗致病性試驗。對10 株滿天星組培苗進(jìn)行分離物的致病性試驗。參照方中達(dá)[22]的接種方法，對滿天星的莖部進(jìn)行接種，用無菌注射器將濃度為1×105 個/mL 的孢子懸浮液緩慢注入莖部。將10 μL 孢子懸浮液或無菌水對照的接種量施加到莖部。植物在組織培養(yǎng)室中以12 h 的暗光循環(huán)在（24±2）℃下培養(yǎng)7 d 后，觀察并記錄發(fā)病情況。

（2）滿天星盆栽苗致病性試驗。對10 株滿天星盆栽苗進(jìn)行分離物的致病性試驗。參照LEE等[23]的滿天星病原菌接種方法，將健康滿天星植株的根和莖基部浸入濃度為1×105 個/mL 的孢子懸浮液，15 min 后將其轉(zhuǎn)移至無菌土壤中，在潮濕的室內(nèi)保持72 h，然后移至溫室。用滅菌水處理的植株作為對照。接種7 d 后，觀察并記錄發(fā)病情況。致病性測定重復(fù)3 次。

1.2.3 病原菌的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定。主要依據(jù)LESLIE 等[24]的形態(tài)學(xué)分類鑒定方法，將分離物接種到PDA 培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)5 d 后觀察記錄菌落形態(tài)特征；使用CLA 培養(yǎng)基和綠豆液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)孢，待產(chǎn)孢后，利用顯微鏡觀察并測量孢子大小。

（2）分子生物學(xué)鑒定。以形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果為基礎(chǔ)，選取分離到的菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，取0.1 g 菌絲，采用CTAB 法[25]提取病原菌基因組的DNA。采用rDNA-ITS 擴增進(jìn)行病原菌屬水平的鑒定，采用翻譯延伸因子1-α（translation elongation factor 1-α， TEF-1α）擴增進(jìn)行病原菌種的鑒定。rDNA-ITS 基因擴增采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[26]；TEF-1α 基因擴增采用引物EF1T（5′-ATGGGTAAGGAGGACAAGAC-3′）和EF2T（5′-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3′）[27]（由北京擎科生物有限公司合成）進(jìn)行PCR 擴增后，委托北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行純化和測序。將測序所得的DNA 序列與NCBIGenBank 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）和Fusarium-ID 鐮刀菌數(shù)據(jù)庫（https：//www.fusarium.org）中進(jìn)行同源性比對，同時將DNA序列上傳到NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得序列登錄號。利用Mega 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 采用鄰接法（neighbour-joining， NJ），bootstrap value 設(shè)置為1000，確定該菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 滿天星莖腐病的發(fā)病癥狀

滿天星莖腐病發(fā)生在幼苗期間，在所調(diào)查的滿天星大棚基地內(nèi)，該病害發(fā)病率約為10%。受感染的植株中，典型的癥狀是萎蔫和莖腐爛，在早期發(fā)病癥狀的植株中發(fā)現(xiàn)其根部尚未見壞死（圖1）。

2.2 滿天星致病性測定

如圖2和圖3 所示，通過滿天星組培苗和盆栽苗接種分離物7d后，觀察到植株莖部腐爛和萎蔫癥狀，而在CK 植株上未觀察到發(fā)病癥狀?？潞帐戏▌t證明該真菌分離物可造成滿天星組培苗、盆栽苗表現(xiàn)出與田間病株相似的癥狀，并分離獲得與滿天星病株初分離物菌落形態(tài)相同的真菌菌株。

2.3 滿天星莖腐病標(biāo)樣中致病菌的分離鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)特征 將在滿天星莖基部分離到的病原菌（KMHK4-2）接入PDA 培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，菌絲生長迅速并產(chǎn)生大量的致密氣生菌絲，在PDA 培養(yǎng)基上菌絲顏色從白色到淡橙色、黃色不等，PDA 培養(yǎng)基背面有暗紅色色素沉積，培養(yǎng)5 d 后，菌落可長滿直徑為9 cm的培養(yǎng)基（圖4A，圖4B）。

挑取菌落至CLA 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)其產(chǎn)孢，于25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，在顯微鏡下可見少量大型分生孢子，大型分生孢子相對細(xì)長，呈鐮刀形，腹面較平直，背側(cè)呈拱形，3～6 個隔膜，未見小型分生孢子。從PDA 培養(yǎng)基中打下菌餅，置于綠豆液體培養(yǎng)基中，于25 ℃搖床培養(yǎng)5～7 d 產(chǎn)生大量分生孢子，分生孢子形態(tài)與CLA 培養(yǎng)基中基本一致，具有3～6 個隔膜，未見小型分生孢子，分生孢子大小為（21.1～57.9）μm×（2.7～5.1）μm（n=100）（圖4C）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，參考LESLIE等[24]的形態(tài)學(xué)分類鑒定方法，將滿天星莖腐病的病原初步鑒定為廣義上的禾谷鐮刀菌，即禾谷鐮孢復(fù)合種（ F. graminearum species complex，F(xiàn)GSC）。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定 選取ITS 和TEF-1α 基因序列對菌株KMHK4-2 的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，分別獲得大小為519、650 bp 的片段。將分離物ITS 和TEF 的序列提交至GenBank，獲得登錄號ITS（Accession No. OP257274）、TEF（AccessionNo. OP302808），在GenBank 數(shù)據(jù)庫和Fusarium-ID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性檢索。菌株KMHK4-2 的ITS序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST 比對，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5），該菌株初步鑒定為禾谷鐮孢復(fù)合種。為進(jìn)一步明確該菌株的具體種類，擴增TEF-1α 基因片段，將測序結(jié)果與NCBI的Gen Bank 數(shù)據(jù)庫和Fusarium-ID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示菌株KMHK4-2 的序列與南方鐮孢菌（F. meridionale）DS27（MN629330.1）、CBS110247（AF212435.1）等菌株的相似度達(dá)100%。從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載禾谷鐮孢復(fù)合種的模式菌株序列，采用Mega 7.0 軟件中的neighbourjoining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6）。從進(jìn)化樹可以看出，菌株KMHK4-2 的TEF-1α 序列與南方鐮孢菌的不同菌株聚在同一分支。綜上所述，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，將KMHK4-2 確定為南方鐮孢菌（F. meridionale）。

3 討論

ITS 序列因其間隔序列較短，利于PCR 的擴增，被廣泛應(yīng)用于真菌分類的標(biāo)記序列，但I(xiàn)TS作為rDNA 中的中度保守區(qū)，對部分間隔區(qū)差異性較小的真菌（如鐮刀菌屬），只適合屬水平上的鑒定，對屬內(nèi)種的鑒定并不適合[28]。本研究在NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 比對過程中也發(fā)現(xiàn)，只能將病原菌鑒定到鐮刀菌屬，無法將其準(zhǔn)確鑒定到具體種。TEF-1α 序列是編碼蛋白翻譯裝置的主要部分，在鐮刀菌種水平上含有豐富的信息量，分辨率高，與ITS 序列相比種間差異更大，且具有穩(wěn)定性和多樣性，目前在鐮刀菌種類鑒定上應(yīng)用廣泛，可作為對鐮刀菌種類劃分的一個重要補充[29-31]。DONG 等[32]通過形態(tài)學(xué)和TEF-1α 序列鑒定并首次報道了水稻上的一種赤霉病菌為南方鐮孢菌。因此，為進(jìn)一步準(zhǔn)確鑒定到具體的種，在ITS 序列的基礎(chǔ)上結(jié)合TEF-1α 序列分析，將鐮刀菌鑒定到具體的種。

通過DNA 標(biāo)記進(jìn)行真菌鑒定最廣泛使用的算法是基于序列比對的搜索工具（BLAST），可以在NCBI 的GenBank 網(wǎng)站上獲得，這是一種快速而有效的方法，該數(shù)據(jù)庫可以提供大量信息，但存在大量鑒定錯誤的菌株和必須過濾掉的低質(zhì)量序列，必須仔細(xì)分析其結(jié)果[33-34]。O’DONNELL等[35]和GEISER 等[36]在系統(tǒng)發(fā)育分析中發(fā)現(xiàn)，使用的一些序列似乎與錯誤的鐮刀菌名稱有關(guān)，可能是由于使用了所用數(shù)據(jù)庫中的錯誤序列。Fusarium-ID 數(shù)據(jù)庫是一個用于鑒定鐮刀菌種、屬的專用數(shù)據(jù)庫，可進(jìn)行常規(guī)分離菌株的序列相似性分析[37]。因此，本研究為了更準(zhǔn)確地鑒定，在NCBI基礎(chǔ)上結(jié)合Fusarium-ID 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列檢索。

滿天星是一種主要作為填充切花的世界性作物，由土壤傳播病原體引起的真菌病害中，疫霉病和立枯病是世界上最具毀滅性的滿天星病害。在栽培過程中，腐霉屬和立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）尤其具有危害性。在成熟植株中，鐮刀菌屬會造成基部組織腐爛，導(dǎo)致植株死亡[18]。由鐮刀菌屬侵染造成的滿天星腐爛，在阿根廷、以色列、韓國、波蘭均有相關(guān)報道[18]，這些鐮刀菌屬病原菌包括擬輪枝鐮孢菌（F. verticillioides）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）、串珠鐮刀菌、黃色鐮刀菌、茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、禾谷鐮刀菌。其中，20世紀(jì)90年代在阿根廷，禾谷鐮刀菌被WOLCAN 等[21]首次確定為滿天星莖腐病的病原菌，但僅鑒定為禾谷鐮孢復(fù)合種，未確定具體的亞種。該研究還強調(diào)禾谷鐮刀菌很少感染滿天星的根部，在受感染的情況下，莖基部組織出現(xiàn)壞死，顏色呈黑褐色并開始擴散，枯萎的葉片仍然長在莖上。側(cè)芽數(shù)量減少，作物的生命周期縮短，造成一定的經(jīng)濟損失。滿天星莖腐病在中國鮮有報道，據(jù)查詢文獻(xiàn)，這是我國首次報道由南方鐮孢菌引起的滿天星莖腐病，本研究為滿天星的病害監(jiān)測和綜合治理提供了理論基礎(chǔ)。

鐮刀菌屬除了能引起世界性病害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，還能產(chǎn)生多種毒枝菌素的次級代謝物污染農(nóng)產(chǎn)品，嚴(yán)重威脅人類及動物健康。因此，測定南方鐮孢菌產(chǎn)生的毒素類型是下一步的研究方向，植物病原菌毒素的研究將為新型殺菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。