香蕉枯萎病菌內(nèi)源報告基因Foc4carS的鑒定及其應(yīng)用

關(guān)鍵詞：香蕉枯萎菌Foc4；Foc4carS 基因；類胡蘿卜素；基因敲除；CRISPR/Cas9 基因編輯

中圖分類號：S436.68 文獻標(biāo)志碼：A

鐮刀菌屬（Fusarium）真菌是主要的植物病原菌，能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物，次生代謝產(chǎn)物可以分為聚酮類（黃色鐮刀菌素、伏馬毒素和玉米赤霉烯酮等）、非核糖體多肽類（鐵載體等）和萜類（單端孢霉烯和類胡蘿卜素等）3 種主要的類型[1-2]。在萜類化合物中，類胡蘿卜素生物合成的主要產(chǎn)物是羧基葉黃素鏈孢霉黃素（carboxylicxanthophyll neurosporaxanthin， NX），由香葉酰焦磷酸鹽通過carRA、carB、carT、carD 四種結(jié)構(gòu)基因編碼不同的酶參與類胡蘿卜素的生物合成，類胡蘿卜素的生物合成相關(guān)基因受到光照的正調(diào)控表達[3-6]。此外，這些真菌還產(chǎn)生少量的β-胡蘿卜素（β-carotene），β-胡蘿卜素可能被CarX 加氧酶裂解產(chǎn)生視網(wǎng)膜，即視紫紅質(zhì)的發(fā)色團[7-8]。

carS 基因通過調(diào)控下游car 結(jié)構(gòu)基因參與調(diào)控鐮刀菌類胡蘿卜素的生物合成。在水稻惡苗病菌（Fusarium fujikuroi）中利用化學(xué)誘變劑[甲基硝基亞硝基胍（N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidine，MNNG）]首次獲得了類胡蘿卜素過量表達的carS 突變體，carS 突變體菌落呈深橙色[9]。carS基因在結(jié)構(gòu)和功能上保守，將水稻惡苗病菌（F.fujikuroi）的carS 基因回補到F. oxysporum 的carS突變體中，可以恢復(fù)類胡蘿卜素的生物合成[4]；在尖孢鐮刀菌番茄?；停‵. oxysporum f. sp.lycopersici strain 4287， Fol ） 上也鑒定到編碼RING-finger 的carS 基因，敲除carS 后的突變體菌株出現(xiàn)深橙色菌落顏色，carS 基因通過負(fù)調(diào)控下游car 結(jié)構(gòu)基因控制類胡蘿卜素的生物合成[5]。此外，carS 受到上游lncRNA carP 的負(fù)調(diào)控表達[10]。敲除carP 后carS 上調(diào)表達，突變株出現(xiàn)白化表型，通過轉(zhuǎn)錄組測序以及重新導(dǎo)入carP 到敲除突變體的表型分析表明，carP 只有在插入carS 上游表型才能夠恢復(fù)，因此，carP 是順式調(diào)控因子，通過負(fù)調(diào)控carS 基因參與調(diào)控鐮刀菌屬Fusarium的類胡蘿卜素生物合成[11]。在有光照的情況下，carS 的mRNA 水平更高，氮饑餓無明顯變化，在熱休克或氧化應(yīng)激后，carS 的mRNA 水平明顯下降，這表明存在不同的激活機制。CarS 突變體的孢子比野生型的孢子對H2O2 的抗性更強，然而，該突變體在生長水平上表現(xiàn)出更強的H2O2 敏感性，這可能是由于CarS 參與調(diào)節(jié)具有過氧化氫酶結(jié)構(gòu)域的基因[12]。

CRISPR/Cas9 是一種存在于細菌和古菌中保守的獲得性免疫防御機制，近年來已被開發(fā)成為一種方便靈活的基因組編輯技術(shù)，可直接在基因組上進行DNA 序列的敲除、插入、定點突變以及組合編輯等[13-15]。王艷瑋等[16]在香蕉枯萎菌Foc4中克隆鑒定出Foc4Bik1 基因，通過同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR）的方式進行Foc4Bik1 基因編輯，獲得ΔFoc4Bik1（HDR）基因編輯敲除子，該ΔFoc4Bik1（HDR）基因編輯敲除子呈現(xiàn)白色菌落表型。本研究以香蕉枯萎菌Foc4 為研究對象，通過獲得Foc4carS 基因的敲除和回補突變體，測定突變體的生物學(xué)表型和致病力，明確Foc4carS 基因功能，同時構(gòu)建以Foc4carS 為靶標(biāo)基因的體內(nèi)表達Cas9 和sgRNA的質(zhì)粒型CRISPR/Cas9 基因編輯體系，并以此評估在香蕉枯萎菌Foc4 中基因編輯的可行性，為香蕉枯萎菌的分子生物學(xué)研究提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株、載體、香蕉品種和引物 香蕉枯萎病菌4號生理小種（F. oxysporum f. sp.cubense race 4， Foc4），由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所熱帶果樹病害研究組鑒定保存；回補載體pYF11由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)張海峰教授課題組惠贈，載體pKOV21 由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院陳小林教授課題組惠贈；試驗接種的香蕉品種為巴西蕉（Musa AAA Cavendish cv.Brazil），購自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院種苗組培中心；PCR 引物由北京六合華大基因科技有限公司合成（PAGE 純化，表1）。

1.1.2 主要試劑 DNA 普通聚合酶（ 2×TaqMaster Mix Dye Plus， P112-1）、DNA 高保真聚合酶（Phata Max Super-fidelity DNA Polymerase，P505-d2）、DNase I（EN401）、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（ HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，R111-02）、qRT-PCR 試劑盒（ChamQ SYBR qPCRMaster Mix， Q311-03）、DNA 重組克隆試劑盒（ClonExpress? II One Step Cloning Kit， C112-02）等購自南京諾唯贊（Vazyme）生物科技股份有限公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒（Plasmid Mini Kit I，D6943-02）和膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit，D2500-02）購自O(shè)mega Bio-Tek 公司；溶壁酶（Lysing enzymes from Trichoderma harzianum，L1412）和崩潰酶（DriselaseTM from Basidiomycetessp.， D9515-25G）購自Sigma 公司；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（ Alkali-CationTM Yeast Transformation Kit，#112200200）、總RNA 提取試劑盒（Trizol Reagent，B610409-0100）等購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和緩沖液 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，切成土豆片后，加入蒸餾水煮25～30 min后，用3 層紗布過濾，加入20.0 g 葡萄糖，15.0 g瓊脂粉至濾液中，定容至1 L；LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化鈉10.0 g，ddH2O 定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 至7.0（固體LB 培養(yǎng)基加入15.0 g 瓊脂粉）；YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨10g，酵母提取物3 g，葡萄糖20 g，ddH2O 定容至1 L（固體YEPD 培養(yǎng)基加入15.0 g 瓊脂粉）；RM 再生培養(yǎng)基：蔗糖205.5 g，酵母提取物3.0 g，葡萄糖20.0 g，ddH2O 定容至1 L（固體RM 培養(yǎng)基加入15.0 g 瓊脂粉）。

0.7 mol/L NaCl 緩沖液：40.908 g NaCl，ddH2O定容至1 L；1 mol/L Tris（pH 7.5）緩沖液：Tris Base121.14 g，HCl 調(diào)節(jié)pH 至7.5，ddH2O 定容至1 L；STC 緩沖液：1.2 mol/L 山梨醇，10 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl2，ddH2O 定容至1 L；PTC 緩沖液：40% PEG 3350，10 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5），50 mmol/L CaCl2，ddH2O 定容至1 L。

1.2 方法

1.2.1 Foc4carS 在基因組的位置排列以及蛋白結(jié)構(gòu)域分析 從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載香蕉枯萎菌Foc4carS 基因（FOIG_05085）序列，利用在線軟件SMART（http：//smart.embl.de）分析Foc4carS蛋白的保守功能域。通過Blastx 進行同源比對，獲得Foc4carS 親緣關(guān)系相近的蛋白序列，利用MEGA-X 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（統(tǒng)計方法選用Neighbor-Joining，選用Bootstrap method 進行系統(tǒng)發(fā)育檢驗，No. of Bootstrap Replications 為1000次；替代模型選用Jones-Taylor-Thornton （JTT）model）。

參考已發(fā)布的Foc4 野生株基因組序列（JH658279.1）分析carS 基因在Foc4 基因組上與調(diào)控基因之間的相對位置。首先，分析Foc4carS上游是否存在負(fù)調(diào)控lncRNA carP ， 以及與Foc4carS 基因在基因組上的相對排列位置[11]；其次，分析Foc4carS 下游結(jié)構(gòu)基因carRA、carB、carT、carD 以及carX 在基因組上的排列位置以及是否呈基因簇排列[7]。

1.2.2 Foc4carS 基因敲除片段的構(gòu)建 以香蕉枯萎菌Foc4 的基因組DNA 為模板，分別用引物carS-U-F/carS-NEO-U-R 和carS-NEO-D-F/carS-DR擴增出Foc4carS 的上、下游片段，利用Splitmarker重組方法[17]，用引物carS-N-F/NEO-R1 和NEO-F1/carS-N-R 構(gòu)建與新霉素的融合片段，并用于后續(xù)的Foc4carS 基因敲除。

1.2.3 PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化以及ΔFoc4carS敲除突變體的驗證 香蕉枯萎菌Foc4 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及敲除突變體的驗證參照文獻[16， 18-19]。將含有部分新霉素抗性基因NEO 序列的上、下游敲除片段（3～5 μg）加入到含有200 μL Foc4 原生質(zhì)體的2.0 mL 離心管中，輕柔混勻后，冰上放置30 min。向混合液中逐滴加入200 μL PTC，輕柔混勻，冰上放置7 min；再次逐滴加入200 μL PTC，輕柔混勻，冰上放置7 min；將約700～800 μL 原生質(zhì)體混合液轉(zhuǎn)移至50 mL 圓底離心管中，逐滴加入800 μL PTC，輕柔混勻，室溫放置10 min。將預(yù)冷的STC 溶液加入到混合液至25 mL，輕柔混勻后，4 ℃，5000 r/min 離心10 min，小心去除上清液；加入RM 液體培養(yǎng)基5 mL，充分混勻，轉(zhuǎn)至28 ℃，100 r/min 搖培12～16 h。加入30 mL含有200 μg/mL 新霉素和50 μg/mL 鏈霉素的RM固體培養(yǎng)基，輕柔混勻后倒入5 個培養(yǎng)皿，室溫靜置10 min，向5 個平板內(nèi)再分別倒入15 mL RM固體培養(yǎng)基（200 μg/mL 新霉素和50 μg/mL 鏈霉素），室溫靜置30 min，隨后轉(zhuǎn)入28 ℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3～7 d，長出轉(zhuǎn)化子后，將轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于PDA 培養(yǎng)基（200 μg/mL 新霉素和50 μg/mL 鏈霉素）繼續(xù)進行抗性篩選，28 ℃培養(yǎng)3～5 d，長出菌落后收集菌絲，提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，用carS-outside-1F/carS-outside-2609R 、carS-Inside-1F/carS-inside-785R、NEO-F/NEO-R 等3 對引物對轉(zhuǎn)化子進行PCR 驗證。

1.2.4 Foc4carS 基因回補載體的構(gòu)建以及回補轉(zhuǎn)化子的獲得 以pKOV21 質(zhì)粒DNA 為模板，使用引物HYG-pYF11-PgpdA-F/HYG-pYF11-PgpdAR擴增Hph 抗性基因片段，以pYF11 為骨架，用Pst Ⅰ單切線性化，將Hph 抗性基因片段連入pYF11，獲得載體pYF11-Hph。以Foc4 基因組DNA 為模板， 引物carS-Com-native-1F/carSCom-3414R 進行PCR 擴增，擴增片段Foc4carSCom長度為3414 bp，含有Foc4carS 基因原始啟動子序列（1380 nt）和ORF 序列（1973 nt，去除終止密碼子）。

將載體pYF11-Hph 用Xho Ⅰ單切線性化，將3.4 kb 的擴增片段Foc4carS-Com 和pYF11-Hph按照9∶1 比例共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)，在酵母SD-Trp培養(yǎng)基長出單菌落后，利用pYF11 骨架上的通用引物M13F（-47）與Foc4carS 基因特異反向引物carS-inside-785R 組合，進行菌落PCR 驗證，將陽性單克隆提取酵母質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，進行菌落PCR 后獲得回補載體pYF11-Hph-Foc4carS。

ΔFoc4carS 的基因回補過程的原生質(zhì)體制備和PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化參照方法1.2.3，將15～20 μg 的回補載體pYF11-Hph-Foc4carS 與200 μL ΔFoc4carS基因敲除突變體原生質(zhì)體混合，在含有100 μg/mL潮霉素的RM 再生培養(yǎng)基進行抗性篩選，轉(zhuǎn)化子用carS-inside-1F/carS-Inside-785R、HYG-probe-1F/HYG-probe-598R 、pCT74-sGFP-123F/pCT74-sGFP-468R 等3 對引物進行PCR 驗證。

1.2.5 ΔFoc4carS 突變體生長特性分析 參照王艷瑋等[16]的方法對ΔFoc4carS突變體進行菌落形態(tài)觀察、菌落直徑的測定、分生孢子形態(tài)顯微觀察和分生孢子產(chǎn)量測定等，試驗重復(fù)3 次。

1.2.6 Foc4carS 基因以及類胡蘿卜素合成途徑carRA 和carB 的定量表達分析 收集Foc4 和ΔFoc4carS 分別接種于PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 的菌絲，液氮處理10 min 后于–80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肨rizol 法提取樣品的總RNA，按照HiScript?Ⅲ Reverse Transcriptase操作說明書進行cDNA合成，參考ChamQ SYBR qPCR Master Mix 產(chǎn)品說明書，采用20 μL 體系，分別使用carS-qPCR-F/carS-qPCR-R 、carRA-qPCR-F/carRA-qPCR-R 、carB-qPCR-F/carB-qPCR-R 等3 對引物進行qRT-PCR，以Foc4 的Actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT值比較分析car 基因在Foc4 和ΔFoc4carS 不同光/暗處理下的表達量。

1.2.7 ΔFoc4carS 突變體致病力分析 ΔFoc4carS突變體致病力測定參照王艷瑋等[16]的方法，接種30～40 d 后，參考MOHAMED 等[20]的病情調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計發(fā)病情況并拍照。

1.2.8 Foc4carS 為靶標(biāo)基因的CRISPR/Cas9 基因編輯載體設(shè)計及構(gòu)建 參照SHI 等[14]和王艷瑋等[16]的方法，以水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）的基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph（Addgene No.121092），設(shè)計并構(gòu)建以Foc4carS 為靶標(biāo)基因的CRISPR/Cas9 基因編輯載體。

首先通過在線gRNA 序列設(shè)計網(wǎng)站（http：//grna.ctegd.uga.edu/和http：//crispor.tefor.net/），確定gRNA 的序列（Foc4carS-gRNA591：TATCGCCACTTATCGCCTGGCGG）。構(gòu)建5SrRNA-Foc4carSsgRNA591序列：首先人工合成263 nt 的Ff5SrRNAfcc1-sgRNA 基因序列[14]，以此為DNA 模板進行2 輪PCR 構(gòu)建5SrRNA-Foc4carS-sgRNA591。第一輪PCR 分別用引物5SrRNA-U-F-EcoRI/carSsgRNA591-R 、carS-sgRNA591-F/5SrRNA-U-REcoRI擴增5SrRNA-Foc4CarS-sgRNA591 的上、下兩端序列；第二輪PCR 用引物5SrRNA-U-FEcoRI/5SrRNA-U-R-EcoRI 進行融合PCR 擴增，得到5SrRNA-Foc4carS-sgRNA591 序列。

其次，將5SrRNA-Foc4carS-sgRNA591 同源重組導(dǎo)入編輯載體。pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph 載體質(zhì)粒DNA 用EcoR I 酶切后，按照ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit 說明書，將5SrRNAFoc4carS-sgRNA591 序列導(dǎo)入載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph，獲得靶向Foc4carS 的pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS 基因編輯載體，該載體采用體內(nèi)表達的Cas9 和sgRNA 質(zhì)粒進行基因編輯。

最后，利用pYF11 載體構(gòu)建同源重組修復(fù)（homology directed repair， HDR）的HDR 供體質(zhì)粒pYF11-Foc4carS-HDR。第一步，采用2 輪PCR方法融合擴增Foc4carS-HDR 序列。第一輪PCR分別采用引物pYF11-carS-HDR-F1/carS-LB-R1、carS-RB-F2/pYF11-carS-HDR-R2 擴增Foc4carS基因的上游1302 bp、下游1220 bp 同源序列；第二輪PCR 采用引物pYF11-carS-HDR-F1/pYF11-carS-HDR-R2 進行overlap PCR 擴增上、下兩段序列成為Foc4carS-HDR 序列。第二步，F(xiàn)oc4carSHDR序列導(dǎo)入pYF11 構(gòu)建成pYF11-Foc4carSHDR載體作為基因編輯的HDR 模板。將pYF11載體DNA 經(jīng)Xho Ⅰ線性化，F(xiàn)oc4carS-HDR 序列和pYF11-XhoⅠ線性DNA 混合共轉(zhuǎn)化XK1-25 酵母細胞，參照酵母轉(zhuǎn)化試劑盒（Alkali-CationTMYeast Transformation Ki， t#112200200）說明書進行轉(zhuǎn)化，以構(gòu)建重組供體質(zhì)粒pYF11-Foc4carSHDR，從陽性酵母XK1-25 轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)移到大腸桿菌DH5α 菌株中擴繁，PCR檢測大腸桿菌DH5α 中的重組質(zhì)粒后測序再次驗證，然后提取pYF11-Foc4carS-HDR 質(zhì)粒備用。

1.2.9 香蕉枯萎菌Foc4 的CRISPR/Cas9 基因編輯分別取5 μg pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4CarS、供體質(zhì)粒pYF11-Foc4carS-HDR 混入200 μL1×107 個/mL 的Foc4 原生質(zhì)體，輕輕混勻后冰浴30 min，采用含有100 μg/mL 潮霉素HYG 抗性的RM 再生培養(yǎng)基進行抗性篩選，其他步驟與1.2.3的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法一致。利用carS-outside-1F/carS-outside-2609R 、carS-inside-1F/carS-inside-785R、PgpdA-2648F/Cas9-424R、pRS-marker/gRNAR等4 對引物對編輯轉(zhuǎn)化子進行PCR 驗證，基因編輯后的陽性轉(zhuǎn)化子篩選方法與基因敲除陽性轉(zhuǎn)化子篩選方法一致，差別在于基因敲除突變體carS 基因位點被抗性基因HYG 取代，而基因編輯后的突變體中carS 基因沒有被抗性基因取代位點，而是被重組刪除。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用WPS Office 和SPSS 22.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并作圖，采用單因素方差分析中的Duncan’s 檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Foc4carS 的基因組特性以及進化分析

在Foc4 基因組中通過同源比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oc4carS基因（FOIG_05085）的CDS 全長為1776 nt，包含2 個內(nèi)含子，編碼592 個氨基酸。在Foc4carS 基因上游1295 nt 處存在長度為1296 nt 的lncRNAFoc4carP，其基因組排列與水稻惡苗病菌（F.fujikuroi）中的一致，說明在Foc4 中，F(xiàn)oc4carS也可能受到上游Foc4carP 的負(fù)調(diào)控（圖1A）。Foc4中car 基因的排列與前期尖孢鐮刀菌番茄轉(zhuǎn)化型（Fol）和尖孢鐮刀菌棉花專化型（Fov）上的報道一致，F(xiàn)oc4carX/Foc4carRA/Foc4carB/Foc4carO一起排列在Foc4 的基因組上（圖1A）。香蕉枯萎菌Foc4carS 與水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）、禾谷鐮刀菌（F. graminearum）等含有相同的蛋白功能域，除了含有典型的RING-finger 蛋白結(jié)構(gòu)域外，還含有N 端依賴ATP 的LON 蛋白酶結(jié)構(gòu)域[ATP-dependent protease Lon （La） protease]（圖1B）。系統(tǒng)發(fā)育進化樹結(jié)果顯示：香蕉枯萎菌Foc4carS 蛋白與尖孢鐮刀菌不同?；偷耐葱宰罡撸蹫橐淮?，而與大麗輪枝孢（Verticilliumdahliae）、希金斯刺盤孢（Colletotrichum higginsianum）、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）等病原真菌的carS 蛋白親緣關(guān)系較遠，說明香蕉枯萎菌的Foc4carS 蛋白與其他尖孢鐮刀菌專化型的carS蛋白具有相近的親緣關(guān)系（圖1C）。

2.2 Foc4carS 基因敲除和回補突變體的驗證

以Foc4 基因組DNA 為模板，分別用引物carS-U-F/carS-NEO-U-R 和carS-NEO-D-F/carS-DR擴增出上游、下游片段，獲得上游片段1595 bp，下游片段1582 bp。利用融合PCR 構(gòu)建出敲除片段，以上游片段和新霉素全長基因為模板，用引物carS-N-F/NEO-R1 擴增出上游與新霉素融合片段，大小為2010 bp；以下游片段和新霉素全長基因為模板，用引物NEO-F1/carS-N-R 擴增出下游與新霉素融合片段，大小為2196 bp。

通過PEG 介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化Foc4 并獲得具有新霉素NEO 抗性的ΔFoc4carS 候選轉(zhuǎn)化子，利用carS-outside-1F/carS-outside-2609R、carS-inside-1F/carS-inside-785R、NEO-F/NEO-R 等3 對引物對轉(zhuǎn)化子進行PCR 驗證，得到6 個陽性突變體。其中Outside 引物（carS-outside-1F/carS-outside-2609R）從ΔFoc4carS 敲除突變體中擴增出1915 bp，而野生型Foc4 擴增片段大小為2609 bp；Inside引物（carS-inside-1F/carS-inside-785R）從Foc4 中擴增出785 bp 特異條帶，而ΔFoc4carS 敲除體未能擴增出特異條帶；抗性基因新霉素NEO 的PCR擴增結(jié)果顯示，野生株Foc4 中未能擴增出1370 bp條帶，而在ΔFoc4carS 敲除突變體中均能擴增到1370 bp 條帶，此PCR 檢測結(jié)果表明Foc4carS 基因成功被新霉素基因替換（圖2A）。

構(gòu)建的回補載體pYF11-Hph-Foc4carS 通過PEG 介導(dǎo)轉(zhuǎn)化敲除突變體（ΔFoc4carS-8）原生質(zhì)體， 經(jīng)基因內(nèi)部特異引物carS-inside-1F/carSinside-785R、pYF11-Hph 骨架上的抗性基因潮霉素Hph 引物HYG-probe-1F/HYG-probe-598R、綠色熒光蛋白GFP 基因引物pCT74-sGFP-123F/pCT74-sGFP-468R 等3 對引物驗證，得到回補突變體ΔFoc4carS-Com（圖2B）。

2.3 ΔFoc4carS 突變體的生物學(xué)表型分析

在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，ΔFoc4carS 敲除突變體出現(xiàn)橙色菌落，野生型Foc4 和回補突變體ΔFoc4carS-Com 均為白色菌落，菌落顏色差異明顯。PDB 液體搖培7 d 后，ΔFoc4carS 敲除突變體中也出現(xiàn)深橙色搖培菌液，而Foc4 和回補突變體ΔFoc4carS-Com 則為白色菌液（圖3A）；對敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carSCom和野生型Foc4 菌株的菌絲頂端形態(tài)以及分生孢子形態(tài)進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)Foc4carS 基因缺失對香蕉枯萎病菌的菌絲頂端形態(tài)（圖3B）和分生孢子形態(tài)（圖3C）均無明顯影響；同時，敲除突變體ΔFoc4carS 的菌落直徑和產(chǎn)孢量與野生菌株Foc4 相比均無顯著差異（圖3D，圖3E）。ΔFoc4carS 中類胡蘿卜素過量表達出現(xiàn)深橙色表型，說明carS 基因有作為香蕉枯萎菌內(nèi)源報告的特征和潛力。

2.4 香蕉枯萎菌Foc4中car基因在不同光照處理下的表達分析

為了揭示Foc4 中類胡蘿卜素的合成分別受到光誘導(dǎo)的正調(diào)控和carS 的負(fù)調(diào)控機制，本研究對Foc4 和ΔFoc4carS 的表型與主要car 基因（carRA 和carB）的mRNA 表達進行了qRT-PCR關(guān)聯(lián)分析。Foc4 和ΔFoc4carS 突變體分別接種于PDA 培養(yǎng)基上，在光照、黑暗以及光暗交替培養(yǎng)3 種條件下，培養(yǎng)5 d 后觀察平板菌落表型，同時對carS、carRA 和carB 基因的表達情況進行評估（圖4）。結(jié)果顯示，野生型Foc4 在光照條件下出現(xiàn)淡橙色，而暗培養(yǎng)和光暗交替培養(yǎng)的平板顏色差異不大；ΔFoc4carS 突變體在光照條件下出現(xiàn)深橙色菌落顏色，光暗交替條件下為橙色，而暗培養(yǎng)條件下的菌落顏色為淡粉色，顏色依次變淡（圖4A）；而Foc4 中的carS 基因光照后誘導(dǎo)上調(diào)表達（圖4B）。與此對應(yīng)的是Foc4carRA、Foc4carB 基因表達量也是依照光、光暗、暗培養(yǎng)順序依次下調(diào)表達（圖4C），說明菌落顏色深淺與car 基因的表達水平一致。因此，F(xiàn)oc4 中類胡蘿卜素的生物合成受到雙重調(diào)控，光照正調(diào)控表達和carS 的負(fù)調(diào)控表達。

2.5 ΔFoc4carS 致病力測定

為明確Foc4carS基因?qū)ο憬犊菸【虏×Φ挠绊懀?采用盆栽傷根灌淋法對敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carS-Com 和野生菌株Foc4 進行了活體致病力測定。結(jié)果顯示，空白對照清水組的巴西蕉苗生長旺盛，株高顯著高于Foc4、敲除突變體ΔFoc4carS 以及回補突變體ΔFoc4carS-Com。而敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carS-Com 處理的巴西蕉苗發(fā)病情況與野生菌株Foc4 處理的巴西蕉類似，植株下層葉陸續(xù)出現(xiàn)黃葉，植株矮化，嚴(yán)重發(fā)病植株出現(xiàn)死株，切開球莖觀察，球莖出現(xiàn)典型的壞死斑，球莖褐化明顯（圖5A）。統(tǒng)計其發(fā)病病級，結(jié)果顯示敲除突變體ΔFoc4carS、回補突變體ΔFoc4carS-Com 與野生株Foc4 的病情指數(shù)無顯著差異（圖5B）。結(jié)果表明，F(xiàn)oc4carS 基因的缺失對Foc4 的致病力并無影響，F(xiàn)oc4CarS 基因僅參與次生代謝產(chǎn)物類胡蘿卜素的生物合成，并不參與調(diào)控病原菌的致病力。

2.6 Foc4carS 為靶標(biāo)評估CRISPR/Cas9 基因編輯的可行性

構(gòu)建靶向Foc4carS 的CRISPR/Cas9 基因編輯載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS （ 圖6A），采用同源重組修復(fù)（HDR）的方式進行后續(xù)的基因敲除。將編輯載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS 質(zhì)粒與pYF11-Foc4carS-HDR 供體質(zhì)粒混合后共轉(zhuǎn)化香蕉枯萎病菌Foc4 的原生質(zhì)體（圖6B），經(jīng)過潮霉素抗性篩選和再生培養(yǎng)獲得ΔFoc4carS （HDR）基因編輯轉(zhuǎn)化子，在PDA 平板上出現(xiàn)典型的深橙色菌落表型，與野生型Foc4的白色菌落對比明顯，肉眼可辨別（圖6C）。通過4 對引物對基因編輯敲除轉(zhuǎn)化子進行PCR 檢測，結(jié)果顯示：Outside 引物可以從野生菌株Foc4中擴增到2609 bp 條帶，而ΔFoc4carS （HDR）中擴增得到545 bp；Inside 引物只能從Foc4 中擴增到785 bp，而ΔFoc4carS （HDR）無擴增條帶。此外，Cas9 基因和sgRNA 只能分別從ΔFoc4carS （HDR）中擴增獲得1310 bp 和506 bp（圖6D）。結(jié)果表明，ΔFoc4carS （HDR）基因編輯轉(zhuǎn)化子中的pUCfFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4carS 基因編輯載體成功插入基因組中，通過基因編輯方法成功將靶標(biāo)基因Foc4carS敲除。

3 討論

香蕉枯萎病菌Foc4 中類胡蘿卜素的生物合成受到光和Foc4carS 的共同調(diào)控。Foc4 中類胡蘿卜素的生物合成受到Foc4carS 的負(fù)調(diào)控表達。野生型Foc4 菌落顏色是白色，而ΔFoc4carS 突變體出現(xiàn)了橙色菌落，2 個主要的car 結(jié)構(gòu)基因Foc4carRA 和Foc4carB 無論是何種培養(yǎng)條件下，在Foc4carS 突變體中的表達水平均高于野生型Foc4，因此，F(xiàn)oc4carS 突變體是類胡蘿卜素過表達突變體，與前期的鐮刀菌屬Fusarium 的研究[5， 9]結(jié)果一致，說明Foc4carS 負(fù)調(diào)控car 結(jié)構(gòu)基因參與Foc4 類胡蘿卜素的生物合成。

Foc4carS 以及car 結(jié)構(gòu)基因均受到光誘導(dǎo)上調(diào)表達。本研究中發(fā)現(xiàn)，基因Foc4carS 以及Foc4carS 負(fù)調(diào)控的car 結(jié)構(gòu)基因Foc4carRA 和Foc4carB 均受到光照誘導(dǎo)上調(diào)表達，且野生型Foc4 中Foc4carRA 和Foc4carB 的表達量明顯小于ΔFoc4carS 突變體，推測可能是野生型Foc4 含有的Foc4carS 基因受光照誘導(dǎo)上調(diào)表達后抑制調(diào)控的car 結(jié)構(gòu)基因的表達，這說明了野生型Foc4中car 結(jié)構(gòu)基因表達量為什么低于ΔFoc4carS 突變體， 也部分解釋了野生型Foc4 光照條件下Foc4carS 上調(diào)表達而菌落依然可以過量表達類胡蘿卜素而出現(xiàn)淡粉色的問題。前期研究表明，ΔcarS 突變體是不依賴光誘導(dǎo)形成類胡蘿卜素，表型深橙色色素，積累大量的鏈孢霉黃素NX 和類胡蘿卜素前體物質(zhì)[6-7]。本研究中的ΔFoc4carS突變體光照培養(yǎng)后， 比暗培養(yǎng)和光/暗培養(yǎng)的ΔFoc4carS 突變體的菌落顏色更濃且呈深橙色，而結(jié)構(gòu)基因carRA、carB 的上調(diào)表達幅度也比暗培養(yǎng)和光/暗交替培養(yǎng)的更大，說明ΔFoc4carS 突變體光照后car 基因上調(diào)表達，積累更多的鏈孢霉黃素從而使菌落顏色更深。因此，ΔFoc4carS突變體的類胡蘿卜素生物合成也受到光誘導(dǎo)表達調(diào)控。

在水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）的研究表明carS 作為胡蘿卜素生物形成的負(fù)調(diào)控因子，其調(diào)控作用本身也受到野生型菌株自身的調(diào)控，保證適當(dāng)量的鏈孢霉黃素NX 產(chǎn)生并受到光誘導(dǎo)調(diào)控[21]。本研究中，無論什么培養(yǎng)條件下，F(xiàn)oc4中均保持一定基礎(chǔ)水平的類胡蘿卜素含量，即使野生型Foc4 在暗培養(yǎng)條件下，F(xiàn)oc4carRA 和Foc4carB結(jié)構(gòu)基因仍然能夠保持一定的表達量，使得Foc4維持一定水平的類胡蘿卜素含量，保證一定的鏈孢霉黃素NX 和類胡蘿卜素前體物質(zhì)，與前期的研究結(jié)果一致。

本研究鑒定的Foc4carS 基因符合作為香蕉枯萎菌的內(nèi)源報告基因：（1）Foc4carS 基因為單一拷貝基因；（2）突變體表型容易分辨，ΔFoc4carS突變株菌落顏色呈深橙色，與野生株的白色菌落差異明顯；（3）Foc4carS 參與調(diào)控的表達產(chǎn)物能夠定量測定，F(xiàn)oc4carS 參與類胡蘿卜素的生物合成，含量可以量化測定；（4）Foc4carS 僅影響Foc4的次生代謝產(chǎn)物，對其致病力、菌落形態(tài)、分生孢子形態(tài)及產(chǎn)量等表型無影響。CRISPR/Cas9 基因編輯可以對基因組不同功能基因定向編輯，通過剪除DNA 片段來敲除某基因的功能，或通過向基因組中插入新的片段引入新的功能，是研究基因功能的重要技術(shù)手段之一[22]。Foc4 構(gòu)建的質(zhì)粒型基因編輯方法實用性高、成本低、操作更加方便。前期報道稻瘟菌中穩(wěn)定表達攜帶Cas9 的質(zhì)粒會嚴(yán)重影響稻瘟菌的轉(zhuǎn)化效率，可能Cas9 蛋白對稻瘟菌有毒性作用[23]。Foc4 的試驗結(jié)果與稻瘟菌的結(jié)果不一致，Cas9 單獨轉(zhuǎn)化攜帶Cas9 的空載體pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph 到Foc4 后并不影響其致病力。前期曲霉（Aspergillus oryzae）中的研究表明，供體質(zhì)粒（donor plasmid）環(huán)狀質(zhì)粒HDR 模板介導(dǎo)的重組效率高于線性DNA 片段[24]。

本研究在構(gòu)建基因編輯的carS-HDR 模板時，將Foc4carS 基因上、下游大約1.2 kb 的同源臂DNA片段進行融合PCR，導(dǎo)入pUC19 載體后，多次試驗仍然無法獲取轉(zhuǎn)化子，因此，將該融合片段導(dǎo)入pYF11 酵母載體，獲得pYF11-Foc4carS- HDR質(zhì)粒作為供體質(zhì)粒用于CRISPR/Cas9 基因編輯。綜上，F(xiàn)oc4carS 基因在次生代謝產(chǎn)物類胡蘿卜素的生物合成中發(fā)揮重要作用，可作為香蕉枯萎菌的內(nèi)源報告基因。以Foc4carS 為靶標(biāo)基因建立香蕉枯萎菌Foc4 的質(zhì)粒型CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，為病原菌的功能基因組學(xué)提供有力的技術(shù)支撐。