酸性代謝環(huán)境對心肌細(xì)胞分化影響的研究進(jìn)展

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（82270255）

通信作者：穆軍升，E-mail：wesleymu@hotmail.com

【摘要】以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的心肌再生是治療心肌梗死的前沿課題，控制干細(xì)胞的代謝微環(huán)境能影響干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，在臨床應(yīng)用中有著廣闊前景。pH值是心肌細(xì)胞發(fā)育過程中代謝環(huán)境的重要指標(biāo)。乳酸作為主要的酸性代謝產(chǎn)物之一，是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞早期發(fā)育階段酸性代謝環(huán)境的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)就pH值在心肌細(xì)胞生存與分化過程中的影響及相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展做一綜述。

【關(guān)鍵詞】pH值；乳酸；干細(xì)胞；心臟分化；酸性代謝環(huán)境

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.06.013

Influence of Acidic Metabolic Environment on Differentiation of Cardiomyocytes

MAO Jiahao1，ZHOU Fan2，MU Junsheng1，3

（1.Department of Cardiac Surgery，Beijing Anzhen Hospital，Capital Medical University，Beijing Institute of Heart Lung and Blood Vessel Diseases，Beijing 100029，China；2.Department of Ultrasound，The Third Medical Center of

The General Hospital of The People’s Liberation Army，Beijing 100039，China；

3.Department of Cardiac Surgery，The Third Affilited Hospital of Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，Henan，China

）

【Abstract】Stem cell-based myocardial regeneration is a frontier topic in the treatment of myocardial infarction.Manipulating the metabolic microenvironment of stem cells can influence their differentiation into cardiomyocytes，which have promising clinical applications.pH is an important indicator of the metabolic environment during cardiomyocyte development.And lactate，as one of the main acidic metabolites，is a major regulator of the acidic metabolic environment during early cardiomyocyte development.Here，we summarize the progress of research into the influence of pH value and lactate on cardiomyocyte survival and differentiation，as well as related mechanisms.

【Keywords】pH value；Lactic acid；Stem cell；Cardiac differentiation；Acidic metabolic environment

心肌梗死是一種常見的致命性心臟疾病，近三四十年，心肌梗死的發(fā)病率在低、中等收入國家中逐漸上升［1］。由于心肌細(xì)胞的再生能力差，大量心肌細(xì)胞壞死會導(dǎo)致心臟纖維化和心力衰竭［2］。目前對于心力衰竭的治療有藥物治療、心臟再同步化治療、左心室輔助裝置、心臟移植等。然而目前常用的藥物治療與輔助裝置治療并不能逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的壞死。在過去的幾十年里，心肌再生已成為治療心肌梗死和心力衰竭的前沿課題，主要包括體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞移植，心臟組織工程，刺激內(nèi)源性心肌細(xì)胞增殖和將非心肌細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞［2］。

心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在內(nèi)的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)，是用于治療的心肌細(xì)胞的潛在來源［3］。心肌再生治療中每個(gè)人所需的心肌細(xì)胞數(shù)大約為109個(gè)，因此以下的關(guān)鍵技術(shù)需重點(diǎn)考慮：擴(kuò)大表觀遺傳學(xué)穩(wěn)定的多能干細(xì)胞產(chǎn)量、有效且可重復(fù)的心肌細(xì)胞分化以及高度可靠的心肌細(xì)胞純化與成熟［4］。心臟原位組織工程則是使用重組病毒，干擾RNA或調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝環(huán)境等方法來刺激內(nèi)源性心肌細(xì)胞的增殖［2，5］。事實(shí)上，哺乳動物的心臟僅在新生兒時(shí)期有短暫的自我修復(fù)能力［6-7］，成年哺乳動物的心肌細(xì)胞更新率極低且梗死后不足以再生［8-9］，新生成的心肌細(xì)胞很可能來自現(xiàn)有的心肌細(xì)胞［9］。在妊娠早期，哺乳動物胚胎在缺氧環(huán)境中發(fā)育，早期心肌細(xì)胞的發(fā)育高度依賴糖酵解，乳酸成為調(diào)節(jié)代謝微環(huán)境中pH值的基礎(chǔ)。目前，有關(guān)心肌再生策略的一個(gè)新興趨勢是調(diào)節(jié)代謝微環(huán)境來誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，許多研究［10-11］證明代謝微環(huán)境對心肌細(xì)胞的分化過程有重要作用?，F(xiàn)綜述pH值與乳酸對心肌細(xì)胞生存以及分化的影響。

1" pH值與心肌細(xì)胞的生存

1.1" 心肌缺血損傷的發(fā)生機(jī)制及低pH值的保護(hù)作用

由于急性心肌梗死引起的炎癥，梗死區(qū)局部的pH值往往低于心臟組織的生理pH值［12-13］。缺血導(dǎo)致的組織缺氧使細(xì)胞無氧糖酵解產(chǎn)生乳酸，而再灌注則使心肌梗死區(qū)復(fù)氧并恢復(fù)生理pH值［13］。雖然酸中毒常被認(rèn)為不利于細(xì)胞生存，但近期研究［14-15］表明，酸中毒對心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等細(xì)胞缺血、缺氧的損傷有保護(hù)作用，然而，在較長的缺血過程之后的再灌注可能會引起細(xì)胞死亡，這種矛盾現(xiàn)象被稱為pH悖論。

缺氧、缺血的組織經(jīng)歷再灌注后會發(fā)生氧化應(yīng)激，并伴隨氧自由基種類、細(xì)胞質(zhì)Ca2+的增加和還原型谷胱甘肽的減少［16］。當(dāng)細(xì)胞病理性地負(fù)載高水平Ca2+時(shí)，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜通透性會發(fā)生非特異性增加［16-17］，導(dǎo)致線粒體腫脹并解偶聯(lián)，這一過程被稱為線粒體通透性轉(zhuǎn)變，從而形成線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）。具有MPTP的線粒體難以產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）去修復(fù)缺血再灌注期間激活的鈣離子依賴性蛋白酶、核酸酶和磷脂酶造成的損傷，腫脹的線粒體還能水解糖酵解產(chǎn)生的ATP以及剩余有功能的線粒體［17］。雖然細(xì)胞內(nèi)的低pH值本身有害，但能保護(hù)細(xì)胞免受缺血再灌注過程中發(fā)生的不可逆細(xì)胞損傷［16］，這種保護(hù)作用是通過抑制MPTP的形成而產(chǎn)生的［12，16-17］。Cohen等［12］對局部缺血30 min的離體兔心臟進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在離體心臟心肌梗死后直接再灌注恢復(fù)pH值的同時(shí)也促進(jìn)了MPTP的產(chǎn)生；而相較于直接再灌注，再灌注前2 min使用酸性灌注液將顯著減少心肌梗死面積。這提示了在對心肌梗死的再灌注治療前維持短暫酸中毒對心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。

1.2" 酸中毒與心肌細(xì)胞移植

體外培養(yǎng)的心臟組織的開發(fā)與設(shè)計(jì)必須考慮心肌缺血的特定環(huán)境，否則體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞很可能在植入體內(nèi)時(shí)壞死［5］。直接將干細(xì)胞注射到心肌梗死區(qū)會導(dǎo)致低細(xì)胞保留率，不利于長期移植［18-19］。Li等［20］開發(fā)設(shè)計(jì)了一種對pH值與溫度均敏感的水凝膠作為心肌細(xì)胞的輸送載體，能在梗死區(qū)pH值環(huán)境下凝固并保證細(xì)胞的保留率?？偟膩碚f，心肌梗死所致的低pH值對梗死區(qū)的心肌細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，同時(shí)對體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞的移植有指導(dǎo)意義。

2" pH值與心肌細(xì)胞的分化

2.1" 細(xì)胞內(nèi)pH值與心肌細(xì)胞的分化

當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)的pH值降低時(shí)，主要有兩種離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被激活，分別是Na+-H+交換體（Na+-H+ exchanger，NHE）和Na+-HCO-3協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［21］。NHE是一種普遍存在的質(zhì)膜糖蛋白，通過排出一個(gè)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)子交換一個(gè)細(xì)胞外的Na+，達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值的目的［22］。NHE有9種亞型，NHE1是心臟組織中唯一的質(zhì)膜亞型［23］。對每種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白清除細(xì)胞內(nèi)酸負(fù)荷的貢獻(xiàn)評估表明，NHE1是減少心肌細(xì)胞內(nèi)酸負(fù)荷的主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［24］。此外，有研究［25］發(fā)現(xiàn)，Na+-HCO-3協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在pH值＞7時(shí)活性更強(qiáng)，當(dāng)心肌細(xì)胞內(nèi)pH值＜7時(shí)，NHE1蛋白對pH的調(diào)節(jié)更為關(guān)鍵，NHE1通過排出細(xì)胞內(nèi)過量的酸來改善細(xì)胞內(nèi)pH值。

研究［26］表明，在心臟發(fā)育過程中以及出生后的很短時(shí)間內(nèi)，NHE1蛋白的表達(dá)水平升高。當(dāng)出生后細(xì)胞分化減少時(shí)，NHE1的活性也隨之下降［26-27］。Li等［22］首次研究了NHE1在胚胎干細(xì)胞分化中的影響，通過處理CGR8細(xì)胞（即小鼠胚胎干細(xì)胞）形成胚狀體和心肌細(xì)胞，使用NHE1特異性抑制劑EMD887580處理的第8～12天，存在跳動的胚狀體的百分比相較于對照組顯著下降，α-肌球蛋白重鏈蛋白表達(dá)顯著降低。更為重要的是，在使用NHE1特異性抑制劑處理的第12天，心肌分化的標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄因子NKX2.5和Tbx5顯著下降［28］。此外，Li等［22］還使用含有NHE1的腺病毒感染CGR8細(xì)胞使其具有額外的NHE活性，含有NHE1的腺病毒感染增加了存在跳動的胚狀體的百分比，提高了心肌細(xì)胞分化的幾種標(biāo)志物的水平。

值得注意的是，NHE1特異性抑制劑EMD887580在抑制NHE1活性與心肌分化過程之外并未影響NHE1的表達(dá)水平，這表明NHE1表達(dá)水平的變化可能獨(dú)立于心肌分化過程，NHE1并不是心肌細(xì)胞分化的伴隨產(chǎn)物［22］，然而NHE1活性影響心肌細(xì)胞分化的相關(guān)觸發(fā)機(jī)制與信號通路有待進(jìn)一步研究。

2.2" 細(xì)胞外pH值與心肌細(xì)胞的分化

在多能干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的實(shí)際培養(yǎng)過程中，為了獲得一定的細(xì)胞產(chǎn)量，細(xì)胞培養(yǎng)通常在較高的細(xì)胞密度下進(jìn)行。然而高密度的細(xì)胞培養(yǎng)將不可避免地導(dǎo)致乳酸的積累。Liu等［29］的研究報(bào)道了人多能干細(xì)胞的高密度培養(yǎng)引起了培養(yǎng)基環(huán)境的低pH值，這樣的低pH值環(huán)境抑制葡萄糖的消耗，且導(dǎo)致細(xì)胞周期的阻滯。而向培養(yǎng)基補(bǔ)充碳酸氫鈉能抑制酸中毒并改善細(xì)胞存活，碳酸氫鈉處理能顯著提高心肌損傷標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白（cardiac troponin，cTn）和NKX2.5的表達(dá)，促進(jìn)多能干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。

3" 乳酸與心肌細(xì)胞的分化

3.1" 乳酸在心肌細(xì)胞早期發(fā)育過程中的作用

哺乳動物的心臟對能量的需求非常高，因其需要不斷收縮以維持身體各個(gè)器官的氧氣供應(yīng)。它能利用所有類型的底物來產(chǎn)生能量，包括葡萄糖、乳酸、酮體以及氨基酸［30］。在妊娠早期的缺氧環(huán)境中，胎盤產(chǎn)生大量的乳酸［31-33］，成為人類胚胎早期發(fā)育的重要底物［33-34］。

胎兒出生后，大量氧氣進(jìn)入心臟，使得心肌細(xì)胞的代謝環(huán)境發(fā)生改變，細(xì)胞糖酵解與乳酸水平下降，心肌細(xì)胞的線粒體氧化能力增強(qiáng)，脂肪酸β氧化成為心臟的主要能量來源［35］，心肌細(xì)胞伴隨著糖酵解到氧化磷酸化這一代謝轉(zhuǎn)變進(jìn)入終末階段的分化［36］。

3.2" 乳酸對心肌細(xì)胞分化的影響

Ordoo等［5］分別研究了乳酸對于小鼠新生心肌細(xì)胞以及人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的影響，通過評估表達(dá)增殖的標(biāo)志物Ki67以及表達(dá)細(xì)胞分裂的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子極光激酶B，發(fā)現(xiàn)乳酸能顯著增加Ki67+cTnT+和AurB+cTnT+的心肌細(xì)胞，提示乳酸的存在能增加心肌細(xì)胞周期活性，刺激心肌細(xì)胞的增殖活動。此外，乳酸對成纖維細(xì)胞的數(shù)量無影響，提示乳酸刺激細(xì)胞增殖的效應(yīng)是心肌細(xì)胞特有的；RNA測序與基因表達(dá)分析的結(jié)果表明，使用乳酸鹽培養(yǎng)的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出BMP10、LIN28和TCIM的表達(dá)上調(diào)與GRIK1或DGKK等的表達(dá)下調(diào)。BMP10是一種分泌蛋白，能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖并阻止心臟細(xì)胞成熟［37-38］，LIN28與干細(xì)胞的代謝以及多能性有關(guān)［10］，并調(diào)節(jié)早期心肌細(xì)胞的激活［39］，而TCIM與細(xì)胞的低分化狀態(tài)有關(guān)［40］。GRIK1被認(rèn)為能抑制細(xì)胞增殖［41］，而DGKK則與心肌細(xì)胞的肥大有關(guān)［42］。這些結(jié)果在基因表達(dá)的層面同樣提示了乳酸刺激心肌細(xì)胞增殖的作用。研究團(tuán)隊(duì)［43］為了闡明乳酸對心肌細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，使用人類基因數(shù)據(jù)庫GeneCards來與人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生上調(diào)或下調(diào)的基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)與這些基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)大多與缺氧信號通路有關(guān)，其中SP1、MEF2A、CREM已被證實(shí)參與低氧條件下的心臟保護(hù)或心肌細(xì)胞的增殖，這些結(jié)果提示乳酸可能與心肌細(xì)胞缺氧信號通路的激活有關(guān)，乳酸通過對心肌細(xì)胞在基因?qū)用娴恼{(diào)控，使得心肌細(xì)胞處于低分化階段以促進(jìn)其增殖活動。

Du等［43］報(bào)道了一種由五種小分子組成的化學(xué)混合物，能有效地使心肌細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂階段，并且誘導(dǎo)心肌細(xì)胞在進(jìn)入增殖之前去分化。值得注意的是，在這種化學(xué)混合物處理的新生大鼠心室肌細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)乳酸濃度提升到兩倍，并且直接提高了培養(yǎng)基的乳酸水平。通過對代謝基因變化的分析，心肌細(xì)胞的糖酵解水平上升，氧化磷酸化水平下降。Du等［43］的研究表明，乳酸能通過LacRS2介導(dǎo)丙酮酸脫氫酶α1（pyruvate dehydrogenase alpha 1，PDHA1）重組蛋白和肉堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶2（carnitine palmitoyltransferase 2，CPT2）重組蛋白這兩種線粒體蛋白的乳酸化從而產(chǎn)生抑制作用，這兩種關(guān)鍵酶分別催化丙酮酸生成乙酰輔酶A和長鏈脂肪酸的氧化，而上面所敘述的化學(xué)混合物恰好能增加PDHA1和CPT2的乳酸化。敲低LacRS2 siRNA或者β-丙氨酸抑制LacRS2，都能降低乳酸化的PDHA1水平和進(jìn)入細(xì)胞周期的心肌細(xì)胞的數(shù)量。以上結(jié)果表明，對于能促進(jìn)心肌細(xì)胞去分化和增殖的化學(xué)混合物，乳酸-LacRS2很有可能是其下游信號通路，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖，并使得細(xì)胞代謝由氧化磷酸化向糖酵解轉(zhuǎn)變。

Tohyama等［44］使用含豐富乳酸的無葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)多能干細(xì)胞的衍生物，發(fā)現(xiàn)只有心肌細(xì)胞存活，并獲得了純度為99%的心肌細(xì)胞，同時(shí)，經(jīng)過乳酸純化的心肌細(xì)胞顯示出增殖能力的增強(qiáng)?；虮磉_(dá)分析提示心肌細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA MYH6表達(dá)升高，非心臟基因（NANOG、MYOD、AFP和MAP2）的mRNA被完全消除，其他心肌細(xì)胞相關(guān)基因（ACTC1和NKX2.5）的mRNA顯著富集。

3.3" 乳酸與pH值的非一致性關(guān)系

值得注意的是，Tohyama等［44］經(jīng)過乳酸濃度的優(yōu)化后選擇了4 mmol/L作為最佳乳酸濃度，因?yàn)樵谠撊樗釢舛认露嗄芨杉?xì)胞在分化的第20～30天產(chǎn)生了最高的心肌細(xì)胞純度和產(chǎn)量，并且在細(xì)胞培養(yǎng)過程中產(chǎn)生了最低的細(xì)胞死亡數(shù)量。此外，外源性的乳酸補(bǔ)充可能導(dǎo)致培養(yǎng)基中細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的酸化。Tohyama等［44］研究了4 mmol/L的乳酸是否影響細(xì)胞內(nèi)外pH值，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1 h后，細(xì)胞外pH值穩(wěn)定在7.5，并且心肌細(xì)胞內(nèi)的pH值不受影響。這些結(jié)果表明，乳酸對多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的影響并不依賴pH值，而更有可能是乳酸本身產(chǎn)生的影響。

4" 問題與展望

心肌細(xì)胞內(nèi)pH值主要由NHE1調(diào)節(jié)，NHE1的活性增強(qiáng)對于促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制尚未闡明。對于心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)，抑制高密度培養(yǎng)引起的酸中毒能促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化，但相關(guān)機(jī)制仍有待探索。以胎兒心臟為例，心肌細(xì)胞早期發(fā)育的代謝環(huán)境富含乳酸，能促進(jìn)心肌細(xì)胞的去分化并增強(qiáng)其增殖能力；就體外培養(yǎng)而言，乳酸能有效增加干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的比例以及心肌細(xì)胞的產(chǎn)量，通過乳酸調(diào)控細(xì)胞代謝環(huán)境在實(shí)際臨床應(yīng)用中有著廣闊的治療前景。

5" 總結(jié)

針對心肌梗死的干細(xì)胞治療被認(rèn)為是有著廣闊前景的前沿課題。心肌梗死時(shí)的缺血區(qū)通常有著較低的pH值，缺血再灌注治療前維持短暫酸中毒通過抑制MPTP對心肌細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。同時(shí)，哺乳動物心肌細(xì)胞的早期發(fā)育環(huán)境是缺氧且富含乳酸的，酸性代謝環(huán)境對干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的影響有著顯著的研究意義。

無論是NHE1的活化降低心肌細(xì)胞內(nèi)酸負(fù)荷，還是在多能干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞體外培養(yǎng)環(huán)境中補(bǔ)充碳酸氫鈉抑制酸中毒，均促進(jìn)了心肌細(xì)胞的分化。這些結(jié)果表明，降低細(xì)胞內(nèi)酸負(fù)荷與抑制細(xì)胞外酸中毒均能改善心肌細(xì)胞的分化。乳酸作為心臟早期發(fā)育的主要能量底物，通過基因?qū)用娴恼{(diào)控使得心肌細(xì)胞去分化并增強(qiáng)其增殖能力，在心臟原位組織工程中有廣闊的治療前景，即通過乳酸刺激內(nèi)源性心肌細(xì)胞的增殖；在心肌細(xì)胞的體外培養(yǎng)中，乳酸能有效提高干細(xì)胞分化成為心肌細(xì)胞的比例及產(chǎn)量，在心肌細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)際應(yīng)用中有至關(guān)重要的意義。

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收稿日期：2023-10-29