黃芩苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的小鼠炎癥的保護(hù)作用

關(guān)鍵詞 黃芩苷； 脂多糖； 免疫調(diào)節(jié)； TGF?β/SMAD2； T 細(xì)胞分化

在畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中，由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)、畜禽養(yǎng)殖條件差引起的細(xì)菌入侵是炎癥性疾病產(chǎn)生的重要因素［1］，細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖和死亡過程中能夠產(chǎn)生大量?jī)?nèi)毒素—— 脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），LPS 可通過結(jié)合宿主細(xì)胞膜表面的Toll 樣受體TLR4 引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，從而影響畜禽生理健康，降低養(yǎng)殖效益［2］。Soria 等［3］研究表明，細(xì)菌在感染家畜家禽后能夠影響其生產(chǎn)性能，包括養(yǎng)殖效率低下、家禽輸卵管炎、腹膜炎、呼吸道相關(guān)疾病等一系列炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為血漿中IL?6、IL?2 及干擾素γ等炎癥細(xì)胞因子含量升高，從而造成機(jī)體免疫力和腸道消化與吸收功能降低。目前，細(xì)菌入侵帶來的畜禽炎癥性疾病在臨床上仍依靠抗生素作為常規(guī)防治手段，但抗生素濫用不僅影響動(dòng)物自身腸道微生物平衡，還會(huì)造成耐藥菌株的出現(xiàn)，藥物殘留同樣也威脅了人類的生命安全［4］。因此，如何綠色有效防治炎癥性疾病、提高生產(chǎn)性能，仍然是當(dāng)前養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題。

黃芩苷（baicalin，BCN）是從黃芩中提取的一種黃酮類有效活性成分。研究表明，黃芩苷具有抗炎、抑菌和免疫增強(qiáng)效果［5］，可通過抑制TNF/NF?κB/MAPK 等信號(hào)通路的激活，緩解動(dòng)物機(jī)體自身和細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［6］。在抑菌試驗(yàn)中，黃芩苷可以通過破壞革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁，導(dǎo)致蛋白質(zhì)外泄，從而發(fā)揮其抑菌和殺菌性能［7］，此外，黃芩苷還可以通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)和T 淋巴細(xì)胞亞群水平來增強(qiáng)機(jī)體免疫效果［8］。

TGF?β/SMAD2 信號(hào)通路調(diào)節(jié)許多細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡［9］。該通路與免疫調(diào)控和炎癥反應(yīng)緊密相關(guān)，研究表明，TGF?β/SMAD2 的激活能提升IL?17 和TNF?α 的比例，導(dǎo)致機(jī)體炎癥損傷，促使Treg/Th17 平衡軸向Th17 偏移造成免疫異常［10］。TGF?β 可以誘導(dǎo)CD4+ T 細(xì)胞分化為Treg 細(xì)胞亞型，并且與IL?6 的聯(lián)合作用下，誘導(dǎo)CD4+ T 細(xì)胞向Th17 細(xì)胞亞型分化，此外，TGF ?β 可以通過TGF?β 受體（transforming growth factor- β receptor，TβR）激活受體調(diào)節(jié)型SMAD2 并將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控靶基因維A 酸相關(guān)孤兒受體γ（RORγt）和Foxp3 的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［11］。當(dāng)前，關(guān)于黃芩苷調(diào)控TGF?β/SMAD2 信號(hào)通路和免疫平衡的報(bào)道較少。本研究采用體內(nèi)體外試驗(yàn)結(jié)合，探討黃芩苷通過免疫調(diào)節(jié)和TGF?β/SMAD2 緩解LPS 誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制，旨在為中獸藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），RPMI-1640 培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%EDTA 胰酶（Gibco，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司），黃芩苷（純度≥98%，上海源葉生物有限公司），DMSO（純度gt;99.5%，北京索萊寶科技有限公司），LPS（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司），一氧化氮含量檢測(cè)試劑盒（S0021S，碧云天生物技術(shù)有限公司），總RNA 提取試劑盒（R1200，北京索萊寶科技有限公司），cDNA 逆轉(zhuǎn)錄酶（RK20428，武漢愛博泰克生物有限公司），Genious 2X SYBR Green Fast qP?CR Mix（RK21204，武漢愛博泰克生物有限公司），F(xiàn)oxP3/Transcription Factor Staining Buffer Kit、CD3e、CD4、CD8a 抗體（美國(guó)BD 生物公司）。

細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-15AC，日本三洋電機(jī)有限公司），多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax iD3，美谷分子儀器有限公司），RT-qPCR 儀（CXT96，伯樂生命醫(yī)學(xué)（上海）產(chǎn)品有限公司），BD FACSAria? Fusion 細(xì)胞分選儀（美國(guó)BD 生物公司）。

1.2 細(xì)胞試驗(yàn)

1）RAW264.7 細(xì)胞活力的測(cè)定。將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640 完全培養(yǎng)基（89% RPMI-1640+10% 胎牛血清+1% 青霉素-鏈霉素）中，接種96 孔板，待細(xì)胞貼壁棄上清，使用DMSO 溶解黃芩苷［12］，并使用RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別稀釋至1.562 5、3.125、6.25、12.5、25、50 及100 μg/mL，同時(shí)將LPS 分別稀釋為質(zhì)量濃度0.125、0.25、0.5、1、2 及4 mg/mL，采用CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力。

2）RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力的測(cè)定。參考易首利等［13］的方法進(jìn)行。

3）RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放的測(cè)定。將RAW264.7 細(xì)胞接種6 孔板，設(shè)置分組并培養(yǎng)24 h 后取上清，3 000 r/min 離心10 min，按照試劑盒制造商提供的說明書檢測(cè)NO 含量。

4）細(xì)胞炎癥因子及TGF?β/SMAD2 信號(hào)通路相關(guān)mRNA 表達(dá)水平的測(cè)定。消化收集細(xì)胞，使用RNA 提取試劑盒進(jìn)行總RNA 提取，隨后使用Ab?conal 提供的試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。2-△△Ct法分析并計(jì)算目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量。所有引物由Primer 5 軟件設(shè)計(jì)并由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)。雄性BALB/c 小鼠55 只，體質(zhì)量為（20±2） g，6～8 周齡，購(gòu)自三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（鄂）2022-0012，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理經(jīng)長(zhǎng)江大學(xué)醫(yī)學(xué)部審核批準(zhǔn)（YJ202346）。在長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，環(huán)境條件為濕度（55±5）%、溫度（23±2） ℃，明暗周期為12 h//12 h，試驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼喂1 周。使用10%DMSO 溶液配制1 g/mL黃芩苷母液，并使用生理鹽水稀釋DMSO 終含量為1%。

將55 只小鼠隨機(jī)分為5 組［14］：組1（0.9%NaCl）、組2（BCN，0 mg/kg）、組3（BCN-L，50 mg/kg）、組4（BCN-M，100 mg/kg）及組5（BCN-H，200 mg/kg），每組11 只，每日采用灌胃方式飼喂200 μL 黃芩苷溶液，連續(xù)飼喂1 周后立即腹腔注射200 μL LPS 溶液建立急性炎癥模型，6 h 后稱體質(zhì)量并記錄。隨后頸椎脫位處死，采集脾臟組織，PBS 潤(rùn)洗并吸干水分，稱取小鼠脾臟質(zhì)量，計(jì)算脾臟臟器系數(shù)。

2）T 細(xì)胞分化的測(cè)定。剪切新鮮脾臟，置于孔徑200 μm 的濾網(wǎng)研磨，RPMI-1640 沖洗收集濾液，4 ℃、2 000 r/min 離心5 min，棄上清。加入500 μL紅細(xì)胞裂解液靜置2 min 后離心5 min，棄上清，1 mL RPMI-1640 完全培養(yǎng)基混勻重懸。使用孔徑48 μm 滅菌尼龍膜過濾，即得T 細(xì)胞原液。取少量T 細(xì)胞懸液使用RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋至1×106 個(gè)/mL。加入CD8a 抗體、CD4 抗體、CD3e 抗體（所有抗體使用PBS 按說明書提供比例稀釋），4 ℃避光孵育，30 min 后使用PBS 洗滌2 次并離心棄上清，加入300 μL PBS 重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

3）調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞Treg 細(xì)胞的測(cè)定。取T 細(xì)胞原液，加入CD4 抗體和CD25 抗體表面染色30 min；加入100 μL PBS 重懸，并立即加入轉(zhuǎn)錄因子固定破核劑500 μL，避光孵育50 min；收集細(xì)胞，加入10 μLFoxp3-APC 抗體再次孵育50 min，隨后加入300 μLPBS 重懸細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)。

4）輔助性T 細(xì)胞Th17 的測(cè)定。取T 細(xì)胞原液，每管加入刺激阻斷劑100 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中刺激培養(yǎng)6 h，加入100 μL PBS 重懸細(xì)胞，隨后加入10 μLCD4 抗體，避光孵育30 min，孵育結(jié)束棄上清；加入1 mL 固定破膜劑重懸細(xì)胞，孵育1 h 棄上清，使用1×Perm/Wash 重懸細(xì)胞。最后用IL-17A-APC（Th17）抗體進(jìn)行胞內(nèi)染色，定容至300 μL 混勻后上機(jī)。

5）相關(guān)mRNA 的表達(dá)水平檢測(cè)。利用總RNA提取試劑盒從小鼠脾臟中提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，儲(chǔ)存在?20 ℃?zhèn)溆谩T-qPCR檢測(cè)IL?1、TNF?α、IL?17、IL?22、TGF?β 及SMAD2 的mRNA 表達(dá)水平，引物見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

流式細(xì)胞術(shù)下機(jī)數(shù)據(jù)采用Flow Jo V10.0 軟件進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s檢驗(yàn)確定各組間的顯著性差異。使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行繪圖。各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean ± SD）表示，Plt;0.05 表示差異顯著，Plt;0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩苷和LPS 處理RAW264.7 細(xì)胞的安全濃度

黃芩苷和LPS 對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響如圖1 所示。由圖1 可見，在0～25 μg/mL 范圍內(nèi)，不同質(zhì)量濃度的黃芩苷對(duì)RAW264.7 細(xì)胞增殖無抑制作用，并且在一定程度上能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng)黃芩苷質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力明顯下降（Plt;0.05）。與0 mg/mL 相比，當(dāng)LPS 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降（Plt;0.05），存活率為54.55%。因此，選擇黃芩苷質(zhì)量濃度分別為3.125、6.25、12.5、25 μg/mL 以及1 mg/mL LPS 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 黃芩苷對(duì)LPS刺激RAW264.7 細(xì)胞的吞噬能力和NO釋放的影響

細(xì)胞吞噬試驗(yàn)結(jié)果如圖2A 所示，與組1 相比，組2 經(jīng)LPS 刺激后RAW264.7 細(xì)胞的吞噬能力顯著下降（Plt;0.05），與組2 相比，組3 黃芩苷細(xì)胞吞噬能力呈上升趨勢(shì)（Plt;0.05）；組4、組5 和組6 的差異顯著（Plt;0.05），LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放結(jié)果如圖2B 所示，與組1 相比，組2 的NO 釋放顯著增加（Plt;0.05），相較組2，組3 黃芩苷能顯著降低LPS 刺激的NO 釋放，并隨其劑量增加，NO 釋放顯著降低（Plt;0.05）。

2.3 黃芩苷對(duì)LPS 刺激細(xì)胞炎癥因子與TGF-β/SMAD2 信號(hào)通路相關(guān)mRNA表達(dá)水平的影響

RAW264.7 細(xì)胞相關(guān)基因的mRNA 表達(dá)水平見圖3。由圖3 可見，與組1 相比，組2 經(jīng)LPS 刺激后，RAW264.7 細(xì)胞iNOS、IL?1、IL?6 和IL?10 的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（Plt;0.05），而在組3補(bǔ)充黃芩苷后，上述細(xì)胞因子的mRNA 表達(dá)水平呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)（Plt;0.05），與組2 相比，組4、組5 和組6 的差異顯著（Plt;0.05），TGF?β和SMAD2的mRNA表達(dá)水平如圖3E-F所示，與組1相比，組2經(jīng)LPS刺激后，TGF?β和SMAD2的表達(dá)水平下降（Plt;0.05），與組2相比，組3并未提高TGF?β和SMAD2的mRNA表達(dá)水平（Pgt;0.05），但組5和組6 的TGF ?β 和SMAD2 的mRNA 表達(dá)差異顯著（Plt;0.05）。

2.4 脾臟指數(shù)

小鼠脾臟指數(shù)見圖4，與組1 相比，組2 的脾臟指數(shù)顯著上升（Plt;0.05），與組2 相比，組3 的脾臟系數(shù)明顯下降（Plt;0.05），組4 和組5 的脾臟指數(shù)差異顯著（Plt;0.05），但與組1 無明顯差異。

2.5 T細(xì)胞分化

小鼠脾臟T 細(xì)胞分化結(jié)果如圖5A-F 所示，與組1 相比，組2 促進(jìn)CD3+細(xì)胞比例增加，但差異不顯著；與組2 相比，組5 能顯著降低LPS 刺激下CD3 細(xì)胞的比例（Plt;0.05）。CD4 細(xì)胞增殖情況如圖5C 所示，與組1 相比，組3 和組4 均顯著促進(jìn)CD4 細(xì)胞增殖（Plt;0.05），組5 差異顯著（Plt;0.05）；CD8 細(xì)胞增殖情況如圖5D 所示，與組1 相比，組2 的CD8 細(xì)胞比例減少（Plt;0.05），與組2 相比，組5 能夠顯著促進(jìn)CD8 細(xì)胞增殖（Plt;0.05）；此外，CD4/CD8 如圖5E 所示，與組1 相比，組2 的CD4/CD8 升高（Plt;0.05），與組2 相比，組5 的CD4/CD8 存在下調(diào)趨勢(shì)，表明一定劑量的黃芩苷能夠在一定程度上恢復(fù)LPS 刺激的小鼠T 細(xì)胞分化。

2.6 免疫平衡

如圖6 所示，LPS 刺激后，組2 的Th17 細(xì)胞數(shù)量顯著上升，Treg 的分化顯著減少，TH17/Treg 平衡軸往Th17 方向分化（Plt;0.05），出現(xiàn)Th17/Treg 失衡。與組2 相比，組3 和組4 小鼠Th17 細(xì)胞的分化顯著下降（Plt;0.05），組5 存在顯著差異（Plt;0.05）；此外，不同劑量的黃芩苷對(duì)于Treg 細(xì)胞的分化與表達(dá)均具有促進(jìn)作用，其細(xì)胞比例明顯增多。表明黃芩苷對(duì)于LPS 導(dǎo)致的Th17/Treg 平衡軸的失衡具有恢復(fù)作用。

2.7 脾臟相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平

如圖7 所示，與組1 相比，經(jīng)LPS 刺激后，小鼠脾臟中IL?1、TNF?α、IL?17 及IL?22 的mRNA 表達(dá)水平顯著上調(diào)（Plt;0.05），與組2 相比，組3 黃芩苷灌胃小鼠的上述炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平均顯著下調(diào)（Plt;0.05），組4 和組5 的差異顯著（Plt;0.05）。

圖7E～F 展示了TGF?β 和SMAD2 基因的表達(dá)情況，與組1 相比，TGF?β 在LPS 刺激后表達(dá)水平呈下調(diào)趨勢(shì)，但無顯著性差異；與組2 相比，組3 顯著上調(diào)了TGF?β 的表達(dá)水平（Plt;0.05），組4 和組5 差異顯著（Plt;0.05）。與組1 相比，經(jīng)LPS 刺激后，SMAD2 表達(dá)水平顯著下調(diào)（Plt;0.05），與組2 相比，黃芩苷3 個(gè)劑量組均顯著上調(diào)了SMAD2 的mRNA表達(dá)（Plt;0.05），表明黃芩苷可以通過激活TGF?β/SMAD2 緩解LPS 引起的炎癥反應(yīng)。

3 討論

黃芩苷是中藥黃芩中最主要的活性成分之一，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在眾多黃酮類化合物中，黃芩苷含量最高可占生藥材的20.7%［15］。因其含量高、源藥材種植范圍廣，相較其他單一化合物，黃芩苷的提取工藝更簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本更低廉，在畜禽生產(chǎn)中應(yīng)用很多，如提高家禽產(chǎn)蛋性能，減少畜禽病害等［16-18］。此外，與槲皮素、大豆異黃酮等化合物在抑菌、抗炎和抗病毒方面相比，黃芩苷較低劑量（100 mg/kg）應(yīng)用在小鼠即可達(dá)到良好效果［19］。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對(duì)外界和內(nèi)部刺激時(shí)的必要生理過程，在正常情況下，輕微的炎癥反應(yīng)能夠刺激機(jī)體快速清除病原體，改善免疫失衡從而維持自身健康［20］。然而近年來，隨著抗生素濫用，在產(chǎn)生耐藥細(xì)菌的同時(shí)造成動(dòng)物抵抗能力降低［21］，導(dǎo)致多數(shù)情況下炎癥往往不能自愈，且在不加干預(yù)的情況下逐步惡化，致使其他系列疾病出現(xiàn)［22］。研究指出，LPS 能通過Toll 樣受體募集MYD88 從而激活NF?κB 引起細(xì)胞炎性損傷和機(jī)體炎癥［23］。駱?biāo)紙@等［24］在RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞上使用LPS 刺激后發(fā)現(xiàn)其活性下降，并且激活ERK 信號(hào)通路。在本研究中，使用1 mg/mL 的LPS 同樣能夠降低RAW264.7 細(xì)胞的活力，降低細(xì)胞存活率。巨噬細(xì)胞可通過自身吞噬功能清除外來病原微生物，吞噬能力降低可能會(huì)引起病原微生物的免疫逃逸［25］，在本研究中，中性紅染色試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LPS 刺激后的RAW264.7 細(xì)胞吞噬能力下降，而在補(bǔ)充黃芩苷后吞噬能力呈劑量依賴式增長(zhǎng)，這可能與黃芩苷的特異性免疫增強(qiáng)作用相關(guān)［26］。

RAW264.7 等巨噬細(xì)胞在遭受外界刺激時(shí)能夠促進(jìn)NO 的釋放，而這一機(jī)制是由iNOS 激活引起的［27］。NO 含量的升高能夠?qū)е录?xì)胞缺氧，進(jìn)一步激活炎癥與細(xì)胞程序性死亡，從而釋放IL?1、IL?6及IL?10 等促炎細(xì)胞因子［28］，在本研究中，LPS 刺激后小鼠巨噬細(xì)胞NO 釋放含量顯著增加，在隨后的基因表達(dá)檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)iNOS、IL?1、IL?6 及IL?10 水平均顯著升高，這也進(jìn)一步佐證了細(xì)胞炎癥的形成。

研究表明，TGF?β/SMAD 信號(hào)通路在細(xì)胞早期發(fā)育、免疫監(jiān)督、組織修復(fù)及穩(wěn)態(tài)平衡的過程中發(fā)揮重要作用，Lan 等［29］使用血流阻斷法建立腎損傷小鼠模型后發(fā)現(xiàn)TGF?β 基因的mRNA 表達(dá)水平降低，而過表達(dá)TGF?β 后，小鼠腎損傷情況得到了改善，并且下游SAMD2/3 信號(hào)被激活，有效抑制了MAPK 和NF?κB 信號(hào)通路的激活，這一結(jié)果表明TGF?β/SMAD 能夠通過負(fù)向調(diào)控炎癥信號(hào)通路，從而改善組織損傷。在本研究中，LPS 刺激小鼠巨噬細(xì)胞后，TGF?β/SMAD 表達(dá)水平降低，而補(bǔ)充黃芩苷后，該情況得到了緩解，該結(jié)果也在后續(xù)的研究中得到驗(yàn)證，以上結(jié)果表明黃芩苷同樣可能通過激活TGF?β/SMAD 信號(hào)通路減輕LPS 誘導(dǎo)的小鼠炎癥。

T 細(xì)胞亞群紊亂可能與局部炎癥和免疫反應(yīng)激活有關(guān)［30］，CD4 分子屬于免疫球蛋白超家族，當(dāng)CD4+細(xì)胞大量分化，能進(jìn)一步促進(jìn)單核和巨噬細(xì)胞活化，從而吞噬入侵病原體。在本研究中，黃芩苷灌胃后小鼠CD4+細(xì)胞表達(dá)顯著上升，在本研究的細(xì)胞試驗(yàn)中黃芩苷同樣提升了小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力，提示CD4+細(xì)胞在抗炎效應(yīng)中發(fā)揮了一定的作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，LPS 刺激后，CD8+細(xì)胞表達(dá)顯著降低，這可能與BALB/c 小鼠的免疫系統(tǒng)遭到破壞相關(guān)。CD4+/CD8+比值的高低往往作為免疫激活或抑制的標(biāo)志物，在臨床上可用于識(shí)別為炎癥相關(guān)的慢性免疫疾病［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射LPS 能夠降低小鼠脾臟中CD4+/CD8+的比值，同樣，在Ron 等［32］的研究中發(fā)現(xiàn)，一些因病毒或其他微生物感染的患者表現(xiàn)出高CD4+/CD8+比值，而使用藥物干預(yù)的患者則降低了CD4+/CD8+比值。

Th17 細(xì)胞能夠促進(jìn)組織的炎癥反應(yīng)，而Treg 細(xì)胞則抑制自身免疫。IL?17 是許多自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的核心，同樣存在有效的宿主耐受與調(diào)節(jié)機(jī)制來控制自身反應(yīng)性Th17 細(xì)胞與IL?17 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［33］。IL?22 由不同種類的淋巴細(xì)胞表達(dá)，尤其是Th17 細(xì)胞、T 細(xì)胞及NK 細(xì)胞等［34］。有研究表明，IL?17 在保護(hù)性免疫與破壞性炎癥中具有雙重作用，而在炎癥性腸病患者中IL?22 的表達(dá)則顯著升高［35］。在本研究中，使用LPS 注射的小鼠出現(xiàn)Th17/Treg失衡、IL?17 及IL?22 高度表達(dá)，而這一情況在灌胃黃芩苷后得到了一定程度的緩解，表明黃芩苷可以逆轉(zhuǎn)小鼠體內(nèi)炎癥帶來的免疫失衡。

綜上所述，LPS 可刺激RAW264.7 細(xì)胞和小鼠產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)炎癥因子釋放導(dǎo)致免疫失衡，黃芩苷干預(yù)后能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)，該機(jī)制可能是通過降低相關(guān)炎癥因子mRNA 表達(dá)、提高免疫能力、恢復(fù)Th17/Treg 平衡及激活TGF?β/SMAD 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。