豬偽狂犬病病毒變異株傳代致弱JS18-150株的獲得與鑒定

關(guān)鍵詞 豬偽狂犬病病毒； 變異株； 傳代致弱； 基因缺失； 偽狂犬病疫苗

豬偽狂犬?。╬seudorabies， PR）是一種急性傳染病，以體溫升高、精神萎靡、食欲不振等為主要特征［1］。豬是該病毒的主要天然宿主、貯存者以及傳播者［2-4］。不同年齡段的豬均可感染，主要臨床癥狀為妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬死亡率高［5］。PR 是偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）引起，PRV 為線狀雙聯(lián)DNA，基因組大小約為145 kb［6］。在PRV 中共發(fā)現(xiàn)16 種膜蛋白，包括gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gM、gL 和gN 等。其中g(shù)E 基因是偽狂犬病病毒的主要毒力基因之一，能夠誘導細胞融合，加快病毒在細胞之間的傳遞過程。還能夠促進病毒在宿主中樞神經(jīng)中傳播，與gI 蛋白形成gE/gI 復合體，從而作為一個功能單位發(fā)揮作用［7］。gE/gI 蛋白復合體能與gC 蛋白共同介導病毒在細胞中的釋放［8］。

為了徹底凈化偽狂犬病，世界各國都開始進行偽狂犬病疫苗的研發(fā)。目前已研制出基因缺失疫苗、弱毒疫苗、重組偽狂犬病毒載體疫苗、亞單位疫苗［9］?；蛉笔б呙缫蚓哂蟹€(wěn)定、毒力不易返強、免疫原性強、保護時間長、區(qū)別免疫動物與自然感染動物等特點［10］，在臨床上應(yīng)用最多。其中最具有代表性的疫苗毒株有Bartha 株、Bucharest 株和TK200株［11-12］。雖然疫苗株研制方法不同，但其主要毒力基因gE 均有缺失，以此可更好地區(qū)分疫苗免疫豬和野毒感染豬。gE 基因缺失疫苗的廣泛應(yīng)用使該病得到有效控制和消滅成為可能。

20 世紀70 年代，偽狂犬病活疫苗Bartha-K61 株從匈牙利引入我國，用于豬偽狂犬病的防控，并得到很好的控制。但自2011 年以來，使用Bartha-K61 株疫苗免疫過的豬場再次暴發(fā)豬偽狂犬病，表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、死胎，仔豬高死亡率，通過分離毒株確認其與經(jīng)典毒株不同，說明偽狂犬病病毒在我國已發(fā)生變異［13］。隨后全國各地均報道分離到偽狂犬病病毒的新型野毒株，表明傳統(tǒng)疫苗株已不能產(chǎn)生足夠的保護力，需要研制出針對變異株的新型疫苗［14-18］。本研究以變異毒株JS18 株為基礎(chǔ)，經(jīng)雞胚成纖維細胞連續(xù)傳代獲得安全性良好、免疫原性高的JS18-150 株，研究JS18-150 株作為偽狂犬病病毒疫苗候選株的安全性和免疫效果，旨在為預防變異偽狂犬病的流行提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

豬偽狂犬病病毒JS 株由武漢科前生物股份有限公司在江西某豬場病料分離、鑒定、保管和供應(yīng)；雞胚成纖維細胞（chicken embryo fibroblasts， CEF），由SPF 雞胚制備而成，SPF 雞胚購自濟南賽斯；豬睪丸細胞（ST細胞）購自美國標準菌種收藏中心；DMEM、2×DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco；低熔點瓊脂糖購自bioshap；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）購自金源康；豬偽狂犬病病毒gB（PRV gB）抗體ELISA 檢測試劑盒購自BioCheck；豬偽狂犬病病毒gE 抗體檢測試劑盒購自IDEXX；21 日齡偽狂犬病陰性仔豬購自湖北三湖畜牧有限公司。

1.2 試驗組設(shè)計

選取15 頭豬偽狂犬病陰性的21 日齡仔豬（gBELISA抗體和gE-ELISA 抗體均為陰性），隨機分為3組，隔離飼養(yǎng)。JS18株感染組試驗豬每頭頸部肌肉接種10 頭份JS18 株（106.0 TCID50/頭份）；PRV JS18-150 株免疫組試驗豬每頭頸部肌肉接種10 頭份JS18-150 株（106.0 TCID50/頭份）；另取偽狂犬病陰性豬5 頭不做任何處理作為空白對照組。

1.3 雞胚成纖維細胞的培養(yǎng)

選取9～10 日齡發(fā)育良好的SPF 雞胚，先用碘酒消毒蛋殼氣室部位，再用酒精棉球脫碘，同時在平皿中加入適量Hank’s 液，用鑷子在氣室中間破殼，去氣室蛋殼、氣室膜，從胎兒眼睛位置下鑷子，輕夾頸部挑出胎兒，快速放入平皿中。將雞胚去頭、四肢和內(nèi)臟，把胚體轉(zhuǎn)入燒杯中，以挑剪方式把胚體剪至小米粒大小后，轉(zhuǎn)移至適宜大小的錐形瓶中，Hank’s 液清洗3次。加入0.25% 胰酶后快速加蓋轉(zhuǎn)入37 ℃水浴鍋中消化，將胰酶輕輕倒出，清洗組織3 次，加入含10% 血清乳漢液，吹打組織、靜置、過濾，反復吹打7輪直至僅剩骨頭渣。懸液過濾后加入細胞瓶，貼壁過夜，得到雞胚成纖維細胞。

1.4 豬偽狂犬病病毒JS18株的傳代培養(yǎng)

取豬偽狂犬病病毒JS18 株0.1 mL 接種CEF 細胞中，置37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，當細胞病變達到90% 以上時，收獲上清液和細胞混合物得到JS18-2 株。按上述方法將豬偽狂犬病病毒JS18 株在CEF 細胞上連續(xù)傳代至100 代。從第100代連續(xù)5 代挑取單個蝕斑，繼續(xù)傳代至第150 代得JS18-150 株。注意觀察細胞病變出現(xiàn)的時間、病變率以及細胞病變的形態(tài)變化。

1.5 不同代次毒株的全基因組擴增與測序

以GenBank 中PRV 全基因組序列（KP257591.1）作為參考，設(shè)計并合成gD/US2 基因鑒定引物（表1）。分別提取豬偽狂犬病病毒JS18 株第1 代、第50 代、第100 代、第130 代和第150 代病毒基因組，利用特異性引物擴增目的基因，鑒定不同代次毒種序列的穩(wěn)定性。對特異性條帶進行膠回收，連接至pEASY-T1載體，構(gòu)建成功后送至上海生工測序。

1.6 體外生長曲線的繪制

取豬偽狂犬病病毒JS18 株和JS18-150 株分別以0.01 MOI 接種于單層CEF 細胞，分別在接種后12、24、36、48、60、72 h 取樣，測定各時間點的TCID50。

1.7 豬偽狂犬病病毒JS18-150 株對仔豬的安全性試驗

將JS18 株和JS18-150 株分別經(jīng)頸部肌肉接種偽狂犬病陰性豬各5 頭，1.0 mL/頭，病毒含量為1.0×107.0 TCID50/mL，另取偽狂犬病陰性豬5 頭作為空白對照組。連續(xù)觀察14 d，觀察疫苗接種豬精神、食欲以及臨床表現(xiàn)；與接種前相比，體溫是否有升高現(xiàn)象。接種后21 d 采血，分別使用gB-ELISA 和gE-ELISA 檢測偽狂犬病病毒gB 和gE 抗體。

1.8 豬偽狂犬病病毒JS18-150 株對仔豬免疫效力試驗

選取20 頭偽狂犬病陰性的21 日齡仔豬（gBELISA抗體和gE-ELISA 抗體均為陰性），隨機分4組，隔離飼養(yǎng)。A、C 組肌注1 頭份JS18-150 株（106.0 TCID50/頭份），B、D 組肌注1 mL DMEM。免疫后每7 d 進行1 次前腔靜脈采血（至攻毒后14 d），檢測gB-ELISA 抗體水平。免疫后28 d，連同對照組仔豬采血分離血清，檢測血清中的中和抗體。同時A、B 組使用PRV 野毒JS18 毒株滴鼻攻毒，攻毒劑量為107.0 TCID50/頭份；C、D 組使用PRV HBZL05 毒株滴鼻攻毒，攻毒劑量為107.0 TCID50/頭份。攻毒后觀察21 d，測量體溫，記錄癥狀，統(tǒng)計發(fā)病率和死亡率。對試驗豬進行解剖，觀察腦、扁桃體病變，并取樣進行組織病理學觀察。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)分析均采用GraphPad Prism8.0 軟件進行：使用t 檢驗進行兩組間差異評估，Pgt;0.05（ns）表示差異不顯著、Plt;0.05（*）表示差異顯著、Plt;0.01（**）表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CEF細胞中豬偽狂犬病病毒的分離培養(yǎng)結(jié)果

將豬偽狂犬病病毒JS 株接種到CEF 細胞，置37 ℃含5%CO2 的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。每日觀察細胞病變，待細胞病變達80% 收取細胞上清。將所得病毒株命名為豬偽狂犬病病毒JS18株（圖1）。

2.2 豬偽狂犬病病毒JS18-150 株在CEF 細胞中的增殖特性

分離得到的野毒株JS18 株在CEF 細胞上傳代至150 代，獲得高代次毒株JS18-150 株。JS18-150株在體外傳代適應(yīng)性明顯提升，表現(xiàn)為相同接種劑量下，JS18-150 株感染細胞后形成病變時間縮短，細胞病變面積增大，且單位面積內(nèi)噬斑數(shù)明顯多于JS18 株（圖2）。

2.3 PCR鑒定與序列測定結(jié)果

分別以豬偽狂犬病病毒JS18 株第1 代、第50 代、第100 代、第130 代和第150 代病毒基因組為模板，以gD/US2 引物進行擴增。PCR 結(jié)果第1 代和第50 代毒株擴增產(chǎn)物大小為5 837 bp，第100 代后擴增產(chǎn)物大小為2 629 bp。測序結(jié)果顯示第50 代與第1 代同源性為100%，ORF 大小均為5 837 bp。第100 代、第130 代和第150 代該毒株均缺失3 208 bp 堿基（從gI基因第269 位核苷酸至US9 基因，包括gI 部分基因、gE 全部基因和US9 全部基因）；同時gD 基因第906位堿基發(fā)生點突變。結(jié)果表明，gI/US2 基因缺失部位穩(wěn)定，未發(fā)生恢復。

2.4 不同代次毒株的滴度測定結(jié)果

將豬偽狂犬病病毒JS18 株和JS18-150 株分別以0.01 MOI 接種單層CEF 細胞，接毒后不同時間點收集，反復凍融3 次后，對各時間點收集的樣品進行毒價測定。結(jié)果顯示：在CEF 細胞上PRV JS18 株和JS18-150 株的生長趨勢基本相同，感染36 h 后，病毒滴度均達到頂峰，隨后緩慢下降（圖3）。在整個增殖過程中，相同接種時間JS18 株病毒滴度略低于JS18-150 株。

2.5 豬偽狂犬病病毒JS18-150 株對仔豬的安全性

將JS18 株和JS18-150 株接種仔豬后，JS18 株感染組5/5 仔豬出現(xiàn)精神不振、呼吸困難和食欲減退等臨床癥狀，同時仔豬全部死亡（圖4）。JS18-150 株和空白對照組所有仔豬均未觀察到任何臨床癥狀，且體溫正常，均未超過40.5 ℃。觀察期間PRV JS18 株感染組試驗豬gB 和gE 抗體均為陽性；PRV JS18-150 株免疫組試驗豬gB 抗體均為陽性，而gE 抗體均為陰性。

空白對照組gB 和gE 抗體均為陰性（表2～表3）。結(jié)果表明，JS18-150 株毒力顯著下降，對仔豬具有良好的安全性。

2.6 豬偽狂犬病病毒JS18-150 株對仔豬的免疫保護效果

A、C 組免疫接種后試驗豬精神、食欲正常，接種部位無異常；免疫后28 d 免疫組仔豬產(chǎn)生較高的gB抗體水平，PRV 中和抗體效價分別為（63.8±5.08）和（54.6±6.65）（圖5a、5b）。B、D 組攻毒后對照組出現(xiàn)體溫升高、精神沉郁、食欲廢絕等典型癥狀，并在觀察期間全部死亡；A、C 組使用2 種野生型PRV 毒株攻毒均未死亡，獲得100% 保護（表4）。

解剖結(jié)果發(fā)現(xiàn)，B、D 組仔豬攻毒后，豬只腦出血，扁桃體化膿、出血，而A、C 組豬只則無典型病變出現(xiàn)（圖6～圖7）。取各組的腦和扁桃體組織制備病理切片，可觀察到B、D 組腦組織腦膜、脈絡(luò)膜、腦實質(zhì)等血管周圍淋巴細胞浸潤，形成血管“袖套”；扁桃體淋巴細胞壞死，均質(zhì)紅染，吞噬細胞吞噬壞死細胞碎片，而A、C 組豬只則未觀察到典型病理變化（圖6～圖7）。以上結(jié)果說明JS18-150 株作為疫苗接種仔豬能夠產(chǎn)生良好的交叉保護。

3 討論

豬偽狂犬病是由豬皰疹病毒引起的以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎為主要特征的急性傳染病，該病嚴重制約養(yǎng)豬業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。目前針對該病的防控，國內(nèi)外均以疫苗免疫預防為主，結(jié)合配套的gE-ELI?SA 抗體檢測方法淘汰、凈化野毒感染豬，從而實現(xiàn)偽狂犬病的凈化。目前，臨床應(yīng)用的豬偽狂犬病疫苗可分為3 類：一是經(jīng)滅活加入佐劑制備的滅活疫苗；二是利用基因工程技術(shù)，使PRV 的相關(guān)毒力基因無法表達，毒力致弱同時又保持較高免疫原性而制備的基因缺失疫苗；三是將分離得到的野毒株經(jīng)異源細胞不斷傳代得到的自然傳代弱毒疫苗［19］。

目前已報道的偽狂犬病自然傳代弱毒疫苗有Bartha 株、布加勒斯特株和BUK 株等。其中匈牙利的Bartha 株是將PRV 強毒株在豬腎細胞、雞胚上反復傳代后獲得的疫苗株［20］。布加勒斯特株是用偽狂犬病病毒強毒株在雞胚尿囊液培養(yǎng)后，再用雞胚培養(yǎng)得到的疫苗株［21］。BUK 株是通過雞胚和雞胚成纖維細胞傳代獲得的疫苗株［21］。該類疫苗由于自然基因缺失、免疫原性優(yōu)良、生產(chǎn)工藝簡便易行等特點，在控制和凈化豬偽狂犬病的流行中起到重要作用。

本研究將野毒株JS18 株經(jīng)雞胚成纖維細胞連續(xù)傳代獲得JS18-150 株。病毒噬斑結(jié)果顯示，相比JS18 株，JS18-150 株在細胞形成的空斑明顯更大，表明JS18-150 株在雞胚成纖維細胞上適應(yīng)性提高。測序結(jié)果顯示，該毒株傳代至第100 代時缺失gI 基因第269 位至US9 全部核苷酸，且挑取的單克隆繼續(xù)傳代至150 代時，缺失部分穩(wěn)定，均未發(fā)生改變。一步生長曲線結(jié)果顯示JS18 株和JS18-150 株生長動力學相似，即JS18-150 株在傳代過程中雖發(fā)生缺失，但并不影響其增殖能力。安全性試驗結(jié)果顯示JS18 株免疫組5/5 仔豬出現(xiàn)精神不振、呼吸困難和食欲減退等臨床癥狀，同時4/5 仔豬死亡。而JS18-150 株免疫組所有仔豬均未觀察到任何臨床癥狀，且體溫正常，均未超過40.5 ℃。說明JS18-150 株毒力顯著下降，對仔豬有良好的安全性。中和抗體檢測結(jié)果顯示，免疫后28 d 免疫組PRV 中和抗體效價分別為（63.8±5.08）和（54.6±6.65），PRV-150 株免疫豬體后刺激機體產(chǎn)生顯著得抗體水平。攻毒保護試驗結(jié)果顯示，免疫組能100% 抵御JS18 株和HBZL05 株的攻擊，未出現(xiàn)任何臨床癥狀，而攻毒對照組出現(xiàn)典型臨床癥狀，且均5/5 死亡。說明JS18-150 株作為疫苗接種仔豬能夠產(chǎn)生良好的交叉保護。

研究表明，豬偽狂犬病病毒編碼的gE/gI 蛋白可抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，有利于自身復制，其中g(shù)E 蛋白通過降解CBP 從而阻礙其與IRF3 結(jié)合來抑制IFN-β 的產(chǎn)生，gI 蛋白通過抑制IRF3 的二聚化來抑制IFN-β 的產(chǎn)生［22］。2017 年Lamote 等［23］發(fā)現(xiàn)偽狂犬病病毒減毒活疫苗Bartha K61 株感染細胞后能顯著增強Ⅰ型干擾素應(yīng)答，并通過一系列試驗最終證明源于gE/gI 復合物的缺失，除此之外gE 的缺失也會增強pDC 中ERK1/2 磷酸化，來誘導更多Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，從而誘導抗病毒反應(yīng)的發(fā)生。以上研究為進一步研究豬偽狂犬病病毒JS18-150 株致弱原因提供了重要參考。