淹水脅迫下葡萄根際細菌群落結構變化

關鍵詞 葡萄； 根際細菌； 細菌群落； 淹水脅迫； 高通量測序

葡萄（Vitis L.）是世界上最重要的果樹之一，栽培歷史悠久［1］。改革開放以來，我國葡萄產業(yè)發(fā)展迅速，鮮食葡萄產量和栽培面積位于世界前列，滿足人們對美好生活向往的需求，助力鄉(xiāng)村振興和精準扶貧［2］。巨峰葡萄（Vitis labrusca × Vitis vinifera‘Kyoho’）原產日本，親本是大粒康拜爾和森田尼，是我國栽培面積最廣的葡萄品種［3］。巨峰葡萄具有適應性強、抗病耐寒、易管理等特點，其果實色澤艷麗、口感豐富、營養(yǎng)價值高，深受果農和消費者的喜愛。

我國地處亞洲東部，夏季高溫多雨，近幾年暴雨肆虐東亞，洪澇災害已經是農業(yè)生產上不可小視的災害之一。2021年我國多地遭遇罕見暴雨暴風，加上部分葡萄園區(qū)的排灌系統(tǒng)不良，造成了不可估量的經濟損失［4］。研究發(fā)現(xiàn)，在淹水脅迫下植物會通過自身的生長和生理特性來適應逆境，如新梢生長量降低、光合能力降低、有機物合成受阻等［5］。植物也會采用多種防御機制來降低淹水脅迫對自身造成的損傷，如誘發(fā)不定根、形成通氣組織、加強莖葉伸長生長以保障氣體交換、啟動抗氧化響應系統(tǒng)、誘導積累滲透調節(jié)物質、改變呼吸代謝途徑等，以適應水淹逆境［6］。

微生物根據(jù)形態(tài)和結構可分為細菌、放線菌、真菌、藻類和原生動物5 種。淹水脅迫導致土壤處于缺氧或無氧的環(huán)境中，影響了土壤中的微生物群落，使得細菌成為主要的優(yōu)勢種群［7］。除通過自身響應淹水脅迫外，植物根系能通過調節(jié)土壤細菌的組成來提高自身的抗逆性。比如在野燕麥發(fā)育過程中，土壤微生物對根系分泌物（如氨基酸）存在偏好性，某些代謝物有調節(jié)劑的功能，如水楊酸使植物產生抗性，從而抑制有害微生物［7］。植物與細菌相互作用的過程中，死亡或者脫落的植物組織能改善根際土壤的理化性質；根系的分泌物可為細菌的生長提供有利條件［8］。根際細菌的活動也能對植物造成較大的影響。植物生長促進型根際細菌（plant growth pro?moting rhizobacteria，PGPR）通過多種作用機制參與植物的抗逆性調控［9］，如在鹽堿脅迫下，根際細菌可通過調節(jié)根系的離子穩(wěn)態(tài)等過程改善植物抗逆性［10］。

許多細菌都具備參與調控植物耐澇性的可能，本研究以巨峰葡萄為試材，通過盆栽試驗法模擬淹水情況，運用16S rRNA 高通量測序分析淹水脅迫下巨峰葡萄根際細菌群落結構和組成的差異，探討巨峰葡萄根際細菌和耐澇性的關系，旨在為根際細菌在農業(yè)生產實踐中的應用和推廣提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以四川省樂山市夾江縣新生村葡小萄農場的4年生巨峰葡萄為供試材料。試驗地點位于四川省樂山市樂山師范學院（103°44′58″E，29°33′34″N）致遠樓附近的大棚內，海拔344.6 m。土壤類型為紫色沖積土，pH 6.0，有機質含量15.12 g/kg，速效氮含量125.38 g/kg，有效磷含量36.65 g/kg，速效鉀含量160.82 g/kg。

1.2 試驗設計

于2020 年12 月，收集巨峰葡萄生長健壯的1 年生枝條沙藏，2021 年3 月修剪成長約為15 cm 的插穗，僅保留1 個頂芽。將土壤平均分裝到各個24cm×22 cm 的塑料培養(yǎng)盆，把巨峰葡萄枝條扦插移栽到盆中，根系處于距土表10～15 cm 處，進行正常栽培管理。選擇12 盆正常生長到8 片展開葉、長勢良好、生長旺盛的巨峰葡萄為試驗材料，隨機選擇3盆做正常澆水的對照組，剩余9 盆分別放入3 個70 cm×49 cm×38 cm 的塑料水箱中進行為期21 d的淹水脅迫，淹水期間保證水面位于盆沿之上3 cm，定期補水到線。分別在第0、14、21 天和恢復7 d 后的第28 天進行根際土采樣，采樣方法參照云鵬［11］的抖根法但進行了一定的改進，用75% 乙醇給錫紙消毒，取出植物根系，把大土塊剝落，根系在錫紙上抖動，抖落的土為根際土，用藥匙將根際土放入無菌離心管中，分別記為對照組K0R（Kyoho-flooded for 0day-rhizosphere soil）、淹水組，K14R（Kyoho-floodedfor 14 day-rhizosphere soil）和K21R（Kyoho-floodedfor 14 day-rhizosphere soil）、恢復組K28R（Kyohodrainageand recovered for 7 days after flooded for 21days-rhizosphere soil）；并在14 d 時取培養(yǎng)盆中部無根區(qū)域的土（根外土）記為淹水組K14B（Kyohofloodedfor 14 days-bulk soil），取出的土樣裝入離心管，并放入液氮中低溫冷凍。樣品委托北京擎科生物科技股份有限公司使用 16S rRNA高通量測序技術對土壤細菌進行測序與分析。另外，于第28 天準備4 盆巨峰葡萄淹水處理21 d、恢復7 d，觀測其長勢和存活率。

1.3 測定指標與方法

采用Omega Bio-tek 公司（Norcross，GA，U.S.）的E.Z.N.A.? Soil DNA Kit 試劑盒提取巨峰葡萄根際細菌的總DNA。隨后，通過1% 的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop 2000 分光光度計對提取的DNA 進行濃度和純度的測定［12］。以提取的DNA 作為模板，利用引物338F（ 序列為5′-ACTCCTACGGGAG?GCAGCAG-3′）和806R（序列為5′-GGACTACH?VGGGTWTCTAAT-3′）對土壤細菌的16S rRNA基因V3～V4 區(qū)進行PCR 擴增。最終，利用Illumina公司的MiSeq PE300 平臺進行測序分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

使用QIIME 軟件處理原始序列數(shù)據(jù)［13］，進行操作單元（operational taxonomic units，OTUs ）的聚類分析［14］，計算Alpha 多樣性指數(shù)并進行分析，通過主坐標分析進行Beta 多樣性分析，使用PICRUSt2 軟件推測樣本中細菌的功能基因組成［15］。

2 結果與分析

2.1 淹水脅迫下巨峰葡萄的形態(tài)變化

如圖 1 所示，淹水期間，對照組生長旺盛，葡萄未出現(xiàn)葉片黃化以及脫落的現(xiàn)象；淹水組葡萄葉片大量脫落，生長受到抑制，沒有死亡，但在排水恢復期間，淹水組葡萄大量死亡，存活率僅為25%。經過21 d 淹水脅迫和7 d 排水恢復，淹水組形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，葉片受害程度嚴重，幾乎完全黃化，甚至出現(xiàn)了枯萎脫落的現(xiàn)象。

2.2 巨峰葡萄根際與根外細菌群落OTUs 分析

4 個處理中，K21R 的OTU 數(shù)最多（圖2A）。K0R、K14R、K21R、K28R 根際細菌的OTU 數(shù)分別為2 152、2 199、2 200、2 199 ，4 個處理中只有淹水組（K14R）有2 個特異OTUs。與K0R 相比，K14R、K21R、K28R 分別發(fā)現(xiàn)特有的OTUs 數(shù)57、63 、57；K21R 和K28R 特有OTUs 分別為13 和14 個。植物恢復7 d 后，同樣有根際細菌種類消失或出現(xiàn)的情況。K14R 與K14B 這2 個處理土壤細菌的OTUs 分別為2 199、2 108，共有的OTUs 為2 105，根際淹水組（K14R）和根外淹水組（K14B）特有的OTUs 分別為94、3（圖2B）。結果表明，在淹水脅迫期間會出現(xiàn)一些特異根際細菌，也有部分土壤細菌消失，隨著淹水脅迫的進行，消失的根際細菌種類會增加。

2.3 淹水脅迫對巨峰葡萄根際細菌群落的Alpha多樣性的影響

由表1 可見，淹水脅迫對巨峰葡萄根系細菌群落結構有顯著影響，K14R 處理下細菌的多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）比K0R 顯著增高（Plt;0.05），但豐度指數(shù)（Chao1、ACE）無顯著變化。K21R 的豐度指數(shù)（Chao1、ACE）比K0R 極顯著增高（Plt;0.01）。淹水脅迫極顯著提高（Plt;0.01）細菌的豐度指數(shù)（Chao1、ACE），尤其在淹水脅迫第21 天（K21R）時，細菌的豐度指數(shù)（Chao1、ACE）極顯著增加（Plt;0.01）；細菌多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）先增加后降低，說明是巨峰葡萄根系使細菌群落分布不均勻最終導致多樣性降低。

恢復處理對巨峰葡萄根系細菌群落結構也有顯著的影響（表1），K28R 的豐度指數(shù)（Chao1、ACE）比K21R 極顯著增加（Plt;0.01）。K28R 與K0R 比豐度指數(shù)（Chao1、ACE）極顯著增加（Plt;0.01），K28R 細菌的多樣性指數(shù)（Simpson、Shannon）與K0R 比顯著降低（Plt;0.05）。說明淹水脅迫對巨峰葡萄根際細菌群落結構有較大的影響，恢復7 d，根際細菌群落結構無較大變化，但無法恢復到K0R 水平。

2.4 淹水脅迫對巨峰葡萄土壤細菌群落β 多樣性的影響

圖3 顯示，4 組處理中，K0R 與其他3 組細菌群落結構差異較大。除K0R 外，其余3 個處理分別在不同的象限，說明淹水脅迫顯著改變了根際細菌群落結構，淹水脅迫后進行恢復處理也無法使根際細菌群落結構恢復到K0R 的水平。K0R 與K21R 距離最遠，說明淹水時間越長，根際細菌群落結構的差異越大。從圖3B 可以看出，K14R 和K14B 相隔較遠，說明2 組的群落組成有較大的差異。說明根系對淹水土壤中細菌的群落組成有較大影響。

2.5 淹水脅迫對巨峰根際細菌群落組成的影響

由圖4 可見，最優(yōu)勢菌門始終是變形菌門（Pro?teobacteria），相對豐度為33.83%～49.12%，其他各菌門的相對豐度大小依次為：酸桿菌門（Acidobacte?ria，12.72%）、綠彎菌門（Chloroflexi，11.80%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，8.23%）、放線菌門（Ac?tinobacteria，6.72%）、厚壁菌門（Firmicutes，6.27%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，3.76%）、Latescibacteria（2.21%）、浮霉菌門（Planctomycetes，1.78%）、棒狀桿菌門（Rokubacteria，1.64%）。K0R 和淹水組（K14R、K21R）變形菌門分別減少1.47%、4.56%，說明淹水脅迫對變形菌門的生長有抑制作用。K14R和K21R 的厚壁菌門、擬桿菌門、Latescibacteria、浮霉菌門相對豐度高于K0R，淹水脅迫對這些菌門相對豐度有促進作用。占比最高的變形菌門在K21R 與K28R 中極顯著增加了15.29%（Plt;0.01），說明淹水脅迫后的恢復處理對變形菌門細菌有促進作用。

2.6 巨峰根際細菌群落的LEfse 分析

LEfse 分析（LDAgt;4.0）結果顯示，從門到屬水平，共有10 個物種間存在顯著差異，共有2 綱、2 目、2科、2 屬、2 種（圖5A）。其中K28R 存在組間顯著差異的個數(shù)最多，有8 個；K21R 最少，有2 個。屬水平（圖5B），硫桿菌屬（Thiobacillus）在K21R 的相對豐度顯著低于K28R（Plt;0.05）。

2.7 巨峰葡萄根際細菌功能基因預測分析

K0R 和K14R 根際細菌的糖代謝功能基因差異顯著（Plt;0.05），K14R 根際細菌的糖代謝水平顯著上升（圖6A）。K0R 和K28R 根際細菌的細胞運動、免疫系統(tǒng)、細菌傳染病、信號傳導、內分泌和代謝疾病的功能基因差異顯著（Plt;0.05）（圖6B）。K28R 根際細菌的細胞運動、免疫系統(tǒng)、細菌傳染病、信號傳導、內分泌和代謝疾病功能基因顯著上升。K14R 和K28R 根際細菌的萜類和聚酮類化合物的代謝、循環(huán)系統(tǒng)、細胞生長與死亡、神經退行性疾病、環(huán)境適應、信號轉導、脂質代謝、細胞移動性、糖代謝、物質依賴功能基因差異顯著（Plt;0.05）（圖6C）。其中K28R根際細菌的內分泌代謝疾病、病毒傳染病、循環(huán)系統(tǒng)、細胞生長與死亡、神經退行性疾病、環(huán)境適應、信號轉導、細胞移動性功能基因顯著增加；萜類和聚酮類化合物的代謝、脂質代謝、糖代謝和物質依賴性功能基因顯著降低。

3 討論

高彥婷等［16］研究發(fā)現(xiàn)，水分脅迫使葡萄根際細菌群落OTUs、豐度指數(shù)和多樣性提高，且水分脅迫對細菌群落結構的影響都具有一定的滯后性和延續(xù)性。研究發(fā)現(xiàn)，在淹水脅迫下植物根際細菌群落OTUs 增大，豐度增大，多樣性指數(shù)先增后降。這可能是由于某種菌群（如厚壁菌門）大量繁殖，導致其特定菌群豐度升高［17］。劉璐等［18］研究發(fā)現(xiàn)細菌豐度與多樣性變化不一致。本研究中根際土壤細菌的豐富度高于根外土壤，隨著淹水脅迫的持續(xù)，根際細菌群落的多樣性逐漸增加，生態(tài)功能不斷增強，這更有利于植物抵御不良環(huán)境［19］。研究表明，變形菌門始終為最優(yōu)勢菌門，與前人的研究一致［20］。

高敏敏等［17］研究發(fā)現(xiàn)灰化薹草和虉草淹水脅迫后期，植物代謝受到嚴重抑制，無法產生足夠的營養(yǎng)物質來滿足細菌的生長需要，此時，有害細菌可以大量生長繁殖、產生有毒物質，加重對植物的傷害。本研究發(fā)現(xiàn)巨峰葡萄耐澇能力較差，在淹水21 d 未死亡，淹水后恢復期間，巨峰葡萄大量死亡，而硫桿菌屬在恢復組（K28R）顯著增加。有研究表明硫桿菌屬會產生有毒物質（H2S），對植物根系產生毒害作用［21］。

植物主要通過地下碳沉積促進根系相關的微生物繁衍并募集特定微生物類群，而這些被招募的微生物會通過共生或致病的方式影響植物生長［22］。研究發(fā)現(xiàn)巨峰葡萄根系細菌糖類、脂質、萜類和聚酮類等代謝在淹水脅迫或脅迫恢復期間發(fā)生顯著的變化。在淹水脅迫14 d 根際細菌群落的糖代謝物顯著增加，植物根系通過碳水化合物招募細菌抵御非生物脅迫，在淹水后恢復期間，根系活性不足，細菌糖代謝物顯著減少。本研究發(fā)現(xiàn)K28R 根際細菌比K14R 根際細菌中萜類和聚酮類化合物顯著減少，可能在增強植物對病原菌的防護上有著重要作用［23］。此外脂質作為植物的活性物質、結構物質和信號分子在逆境脅迫下具有重要的調控和保護作用［7］。本研究淹水后恢復期間，脂質代謝物顯著減少，可能由于長期淹水脅迫造成結構被破壞，這可能與響應淹水脅迫有關。表明脂質、萜類和聚酮類等代謝物在調控巨峰葡萄響應淹水脅迫的過程中，行使了一定的生物學功能。解析淹水脅迫下根際微生物表達調控和抗淹水的機制，對了解植物在水淹環(huán)境下的適應能力具有十分重要的科學價值。

本研究表明淹水脅迫影響了巨峰葡萄根際細菌的群落結構，短期淹水脅迫使根際細菌代謝物發(fā)生改變以應對逆境脅迫；但長時間淹水使植物代謝發(fā)生紊亂，導致潛在有害細菌類群的豐度增加，植物有益菌群減少。在淹水脅迫恢復后，硫桿菌屬細菌顯著增加，其分泌產物對植物響應淹水脅迫有不利影響。淹水脅迫導致根際細菌糖代謝物顯著增加，脅迫后恢復根際細菌糖類、脂質、萜類和聚酮類等化合物顯著減少。脂質、萜類和聚酮類等化合物可能與植物抗氧化、抗?jié)B透等功能顯著相關。