多拷貝pucBA基因在沼澤紅假單胞菌光合生長中的作用

摘要： 選擇沼澤紅假單胞菌CGA009菌株，采用基因敲除方法，依次對菌株中的5對pucBA基因進行敲除，以探求不同pucBA基因對菌株光合生長、光譜表型和光合色素質量濃度的影響。結果表明：不同pucBA基因的表達量與菌株光合生長速率和光合色素合成量呈正相關關系；高光下pucBAb和pucBAa基因對菌株生長發(fā)揮主要作用，低光下pucBAb，pucBAd和pucBAa基因對菌株生長起主要作用；敲除pucBAd基因可導致pucBAb基因高效表達，敲除pucBAc基因可導致LH1-RC合成量提高，表明某個pucBA基因的敲除對其他光合基因表達具有補償作用。

關鍵詞： 紫細菌； 沼澤紅假單胞菌； 外周捕光復合體（LH2）； 基因敲除

中圖分類號： Q 78文獻標志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）05-0610-08

Role of Multiple Copy pucBA Genes in Phototrophic Growth of Rhodopseudomonas palustris

Abstract： Selecting Rhodopseudomonas palustris CGA009 strain， gene knockout method was used to sequentially knock out five pairs of pucBA genes in the strain in order to explore the effects of different pucBA genes on photosynthetic growth， spectral phenotype and photosynthetic pigment mass concentration of the strain. The results showed that the expression levels of different pucBA genes were positively correlated with the photosynthetic growth rate and photosynthetic pigment synthesis of the strain. The pucBAb and pucBAa genes played a major role in strain growth under high light conditions， while the pucBAb， pucBAd and pucBAa genes played a major role in strain growth under low light conditions. Knocking out the pucBAd gene could lead to efficient expression of pucBAb gene， while knocking out the pucBAc gene could increase LH1-RC synthesis， indicating that the knockout of a certain pucBA gene had a compensatory effect on the expression of other photosynthetic genes.

Keywords：

purple bacteria； Rhodopseudononas palustris； peripheral light-harvesting complex （LH2）； gene knockout

不產氧光合細菌（APB）因其光合單元簡單，常作為光合作用機制研究的模型生物［1-2］。由于自然光的不連續(xù)性，APB形成了2種機制應對光環(huán)境的變化。一種是調控光合單元中外周捕光復合體（LH2）和核心捕光復合體-反應中心復合物（LH1-RC）的數(shù)量以適應光變化，通常LH1與RC形成1∶1的復合體［3-4］，隨著光照強度升高，LH2/LH1-RC的比例降低［5-6］。另一種是隨著光照強度變化，LH2光譜類型也隨之變化［5-6］，高光時菌株形成典型光譜LH2（T-LH2），又稱B800-850 LH2，低光時形成異常光譜LH2（U-LH2），主要包括LH3（B800-820 LH2），LH4（B800-only或B800-low-850 LH2）和LH2′（B800-840 LH2）等［7-9］。目前，研究已闡明了不同光譜類型LH2的形成機制及隨光變化機制，其原因是菌株擁有多拷貝編碼LH2 αβ肽的pucBA基因，在不同光環(huán)境中多拷貝pucBA的表達量不同，由于不同pucBA基因編碼的αβ肽氨基酸殘基的差異，導致不同αβ肽與細菌葉綠素（BChl） a結合位點和配位方式不同，從而形成不同的特征光譜LH2［9-11］?；蚪M和系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，多拷貝pucBA基因在隸屬于APB的紫細菌中廣泛存在，尤其在紅假單胞菌屬菌株中的拷貝數(shù)可高達5～7對［5，9］。由于多拷貝pucBA基因同時表達，導致菌株中不同的LH2難以彼此分離，即使是高度純化的LH2，也是不同LH2的混合物［10-13］。針對該問題，Southall等［2］和Qian等［1］分別以沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudononas palustris，Rps. palustris） CGA009和2.1.6為研究對象，采用基因敲除的方法得到僅剩1對pucBA基因的菌株，純化得到單一基因型的LH2，不僅證明LH4均為B800-noly LH2［1-2］，而且高分辨地解析了4種LH2的晶體結構［1］，但并沒有報道這4種單一基因型LH2的光能傳遞活性［1］。

LH2功能活性評價通常采用Cogdell建立的檢測光能傳遞效率的方法，目前研究僅在固氮紅細菌（Rhodobacter azotoformans） 134K20、嗜溫紫色硫光養(yǎng)細菌（Allochromatium vinosum）和Rps. palustris CGA009等極少數(shù)菌株中比較了高、低光下純化LH2的光能傳遞效率［5，14］，但該法依賴于LH2的分離純化，而LH2彼此間難以純化，所提供的數(shù)據(jù)往往是菌株同時表達不同LH2的綜合結果［5］。歸根結底，LH2的作用主要是推動菌株進行光合作用、促進生長，但目前還沒有足夠的數(shù)據(jù)來評估LH2在菌株光合作用代謝過程中的功能活性。Zhao等［5］采用Cogdell法比較研究了Rps. palustris CGA009菌株在高、低光下U-LH2（LH4）和T-LH2的能量傳遞活性，進一步敲除菌株中的pucBAd基因（編碼LH4的αβ肽），探求LH4在菌株光合生長中的作用?；诖?，本文采用遺傳解剖的策略，在前期敲除pucBAd基因基礎上，依次敲除菌株的pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因，分別在高、低光下，考察基因缺失對菌株光合生長、光譜表型和光合色素質量濃度的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

Rps. palustris CGA009（野生株WT），購自美國ATCC公司。Rps. palustris CGA009 pucBAd基因敲除株簡稱Δd，克隆菌株大腸桿菌（E. coli） JM109，由實驗室保存。二氨基庚二酸（DAP）營養(yǎng)缺陷型E. coli WM3064，由中國科學院水生生物研究所邱東茹研究員饋贈。質粒pJQ200SK（攜帶硫酸慶大霉素抗性基因Gm和蔗糖篩選標記基因sacB），購自武漢淼靈生物公司。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒，購自北京全式金生物技術有限公司。質粒提取試劑盒和通用型DNA純化回收試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。PrimerSTAR○R HS DNA Polymerase、限制性內切酶（Pst Ⅰ，Xba Ⅰ和Xho Ⅰ）和T4 DNA 連接酶等，均購自日本Takara公司。甲醇、丙酮、異丙醇等為色譜純試劑，其余試劑為分析純試劑，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

采用改良Ormerod液體培養(yǎng)基和18#固體培養(yǎng)基［5］。改良Ormerod液體培養(yǎng)基培養(yǎng)容器為螺口藍蓋瓶，接種后用培養(yǎng)基充滿140 mL藍蓋瓶，在30 ℃，白熾燈光源2 000 lx（高光）和200 lx（低光）條件下，厭氧培養(yǎng)Rps. palustris CGA009菌株的基因缺失菌株。E. coli采用LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，根據(jù)需要添加DAP，Gm和蔗糖。

1.4 基因敲除和驗證

在巢式聚合酶鏈式反應（PCR）驗證pucBAd敲除株（Δd）基因缺失正確的基礎上，以Δd菌株作為出發(fā)株，依次敲除菌株中的pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因，得到pucBAda，pucBAdab，pucBAdabe和pucBAdabec基因缺失突變株，分別簡稱為Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec菌株。pucBAd，pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因敲除片段的長度分別為381，408，412，584和404 bp。

采用環(huán)狀質粒介導的雙交換同源重組法進行基因敲除［5］。以CGA009基因組DNA為模板，采用PCR法分別擴增敲除目的基因上游（U）和下游（D）DNA片段，采用PCR法拼接上、下游DNA片段，構建重組質粒pJQ200SK-UD，轉化E. coli DH5α，涂布LB抗性（Gm）平板，篩選重組子，并進行PCR驗證。提取重組質粒pJQ200SK-UD，轉化E. coli WM3064，經(jīng)Gm抗性篩選和PCR驗證，得到重組菌株E. coli WM3064（pJQ200SK-UD）。采用雙親交配的方法［5］，通過E. coli WM3064將質粒pJQ200SK-UD接合轉移至受體菌，將接合轉移的菌懸液涂布在18#固體培養(yǎng)基（100 μg·mL-1的Gm，不含DAP）上，培養(yǎng)5～7 d，挑選菌落，在含體積分數(shù)為10%蔗糖的18#固體培養(yǎng)基平板上劃線，挑選菌落，分別用不同引物，通過巢式PCR篩選和驗證目的基因缺失突變株。

使用的引物序列、酶切位點和擴增產物，如表1所示。表1中：F，R分別為pucBA基因的正向、反向引物；UF，UR分別為pucBA基因上游片段的正向、反向引物；DF，DR分別為pucBA基因下游片段的正向、反向引物；下標a，b，c，e分別為pucBA基因編號；CTGCAG為Pst Ⅰ酶切位點，CTCGAG為Xho Ⅰ酶切位點，TCTAGA為Xba Ⅰ酶切位點；雙下劃線序列為PCR拼接互補序列。

1.5 光合生長、吸收光譜和光合色素質量濃度的測定

離心收集低光培養(yǎng)3 d的pucBA基因缺失株菌體，調整菌懸液吸光度D（660）為1.50，按體積分數(shù)為3%的接種量接種至改良Ormerod液體培養(yǎng)基中。分別設置光照強度為2 000 lx和200 lx，以WT為對照，進行3組重復實驗。培養(yǎng)過程中取樣測定菌體生物量和吸收光譜。生物量以D（660）表示，繪制生長曲線。通過分析活細胞吸收光譜的特征峰的波長和吸光度的變化，表征pucAB基因敲除對菌株LH2合成能力的影響。使用基準線法計算特征光譜的吸光度值（D），其計算公式為

D=DT-DRL。

上式中：DT與DRL分別為特征光譜的總吸光值和參考線（RL）的吸光值。

用DWT表示野生型菌株的吸光度值，通過公式R=D/DWT×100%計算敲除菌株和野生型菌株間的相對生長速率。用ΔR表示相對變化量，即pucAB基因敲除后與敲除前相對生長速率的差值。

采用超聲法提取菌體光合色素。按質量體積比（g∶mL）為1∶12向菌體中加入色素提取液（丙酮-甲醇按照體積比7∶2配制而成）提取光合色素，將3次提取液合并定容至10 mL，取樣測定其吸收光譜。BChl a和Car的最大吸收波長分別為770，476 nm，BChl a和Car的質量濃度（ρ）計算公式為

ρ=DVf/（aL）。

上式中：a為摩爾消光系數(shù)，Car和BChl a摩爾消光系數(shù)分別為160，76 L·mol-1·cm-1［14-15］；L為光程；D，V和f分別表示樣品的吸光度、體積和稀釋因子。

2 實驗結果與分析

2.1 基因敲除和突變株驗證

以UF/DR為引物，基因敲除前、后菌株PCR擴增的目標條帶大小，如圖1（a）所示。由圖1（a）可知：擴增條帶與預期大小吻合；與基因敲除前菌株相比，pucBA基因缺失株未檢測到相應大小的DNA條帶，檢測到相對分子質量較小的DNA條帶，與缺失基因片段基本吻合，表明基因敲除菌株靶基因片段缺失。以F/R為引物，基因敲除前、后菌株PCR擴增目標條帶的大小，如圖1（b）所示。由圖1（b）可知：擴增條帶與預期片段大小相吻合，與敲除前相比，基因敲除后的菌株未檢測到相應大小的DNA條帶，表明基因敲除菌株靶基因被敲除。由此表明，WT（CGA009）敲除pucBAd基因菌株（Δd）的基因缺失正確，以Δd菌株作為出發(fā)株，依次敲除菌株中的pucBAa，pucBAb，pucBAe和pucBAc基因，相繼獲得了Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec菌株。

2.2 基因缺失對菌株吸收光譜的影響

由于LH2具有特征近紅外（NIR）吸收光譜，常常用活細胞NIR光譜反映LH2特征和表達量的變化。pucBA基因敲除株在高光和低光下的NIR特征光譜，如圖2所示。圖2中：λ為波長。低光下pucBA基因敲除對菌株NIR特征光譜的影響，如表2所示。表2中：λP1，λP2分別為特征峰P1，P2對應的波長；Dmax為吸光度峰值。

由圖2（b），表2可知：低光時，WT菌株呈現(xiàn)P1（805 nm）和P2（864 nm）2個NIR特征峰，且特征峰P1吸光度（DP1）gt;特征峰P2吸光度（DP2）；隨著5對pucBA基因的依次敲除，缺失株的P1最大波長（λmax）在803～805 nm范圍內變化，Dmax呈逐漸降低（Δd，Δda，Δdab和Δdabe）、再升高（Δdabec）現(xiàn)象；P2峰的最大波長明顯紅移，從864～865 nm（Δd，Δda和Δdab）紅移至881～883 nm（Δdabe，Δdabec），Dmax呈現(xiàn)先升高（Δd）、后逐漸降低（Δda，Δdab和Δdabe）、再升高（Δdabec）的現(xiàn)象。但不同敲除株的P1和P2特征峰吸光度峰值（Dmax）的降低或升高的幅度（ΔR）不同。

由于T-LH2，U-LH2（LH4）和LH1-RC分別呈現(xiàn)B800-850，B800-only和B800-875特征峰，它們的光譜發(fā)生相互疊加，從而形成菌體的P1和P2特征峰，pucBA基因敲除前后特征峰變化可反映pucBA基因的表達情況。由表2可知：與相應基因缺失前的菌株相比，Δd，Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec缺失株P1峰吸光度的相對變化（ΔR）分別為-35.0%，-9.3%，-33.7%，-4.2%和14.6%，P2峰吸光度的ΔR分別為35.9%，-13.2%，-48.0%，-9.8%和27.6%。

由此可知以下3點結論：1） 在低光環(huán)境中，pucBAd，pucBAb和pucBAa是主要表達合成LH2的基因，表達量高低順序為pucBAbgt;pucBAdgt;pucBAa，pucBAe和pucBAc表達量則更低；2） 由于Δda敲除株的P2峰吸光度高于WT菌株，表明敲除pucBAd有利于pucBAb基因的高效表達，由于pucBAb表達b-LH2合成量升高，導致P1特征峰將升高，從而低估了Δd菌株P1特征峰降低的程度；3） 與Δdabe菌株相比，由于Δdabec菌株的D（805）和D（881）升高，由此說明盡管已有研究表明pucBAc是偽基因，不能合成LH2［9］，但敲除該基因有利于菌株中LH1-RC合成量升高，表明pucBAc對LH1-RC基因的表達具有抑制作用。

由圖2（a）和表3可知：高光時pucBAd基因表達d-LH2合成量很低［5，9］，WT菌株呈現(xiàn)805 nm（P1）和866 nm（P2）特征峰，且DP2高于DP1，與文獻結果一致［5］；隨著pucBA基因的依次敲除，P1峰位變化范圍在804～805 nm，P2峰則從866～867 nm（Δd和Δda）紅移至876～878 nm（Δdab，Δdabe和Δdabc），其中，Δdab紅移幅度最大，從867 nm紅移至876 nm；與相應的未敲除株相比，Δd和Δdabec敲除株的DP1，DP2，D（866）升高，而Δda，Δdab和Δdabe敲除株降低，降低幅度（ΔR）為Δdabgt;Δdagt;Δdabe。由此表明：在高光條件下，菌株主要表達的基因是pucBAa和pucBAb，且pucBAb表達量高，次要表達基因是pucBAe，未檢測到pucBAd和pucBAc基因的表達。雖然pucBAd基因表達量很低，但敲除該基因促進了菌體中其他pucBA的LH2合成。敲除pucBAc則有利于LH1-RC表達。

2.3 基因缺失對菌株光合生長的影響

pucBA敲除株在高光和低光下的生長曲線，如圖3所示。由圖3可知：高光條件下，隨培養(yǎng)時間的延長，各敲除株光合生長速率有所不同，但穩(wěn)定期的生物量差異較小；與高光條件相比，低光下各敲除株的光合生長速率和最大生物量都有所不同。

pucBA敲除株在高光和低光下的相對生長速率（R），如圖4所示。圖4中：字母α， β， γ， δ ，ε表示顯著性差異分析，不同字母間的差異具有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；“-”表示與未敲除株相比，敲除株生長速率升高。由圖4可知：高光和低光條件下，Δdabec菌株的相對生長速率（R）分別為29.4%和41.0%，即5對pucBA完全敲除使生長速率降低了70.6%和59.0%，表明pucBA基因在菌株光合生長過程中發(fā)揮重要的作用；隨著5對pucBA依次敲除，在高光條件下，與相應的未敲除株相比，Δd，Δda，Δdab，Δdabe和Δdabec缺失株相對生長速率分別降低了2.1%（Δd），22.9%（Δda），43.1%（Δdab），-3.3%（Δdabe），5.8%（Δdabec），在低光條件下，分別降低了20.1%，11.3%，24.1%，-4.0%和7.5%。由此可見，高光時pucBAa和pucBAb對菌株的光合生長發(fā)揮主要作用，且pucBAbgt;pucBAa，而pucBAd，pucBAe和pucBAc的作用較??；低光時pucBAd，pucBAa和pucBAb對菌株生長發(fā)揮主要作用，且pucBAbgt;pucBAdgt;pucBAa，pucBAe和pucBAc的作用較小。Δdabe菌株在高光和低光下生長速率反而有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）；pucBAc是偽基因［9］，但敲除該基因對生長有明顯抑制作用。由此表明，敲除pucBAe和pucBAc仍影響菌株的生長和代謝，但總體上對生長影響較小。與菌株特征光譜結果相比可知，敲除pucBA基因對菌株生長的抑制作用與特征光譜吸光度降低的程度呈正相關關系，即敲除表達量高的pucBA基因對生長的抑制作用大，反之則小；光譜分析表明，敲除pucBAd，Δd菌株LH2表達量升高，但高光時菌株的生長速率并沒有升高，反而有降低的趨勢，其原因可能是高光時高表達量的LH2對菌株光損傷作用較大。

2.4 基因缺失對菌株光合色素的影響

敲除pucBA基因對菌體BChl a和Car質量濃度（ρ）的影響，如圖5所示。由圖5可知：與基因敲除前菌株相比，高光下，Δda，Δdab，Δdabe菌株的BChl a和Car的質量濃度均顯著降低（Plt;0.05），降低幅度為Δdabgt;Δdagt;Δdabe，Δd和Δdabec菌株BChl a和Car的質量濃度雖然升高，但差異無統(tǒng)計學意義；低光下，Δd，Δda，Δdab菌株的BChl a和Car的質量濃度均顯著降低（Plt;0.05），降低幅度為Δdabgt;Δdgt;Δa，Δdabe菌株的BChl a和Car質量濃度未顯著降低，Δdabec菌株BChl a的質量濃度有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義，而Car質量濃度顯著升高。由此可見，敲除表達量高的pucBA基因，菌株光合色素的質量濃度降低幅度大。這與敲除株光合生長和NIR光譜測定的LH2表達量的結果基本吻合，也與光合色素主要定位在LH2和LH1-RC上的報道結果相吻合［16］。但敲除pucBAd和pucBAc基因，菌體積累的光合色素質量濃度升高，這與基因敲除導致菌株中其他pucBA或LH1-RC表達量升高的結果相吻合。

3 結論

目前研究主要從轉錄水平上揭示高低光與菌株多拷貝pucBA基因表達的關系［9］，尚缺乏轉錄表達產物（LH2）合成和功能活性的證據(jù)。采用遺傳解剖策略，依次敲除多拷貝pucBA基因，通過光合生長、LH2特征光譜和光合色素合成量等指標綜合評價，分析多拷貝pucBA基因對菌株生存的貢獻。

研究結果顯示：敲除不同的pucBA基因對菌株生長的影響程度不同，基因的表達量與菌株光合生長和光合色素合成量呈正相關關系，即主要功能基因被敲除，嚴重制約菌株的生長、LH2合成和光合色素積累，敲除次要功能基因則影響較小。高光時，pucBAa和pucBAb基因是主要功能基因，對生長的貢獻率大小為pucBAbgt;pucBAa；低光時，pucBAd，pucBAa和pucBAb是主要功能基因，貢獻率大小為pucBAbgt;pucBAdgt;pucBAa；無論高光還是低光，pucBAb對菌株光合生長的貢獻最大，文中結果與轉錄組文獻報道的結果相矛盾［9］。特征光譜顯示，敲除pucBAd基因，LH2相對含量不但不降低，反而升高，光合色素的質量濃度同樣有升高趨勢，由此表明，敲除該基因有利于菌株中其他pucBA的高效表達，對LH2合成具有補償作用，這與本課題組前期研究結果一致［5］。但研究結果進一步顯示，在低光條件下，敲除pucBAd基因有利于pucBAb基因高效表達。轉錄組文獻結果顯示，CGA009菌株在高光和低光條件下pucBAb基因為次要表達的功能基因［9］，而文中結果顯示，pucBAb基因對菌體光合生長貢獻最大，由此明確，無論高光和低光，敲除pucBAd基因都能誘導pucBAb基因高效表達，這也是文中結果與轉錄組研究結果相矛盾的原因。另外，高光條件下pucBAd基因轉錄表達量極低［9］，但敲除pucBAd基因，LH2合成量升高，菌株生長速率沒有升高，反而有所降低的原因可能是高光下，LH2表達量高，光能吸收和傳遞活性高，對菌株的光損傷也增大，從而導致菌株生長速率沒有升高。敲除pucBAc基因促進LH1-RC合成量升高，表明pucBAc基因對LH1-RC合成具有抑制，其抑制機制有待深入研究。由此可見，多拷貝pucBA有利于菌株適應不同的光環(huán)境，不同光環(huán)境中不同的pucBA表達，其表達產物的功能勢必與其環(huán)境相適應，因此，多拷貝pucBA表達調控的機制還有待深入研究。

通過遺傳解剖策略，依次敲除CGA009菌株中的5對拷貝pucAB基因，闡明了多拷貝pucBA基因的缺失與菌株光合生長、光譜表型和光合色素合成的關系和規(guī)律，評價了5對pucBA在CGA009菌株中的功能和作用，即pucBAa，pucBAb和pucBAd對該菌株的光合生長發(fā)揮主要作用，其中，pucBAd主要在低光時發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，敲除pucBAd誘導pucBAb的高效表達，敲除pucBAc誘導LH1-RC合成量升高。研究為多拷貝pucBA功能和活性評價提供一種思路和方法。

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