SSR分子標(biāo)記兩種電泳方法在水稻品種上應(yīng)用的比較

摘 要：為了研究聚丙烯酰胺電泳和毛細(xì)管電泳在水稻分子檢測中的應(yīng)用，以水稻品種為材料，分別使用聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染檢測和毛細(xì)管電泳檢測，并對2種電泳進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，聚丙烯酰胺凝膠電泳對少量樣本檢測和引物篩選時更經(jīng)濟(jì)適用，毛細(xì)管電泳檢測結(jié)果適用于指紋圖譜和高通量材料的檢測分析，試驗中可以根據(jù)不同要求選擇不同的電泳方法。

關(guān)鍵詞：水稻；SSR分子標(biāo)記；聚丙烯酰胺凝膠電泳；毛細(xì)管電泳

中圖分類號：S511 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B 文章編號：2095–3305（2024）05–00-03

水稻是人類重要的糧食作物之一，也是中國農(nóng)業(yè)史上的重要里程碑之一，它不僅解決了中國糧食安全問題，還為農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的發(fā)展提供了堅實的基礎(chǔ)。我國是世界上水稻產(chǎn)量最高的國家，也是稻作歷史最悠久、水稻遺傳資源最豐富的國家之一。

當(dāng)下，世界上可能有超過14萬個水稻品種，科學(xué)家仍在不停地選育新稻種，水稻品種數(shù)量逐年增多，品種之間的差異性也越來越小，傳統(tǒng)的檢測方法難以區(qū)分眾多品種，使種子檢測工作受到一定限制。近年來，分子標(biāo)記不斷發(fā)展，基因水平檢測已經(jīng)廣泛用于種子領(lǐng)域。SSR分子標(biāo)記是從DNA水平上檢測生物個體差異，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作簡單、技術(shù)成熟、不受環(huán)境影響等特點，可以快速區(qū)分品種，在水稻種子鑒定研究中得到了廣泛應(yīng)用。

毛細(xì)管電泳是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離技術(shù)。通過軟件分析數(shù)據(jù)，比較其峰值差異，可以實現(xiàn)多樣品、多位點同時檢測，是一種高效、快速、準(zhǔn)確的SSR標(biāo)記檢測方法。

聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)，用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝膠電泳為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有分子篩效應(yīng)。它有非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）和SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）2種形式。

聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)染色、顯影后，可以分析膠帶，是一種適用范圍比較廣的檢測方法。本實驗對毛細(xì)管電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行了比較[1-5]。

1 材料與方法

1.1 種子發(fā)芽

隨機(jī)選取超過200粒水稻種子，放入發(fā)芽盒中，放在30 ℃光照8 h、黑暗16 h的發(fā)芽箱放置6 d左右。

1.2 DNA提取

準(zhǔn)備96孔深孔板并在每個深孔板中放入磁珠，再隨機(jī)選取水稻幼苗單株3 cm左右，用鑷子夾住幼苗中間放入96孔深孔板中，蓋上蓋子，并寫上每個樣品登記號，放入低于-20 ℃冰箱冷凍1 h。冷凍結(jié)束放在研磨儀研磨1.5 min，用冷凍離心機(jī)離心2 min。每個孔中加入300 μL 65 ℃的提取液和150 μL的乙酸銨溶液，蓋上蓋子，再用研磨儀研磨1 min，放入4 ℃冷凍離心機(jī)離心10 min。用300 μL的移液器吸上清液200 μL至另一深孔板，并做好標(biāo)記。加入400 μL的冰無水乙醇，換干凈的蓋子蓋上并充分搖勻。放入4 ℃冷凍離心機(jī)離心15 min，去掉上清，晾干，加入80～200 μL的雙蒸水，放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選

選用《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》（NY/T 1433—014）標(biāo)準(zhǔn)中推薦的SSR引物。

1.4 PCR擴(kuò)增檢測

PCR反應(yīng)體系為：11 μL的反應(yīng)體系包括DNA提取液2.0 μL、Buffer 1.0 μL、dNTP 0.8 μL、MgCl2 0.6 μL、正反引物各1 μL、雙蒸水4.35 μL、Taq聚合酶（0.25 μL）。

PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，31個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?jīng)過30多個循環(huán)后，單個SSR位點特定片段可得到幾百萬倍的擴(kuò)增，從而可在凝膠上顯現(xiàn)出來。

1.5 PCR產(chǎn)物檢測

1.5.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測

將擴(kuò)增好的產(chǎn)物加入2 μl溴酚藍(lán)指示劑，在3%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，用2把1.0 mm 52孔密型點樣梳點樣96個樣品；在400 V、400 mA的條件下，電泳35 min，電泳結(jié)束后，將凝膠從板子上放入盆中，加入固定液和銀染液（雙蒸水800 mL+乙酸4 mL+乙醇80 mL+1.6 g硝酸銀）染色10 min左右，顯影加入800 mL雙蒸水和12 g NaOH和4 mL的甲醛溶液搖動至顯示出清晰的條帶，最后加入水漂洗8次，沖洗凝膠上的殘留液，人工判讀。

1.5.2 毛細(xì)管電泳檢測

PCR反應(yīng)程序結(jié)束后，在做好標(biāo)記的PCR中加入60 μL雙蒸水，再加PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2～4 μL，混合離心，在96孔板中分別加入分子量內(nèi)標(biāo)、HIDI、稀釋混合的PCR產(chǎn)物2 μL，用3730XL毛細(xì)管分析儀進(jìn)行電泳。得出數(shù)據(jù)用軟件分析并生成分型信息和峰圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種電泳方法檢測結(jié)果的比較

毛細(xì)管電泳檢測比聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測更為精準(zhǔn)，毛細(xì)管電泳檢測可以將相差1 bp的DNA片段分離開，各樣品中含有分子量內(nèi)標(biāo)可以直接與DNA片段大小相比，再通過不同的峰值圖清晰、準(zhǔn)確地展示出來（圖1）。聚丙烯酰胺凝膠電泳DNA片段是通過與已知分子量Marker進(jìn)行比較，估計DNA片段的大小。水稻品種在聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測純度譜帶如圖2所示。

2.2 2種檢測方法成本和效率的比較

第一，儀器成本比較。毛細(xì)管儀器3730XL、ZAG等儀器成本要高于聚丙烯酰胺凝膠電泳成本，毛細(xì)管電泳的試劑盒、熒光引物、耗材、儀器維護(hù)成本也略高，對實驗室的溫度、電源、潔凈度、實驗人員都有一定的要求。

第二，效率比較。毛細(xì)管電泳采用多個PCR產(chǎn)物混點多重電泳（圖3），提高了工作效率，縮短了電泳時間，且毛細(xì)管電泳是全自動化操作，省去了人力，也避免了人為操作的誤差，從而提高了實驗結(jié)果的可靠性。建議在實驗中可以將這2種方法有效地結(jié)合起來，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法篩選SSR標(biāo)記，對少量材料進(jìn)行檢測，對大量材料的檢測分析和指紋圖譜建立時用毛細(xì)管電泳檢測法完成。

3 討論

3.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳變性與非變性電泳的比較

聚丙烯酰胺凝膠電泳有變性與非變性電泳，2種電泳均能檢測出目的片段，但方法不一樣，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳需要加變性劑，操作過程也較為復(fù)雜，制膠時要用剝離硅烷擦拭凹板，用親和硅烷擦拭平板，凹板和平板固定之后再灌膠，電泳時對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物要進(jìn)行變性處理，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠非常薄，染色時需要黏附在膠板上進(jìn)行染色，所以染色需要一塊膠一塊膠地進(jìn)行，并且凝膠從玻璃板上脫離需要用NaOH浸泡，不安全也不衛(wèi)生。因此，整個電泳過程時間長、效率低、不環(huán)保。

非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作過程相對簡單，在制膠時無需對膠板進(jìn)行處理，直接組裝玻璃板灌膠，電泳時不需要對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性處理，染色時可以直接對凝膠進(jìn)行染色，因此，檢測通量高，整個電泳檢測過程時間短、工作效率高。

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法操作過程煩瑣、成本高、耗時耗力、效率低。非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測操作簡單、污染小、成本低、經(jīng)濟(jì)快速，非常適合分子標(biāo)記檢測，例如，品種的純度鑒定、真實性鑒定、DNA比對、分子遺傳多樣性研究[6-7]。

3.2 不同DNA提取方法的比較

SSR分子標(biāo)記DNA提取方法一般采用快提法[8]、SDS法、CTAB法、磁珠法?？焯岱ū容^簡單快速，但保存時間短，一般不超過一個星期，擴(kuò)增產(chǎn)物在毛細(xì)管電泳檢測效果也不好，電泳受限制。SDS法和CTAB法雖然提取的DNA質(zhì)量較高，但在提取過程中需要加氯仿和異戊醇，這2種試劑有刺鼻性氣味，對人體有害且不安全。磁珠法提取種優(yōu)化的SDS提取方法，DNA質(zhì)量高，用核酸蛋白儀檢測DNA的濃度在200 ng/μL左右，DNA質(zhì)量在OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間，適合任何電泳，在提取的過程也不需要加氯仿和異戊醇，只需要加裂解液BUFFER1、提取液BUFFER2和無水乙醇，因此，較為安全，DNA保存時間也很長，成本較低，經(jīng)濟(jì)適用，還可以用96深孔板高通量進(jìn)行提取，尤其是水稻品種需要大批量提取DNA時優(yōu)勢明顯。

3.3 PCR產(chǎn)物混點組合建立

建立一套理想的PCR產(chǎn)物混點組合是保證實驗成功及獲得準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。PCR產(chǎn)物混點毛細(xì)管電泳是根據(jù)熒光標(biāo)記引物的顏色、產(chǎn)物大小、引物特點、峰圖對PCR產(chǎn)物進(jìn)行組合選擇，每組引物數(shù)量為5～11對，相同顏色的引物選擇1～3個。

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基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2023YFD1201204）。

作者簡介：劉奇燕（1982—），女，安徽岳西人，中級農(nóng)藝師，主要從事種子質(zhì)量分子檢測和常規(guī)檢測工作。