飽和烷烴處理下紫花苜蓿(Medicago sativa)的轉錄學特征

摘要 為探究紫花苜蓿在石油污染下的耐受機理， 采用超聲碎促溶的方法， 將3種有機物（十二烷、十六烷和二十四烷）配置成質量分數(shù)均為1％的混合溶液，模擬飽和烷烴污染對紫花苜蓿幼苗進行處理， 分別對污染0，6，24 h的植株取樣進行轉錄組學分析，共獲得1 431個差異表達基因（DEGs）。 GO富集分析表明， 這些DEGs主要涉及蛋白結合、代謝途徑和催化活性等; KEGG富集分析表明， DEGs主要富集到植物病原體相互作用、MAPK信號通路和光合生物碳固定途徑等。 qRT-PCR驗證轉錄組結果可靠。 研究結果為研究植物降解和耐受原油中飽和石油烴污染機制原理及后續(xù)篩選和培育耐石油污染植物提供理論依據。

關鍵詞 石油烴污染;紫花苜蓿;轉錄組;差異表達基因

中圖分類號：S541 DOI：10.16152/j.cnki.xdxbzr.2024-05-011

Analysis of transcriptome data of Medicago sativatreated with saturated alkanes

LI Yan^1，2， LI Yunhao^1，2， LI Yaru^3，4， ZHAO Min^1，2， QIN Tianyu⁴， WANG Hongyue⁴， HUANG Xuan^3，4

（1.National Engineering Laboratory for Exploration and Development of Low Permeability Oil and Gas Fields，Xi’an 710018， China; 2.Changqing Oilfield Oil and Gas Technology Research Institute， Xi’an 710018， China;3.Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology， Xi’an 710069， China;4.School of Life Sciences， Northwest University， Xi’an 710069，China）

Abstract To explore the tolerance mechanism of Medicago sativa under oil pollution， this study adopted the method of ultrasonic crushing and solubilization to prepare a mixed solution of three organic compounds （Dodecane，n-Hexadecane， and n-Tetracosane） at a concentration of 1％ to simulate saturated alkanes and treat Medicago sativa seedlings. Samples were taken from plants exposed to pollution for 0h， 6h， and 24h for transcriptomic analysis. The results showed that a total of 1431 DEGs were obtained. GO enrichment analysis indicated that these DEGs were mainly involved in protein binding， metabolic pathways， and catalytic activity. KEGG enrichment analysis showed that DEGs were mainly enriched in plant pathogen interaction， MAPK signaling pathway and photosynthetic biological carbon fixation pathway. qRT-PCR was further used to verify the reliability of the results. This study provides theoretical basis for exploring the mechanism of plant degradation and tolerance of saturated petroleum hydrocarbon in crude oil pollution， as well as subsequent screening and cultivation of petroleum-tolerant plants through transcriptome analysis of Medicago sativa treated with saturated alkanes.

Keywords petroleum hydrocarbon pollutants; Medicago sativa; transcriptome; differentially expressed genes

石油由氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)的烴類組成的混合物，通常貯藏在地殼上層部分^［1］，主要包含各種烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等化合物，被稱為“工業(yè)的血液”^［2］。近年來，隨著中國工業(yè)的蓬勃發(fā)展和人們環(huán)保意識的日益增強，石油污染問題日益凸顯，成為社會各界關注的焦點。為了應對這一挑戰(zhàn)，學者紛紛致力于研究如何有效降解和修復進入環(huán)境中的石油烴類污染物，以保障生態(tài)環(huán)境的持續(xù)健康發(fā)展。相較于傳統(tǒng)的物理和化學方法，植物修復技術是一種潛在的環(huán)保高效且成本相對低廉的修復方式^［3-4］。植物修復首先要保證植物對某種特定污染具有一定的耐受能力，進而可以吸附降解代謝污染物^［5］。前人學者研究發(fā)現(xiàn)，苜蓿（Richardia scabra）^［6］、高羊茅（Festuca arundinacea）^［7］、高丹草（Sorghum hybrid sudangrass）^［8］和黑麥草（Lolium perenne）^［9］等非鹽生植物在石油烴污染土壤修復方面具有很大的作用。

紫花苜蓿（Medicago sativa）屬于豆科苜蓿屬，為多年生草本植物，主要種植在中國北方干旱、半干旱地區(qū)^［10-11］，具有品質好、蛋白質含量高、易生長和繁殖等優(yōu)點^［12-13］，被稱為“牧草之王”。紫花苜蓿常栽培作禽畜的青綠飼料，也可作蔬菜食用。紫花苜蓿在環(huán)境保護和土壤修復方面也具有顯著效果，它能有效地減少化學農藥的使用，防止農藥對土壤和水體的污染^［14-15］。紫花苜蓿的深根系能防止水土流失^［16］，且根系的分泌物含有能夠降解石油烴的酶。因此，紫花苜蓿在石油污染土壤的修復方面表現(xiàn)出色，對不同地區(qū)、不同濃度的石油污染土壤都具有較好的修復效果。

紫花苜蓿作為一種重要的牧草，其研究已經越來越深入。王天楚等將紫花苜蓿的種子在不同濃度的鎘溶液中處理后繼續(xù)培養(yǎng)生長，并對其幼苗進行指標測定，發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿對于鎘具有一定的富集作用^［17］。熊軍波等將紫花苜蓿幼苗用NaCl處理9 d后對根部組織進行蛋白質組學分析，揭示了紫花苜蓿響應鹽脅迫的分子機制^［18］。Gao等將紫花苜蓿幼苗在250 mmol/L NaCl處理后生長0，12，24 h進行轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)苜蓿中過表達MsHPCA₁可提高其耐鹽性^［19］。但是，目前關于紫花苜蓿在響應石油污染、在污染土壤進行原位修復的分子機制了解還較少。本研究以紫花苜蓿幼苗為材料，利用十二烷、十六烷和二十四烷3種烷烴的混合物模擬飽和烷烴污染，對其幼苗脅迫處理后進行轉錄組學分析，探究受石油污染脅迫后引起的基因差異表達模式，為篩選抗性基因并闡明其耐受修復機制提供理論基礎。同時，本研究對于土壤修復和環(huán)境保護也具有重要理論意義。

1 結果

1.1 紫花苜蓿RNA測序質量

對飽和烷烴脅迫處理前（0 h）和處理后6 h和24 h的紫花苜蓿植株進行轉錄組的高通量測序。各個樣品的GC質量分數(shù)均超過42％，且Q20gt;96％，Q30gt;94％（見表1）。以紫花苜蓿中苜一號（Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1）基因組為參考，分別將各樣品的過濾數(shù)據（Clean Reads）與參考基因組進行序列比對，比對率超過77％，且唯一比對率在73％以上，說明測序結果可信，能滿足基因功能注釋和分析的需求，可進行下一步分析。

1.2 主成分（Principal Component Analysis）分析

為了降低數(shù)據的復雜性，評估各個樣品間的重復性，對9個測序樣品進行了主成分分析。結果顯示，對照組和處理組之間存在差異，且對照組CK-1、CK-2和CK-3之間重復性較好，模擬石油污染脅迫6 h的WR-6h-1、WR-6h-2和WR-6h-3較為集中，模擬石油污染脅迫24 h的WR-24h-1、WR-24h-2和WR-24h-3的距離較近，樣品間重復性合理（見圖1）。

1.3 差異表達基因分析

使用基于負二項分布的DESeq2軟件對Raw Counts進行分析，并將Padjustlt;0.05和|log₂FC|≥1作為差異基因的篩選標準。結果顯示，與對照（CK）組相比，在模擬石油污染脅迫6 h后，共檢測到783個差異表達基因，其中480個基因表達上調，而303個基因表達下調。當模擬石油污染脅迫時間達到24 h時，差異表達基因的數(shù)量變?yōu)?82個，其中434個基因表達上調，148個基因表達下調（見圖2）。

Venn圖展示了各個基因集中基因的個數(shù)及它們間的重疊關系。將3組CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和WR-6hvsWR-24h的DEGs進行比較得到圖3。與對照組（CK）相比，模擬石油污染6 h與24 h共有的DEGs 260個，特有的DEGs分別為523和322個，隨著污染時間的延長，DEGs會有所不同。

1.4 差異表達基因的GO富集分析

GO數(shù)據庫（Gene Ontology）是由基因本體聯(lián)合會（Gene Ontology Consortium）所建立的，是一個國際標準化的基因功能分類體系，可以對基因和蛋白的功能進行限定和描述。分別將CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和WR-6hvsWR-24h的DCGs進行GO功能富集分析。

結果顯示，在CKvsWR-6h組〔見圖4（a）〕中，差異表達基因顯著富集在生物過程（Biological Process，BP）中的水楊酸生物合成過程、水楊酸的代謝過程和氧化還原過程等，細胞組分（Cellular Component，CC）中的細胞膜、質膜、細胞膜固有成分等，以及分子功能（Molecular Function，MF）中的UDP-糖基轉移酶活性、血紅素結合和己轉糖移酶活性等。

在CKvsWR-24h組〔見圖4（b）〕中，差異表達基因顯著富集在生物過程（Biological Process，BP）中的次級代謝產物的合成、次級代謝過程和谷胱甘肽代謝過程等，細胞組分（Cellular Component，CC）中的胞外區(qū)、淀粉體、細胞膜等，以及分子功能（Molecular Function，MF）中的2-烯醛還原酶（NADP+）活性、硫氧還蛋白二硫化物還原酶活性和蛋白質二硫化物還原酶活性等。

在WR-6hvsWR-24h組〔見圖4（c）〕中，差異表達基因顯著富集在生物過程（Biological Process，BP）中的細胞大分子生物合成過程、氧化還原過程和翻譯等，細胞組分（Cellular Component，CC）中的核糖體、細胞內解剖結構、小核糖體亞基等，以及分子功能（Molecular Function，MF）中的氧化還原酶活性、抗氧化活性和過氧化物酶活性等。

以上結果表明，各類膜結構在響應烷烴脅迫時發(fā)揮重要的作用，水楊酸、谷胱甘肽代謝過程在模擬石油污染下紫花苜蓿的響應方面產生一定影響，通過調節(jié)氧化還原系統(tǒng)及抗性信號轉導幫助其緩解烷烴污染脅迫給機體帶來的損傷。

1.5 差異表達基因的KEGG富集分析

KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據庫是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據庫，包含了基因、蛋白質、代謝物和信號通路等生物分子的綜合信息。將CKvsWR-6h、CKvsWR-24h和 WR-6hvsWR-24h的差異表達基因進行了KEGG富集分析。

結果顯示，在CKvsWR-6h組〔見圖5（a）〕中，差異表達基因主要富集在植物與病原體的相互作用信號通路、谷胱甘肽代謝信號通路、植物激素信號轉導信號通路和有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路等。在CKvsWR-24h〔見圖5（b）〕組中，差異基因主要富集在己糖基轉移酶活性信號通路、光合作用信號通路、光合作用天線蛋白和次級代謝物的生物合成等。在WR-6hvsWR-24h〔見圖5（c）〕組中，差異表達基因主要富集在氧化還原過程信號通路、生物合成過程信號通路、光合過程中碳固定和光合作用天線蛋白等。由以上結果推測，紫花苜?？赡芡ㄟ^生物合成途徑、非生物脅迫信號轉導途徑和各種氧化還原代謝途徑來響應烷烴污染的脅迫。

1.6 差異表達基因的qRT-PCR驗證

轉錄組測序共獲得了1 431個差異表達基因，選取在抗氧化相關信號通路、非生物脅迫相關的信號通路和生長發(fā)育相關的信號通路中共10個最顯著差異表達的基因進行驗證。qRT-PCR驗證結果如圖6所示。由圖6可知，與抗氧化有關的基因（P7、抗壞血酸氧化酶基因、谷胱甘肽-s-轉移酶基因、REDOX2、P450、WRKY7）均上調，非生物脅迫有關的轉錄因子（NAC和MYB1）也均上調，與生長發(fā)育相關的基因GA20ox1上調、花發(fā)育相關基因FT下調，這10個基因的表達模式與高通量測序的結果一致，從而證明了轉錄組測序數(shù)據的準確性和可重復性。

2 討論與結論

紫花苜蓿作為一種重要的牧草，其生長和發(fā)育過程中常會受到各種環(huán)境脅迫的影響，這些脅迫可能來自干旱^［20］、土壤鹽堿度^［21］、重金屬污染^［22-23］等多種因素。紫花苜蓿在面臨脅迫時，會通過一系列的生理反應來應對并維持其生長和代謝活性。先前，趙穎對干旱脅迫下紫花苜蓿的轉錄組分析，發(fā)現(xiàn)無論是施加外源NO供體還是NO清除劑，在分子和生理層面均能有效調控紫花苜蓿的抗旱性能^［24］;Dong等通過比較轉錄組分析，并結合過氧化氫酶、過氧化物酶、谷胱甘肽酶和脯氨酸含量的生理變化，揭示了紫花苜蓿在鹽脅迫下的響應機制^［25］。但是，目前學者對紫花苜蓿應對石油污染脅迫的分子機制研究較少。

本研究對模擬石油污染處理不同時間的紫花苜蓿植株的轉錄組進行測序，進而研究紫花苜蓿應對模擬石油污染脅迫的深層機制，對于土壤修復和生態(tài)環(huán)境保護具有重要意義。本研究從CK vsWR-6h和CK vsWR-24 h中分別獲得783個和582個差異表達基因〔見圖2（a）、（b）〕，表明模擬石油污染脅迫時可以激活紫花苜蓿的多種修復機制來應對不良環(huán)境。

RT-qPCR具有高靈敏度、高特異性、高通量、實時監(jiān)測且不受物種限制^［26-27］等特點被廣泛應用于轉錄組學分析鑒定。紫花苜蓿在經過飽和烷烴污染脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)與抗氧化相關的基因WRKY7（MsG0180000525.01）上調來響應非生物脅迫，這與魏春梅等通過外施低濃度鈦離子發(fā)現(xiàn)轉錄因子WRKY基因家族表達上調研究結果一致^［28］。NAC基因家族是一類在植物中廣泛存在的轉錄因子家族，在植物應對非生物脅迫反應中具有重要的調節(jié)作用^［29-30］。本研究中，紫花苜蓿在飽和烷烴脅迫處理后，NAC家族轉錄因子（MsG0580024680.01）表達量顯著上調，與李曉宇等在研究中遼1號楊的NAC2基因在面臨鎘脅迫時，其表達水平顯著上調研究結果一致^［31］。植物激素信號轉導機制在植物感知和適應外界環(huán)境脅迫中發(fā)揮著至關重要的作用^［32］。這一機制使得植物能夠敏銳地察覺外界環(huán)境的變化，并通過調節(jié)生長、發(fā)育和代謝等生理過程，有效應對各種環(huán)境壓力，從而確保植物在多變的環(huán)境條件下能夠生存和繁衍。紫花苜蓿經烷烴脅迫處理后，植物激素信號轉導通路和MAPK信號轉導通路顯著富集，與陸程張研究Na₂CO₃脅迫下玉米苗根部轉錄組結果一致^［33］。本研究為進一步探索紫花苜蓿響應烷烴脅迫提供了有意的借鑒。

3 材料與方法

3.1 植物材料

以紫花苜蓿作為研究材料，用dH₂O浸泡過夜后播種到營養(yǎng)土和蛭石1∶1配比的混合土中，在人工氣候室（光照強度為100 μmol·m^-2;溫度25 ℃;光周期為16 h光照/8 h黑暗;空氣濕度 65％）內進行培養(yǎng)。

3.2 模擬石油污染下的脅迫處理

待播種一周之后，將紫花苜蓿幼苗從土壤里移出，用清水洗干凈其根部并移栽到水培箱中進行水培，加入適量的Hoagland培養(yǎng)液^［34］。待水培生長20 d后，將紫花苜蓿的幼苗移栽至濃度為1％的模擬飽和烷烴污染混合溶液的水培箱中進行脅迫處理。

1％的模擬飽和烷烴污染混合溶液的配置方法如下：分別稱取1 g的十二烷、十六烷和二十四烷于97 mL的ddH₂O中，使用超聲儀頻率為45 kHZ超聲30 min直至形成乳濁液。

分別收集脅迫6 h和24 h后的紫花苜蓿植株，以脅迫前（0 h）的紫花苜蓿植株作為對照，采集的紫花苜蓿植株經液氮研磨成粉末后立即放入-80 ℃冰箱中保存。每個處理組重復3次，每個樣品共收集1 g材料。

3.3 轉錄組測序

所有紫花苜蓿樣本基于Illumina Novaseq 6000 測序平臺完成轉錄組的測序，測序采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit方法進行文庫構建。

為保證后續(xù)生物信息分析的準確性，使用fastp軟件對原始測序數(shù)據進行過濾，從而得到高質量的測序數(shù)據（clean data），以保證后續(xù)分析的順利進行。使用HISAT2^［35］軟件將質控后的數(shù)據與參考基因組（參考基因來源：Medicago_-sativa; 參考基因組版本：ZhongmuNo.1）進行比對，獲得用于后續(xù)分析的mapped reads（可比對上序列比例），同時對本次測序的比對結果進行質量評估。采用Cufflinks^［36］軟件將mapped reads（可比對上序列比例）進行組裝拼接，與已知轉錄本進行比較，獲得沒有注釋信息的轉錄本，并對其中潛在的新轉錄本進行功能注釋。

3.4 差異表達基因DEGs的富集分析

使用軟件RSEM^［37］分別對轉錄本的整體表達水平進行定量分析，基因的相對表達量用PTM值衡量。使用BH（fdr correction with Benjamini/Hochberg）方法進行p值的多重檢驗校正。使用DESeq2^［38］軟件對原始數(shù)據進行分析，基于一定的標準化處理和篩選條件獲得比較組間表達差異的轉錄本；默認參數(shù)為：Padjustlt;0.05及|log₂FC|≥1;在GO和KEGG數(shù)據庫對DEGs的轉錄本進行注釋分析^［39］。

3.5 基因的qRT-PCR驗證

將選取的10個顯著差異基因進行qRT-PCR分析以驗證數(shù)據的可靠性。使用Trizol法提取對照組和處理組樣品的總RNA，cDNA按照PrimeScript 1st Strand cDNA試劑盒說明書反轉錄合成。以GAPDH作為內參基因，各基因序列引物設計在附錄中（見表2），采用2^-△△Ct方法^［40］計算基因的相對表達量。

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（編 輯 雷雁林）