乙酰輔酶A羧化酶2通過調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

【關(guān)鍵詞】肝癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；乙酰輔酶A羧化酶2

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是一種惡性程度較高的腫瘤，我國原發(fā)性肝癌發(fā)病率和死亡率均高于全球平均值，每年死亡病例高達(dá)33.6萬[1]。HCC的高危因素主要包括HBV/HCV慢性感染、飲酒、肥胖等[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，代謝失調(diào)特別是脂質(zhì)代謝異?？赡茉贖CC的發(fā)生發(fā)展中起到重要的促進(jìn)作用，但其具體機(jī)制尚未完全闡明[3]。

乙酰輔酶A羧化酶2（acetyl-CoA carboxylase 2，ACC2）作為參與脂肪酸合成代謝的代謝酶之一，催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)楸］o酶A，在脂肪酸的合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。其編碼基因為ACACB，位于人染色體12q24.11。ACC 有2 種亞型（ACC1 和ACC2），ACC2主要位于線粒體的胞質(zhì)表面，其代謝產(chǎn)物丙二酰輔酶A可以作為肉堿棕櫚酰輔酶A 轉(zhuǎn)移酶Ⅰ（carnitine palmitoyltransferase 1，CPT1）的抑制阻礙脂肪酸氧化。ACC2在肺癌中低表達(dá)[5]，頭頸癌中高表達(dá)[6]，推測其表達(dá)可能具有器官特異性。研究發(fā)現(xiàn)，ACC2 在不同組織來源的腫瘤中可能發(fā)揮抑癌或致癌基因的作用，例如乳腺癌中Snail 對ACC2的轉(zhuǎn)錄抑制激活了CPT1依賴的脂肪酸氧化，促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移[7]。單磷酸腺苷活化的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）在非小細(xì)胞肺癌中對ACC2的磷酸化修飾可以抑制其活性并達(dá)到促癌效果[8]。但是ACC2的高表達(dá)促進(jìn)頭頸鱗狀細(xì)胞癌惡性進(jìn)展[6]。目前ACC2在HCC發(fā)生發(fā)展中的作用無相關(guān)研究報道。

本研究首次發(fā)現(xiàn)HCC 組織中ACC2 明顯低表達(dá)，且與預(yù)后不良相關(guān)，敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。初步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ACC2通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程來促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。這一發(fā)現(xiàn)有望為研究HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞

人正常肝細(xì)胞系MIHA由香港理工大學(xué)柯子斌教授贈予，人肝癌細(xì)胞系HepG2、SK-Hep1、SNU449、PLC/PRF/5購自美國ATCC 公司，人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H、Huh7 以及HEK293T細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2試劑

DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于阿根廷NTC公司，青霉素-鏈霉素購自美國MCE公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipo8000購自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司。靶向ACC2的LentiCRISPR-sgACC2質(zhì)粒購自蘇州泓迅生物科技有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購于杭州碧云天生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購于美國Millipore公司，化學(xué)發(fā)光底物ECL購于美國Bio-rad公司。8 μm Transwell小室購自美國Corning公司；結(jié)晶紫染料購自北京索萊寶科技有限公司。ACC2抗體購自美國Boster公司（貨號：A03668-2）；Rb抗體、p21抗體、CyclinA2 抗體購自武漢ABclonal 公司（貨號：A16966、A1483、A19036）；β-actin抗體購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司（貨號：TA-09）；CyclinE2抗體購自美國Bioworld公司（貨號：BS65503）；p-Rb抗體購自英國Abcam公司（貨號：ab184702）。細(xì)胞周期檢測試劑盒購自蘇州四正柏生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) HEK293T細(xì)胞、Huh7細(xì)胞、PLC/PRF/5細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清和1%的青-鏈霉素），培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.3.2 慢病毒包裝 實現(xiàn)ACC2 的靶向敲低，我們通過Lipo8000 轉(zhuǎn)染試劑將包裝質(zhì)粒pMD2. G、psPAX 以及LentiCRISPR-sgACC2 這3 種質(zhì)粒以1∶2∶3 的比例轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，收集換液72 h后的細(xì)胞上清，感染肝癌細(xì)胞來靶向敲低肝癌細(xì)胞中ACC2的表達(dá)。

1.3.3 Western blot實驗 用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳完成后，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉1.5 h 后孵育一抗，4 ℃孵育12 h。一抗孵育完成后，TBST緩沖液洗膜，室溫孵育二抗1.5 h，再次洗膜后進(jìn)行ECL顯影。

1.3.4 細(xì)胞增殖實驗 將PLC/PRF/5細(xì)胞和Huh7細(xì)胞鋪于96孔板中，密度分別為1×103 個/孔和1.5×103 個/孔，待細(xì)胞貼壁后于Incucyte ZOOM活細(xì)胞成像儀中拍攝記錄第1天的細(xì)胞圖像并每隔24 h拍攝1次，持續(xù)5 d，根據(jù)細(xì)胞底面積計算細(xì)胞數(shù)量并繪制生長曲線。

1.3.5 克隆形成實驗 將PLC/PRF/5 細(xì)胞（1×103 個/孔）、Huh7 細(xì)胞（1.5×103 個/孔）鋪于6 孔板中，正常培養(yǎng)10 d 左右，直至細(xì)胞長出肉眼可見的細(xì)胞集落后，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色5 min，最后拍照并計數(shù)細(xì)胞克隆數(shù)。

1.3.6 Transwell 實驗 使用8 μm transwell 小室進(jìn)行實驗，將3×104個PLC/PRF/5細(xì)胞和Huh7細(xì)胞分別培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基的小室內(nèi)，小室外加入含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基。

培養(yǎng)24 h后取出，用4%多聚甲醛室溫固定小室30 min后結(jié)晶紫染色5 min，清洗小室并將小室內(nèi)部的細(xì)胞拭去后于顯微鏡下拍照記錄，隨機(jī)選取5個區(qū)域進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.3.7 劃痕實驗 將密度為90%的PLC/PRF/5細(xì)胞和Huh7細(xì)胞鋪于96孔板中，待細(xì)胞貼壁并形成均勻單層細(xì)胞后，使用劃痕器劃痕，分別于劃痕后0 h和24 h在Incucyte ZOOM活細(xì)胞成像儀中拍攝細(xì)胞圖像，計算細(xì)胞遷移率。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期分析 在6 cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后使用無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞12 h使細(xì)胞周期同步，常規(guī)情況下培養(yǎng)36 h后消化細(xì)胞并收集細(xì)胞沉淀，隨后4 ℃下用75%乙醇固定細(xì)胞12 h，固定完畢使用碘化丙啶在37 ℃染色30 min，染色完畢后流式細(xì)胞術(shù)上機(jī)檢測，利用Modfit 4.1軟件對細(xì)胞周期曲線進(jìn)行分析和擬合。

1.3.9 數(shù)據(jù)庫分析 The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫（https：//www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga）下載肝癌（TCGA-LICH）數(shù)據(jù)集，用R 語言分析ACACBmRNA 在肝癌及正常肝組織中的表達(dá)差異和生存分析。

Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中獲取HCC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE6764，并使用R語言分析ACACB mRNA在HCC不同階段的表達(dá)。使用蛋白數(shù)據(jù)庫Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium（CPTAC）在線工具cProSite（https：//proteomics.cancer.gov/data-portal）分析ACC2蛋白在肝癌及癌旁組織中的表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)分析采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式呈現(xiàn)。兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA）。數(shù)據(jù)來自至少3個獨立重復(fù)實驗的結(jié)果。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ACC2在肝癌中低表達(dá)且預(yù)后不良相關(guān)

據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，ACACB 在肝癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平較正常肝組織顯著下降（正常組織：4.44±0.55，腫瘤組織：3.76±1.01，Plt;0.001，圖1A），ACACB低表達(dá)與肝癌患者較差的總體生存率密切相關(guān)（P=0.023，圖1B）。GEO數(shù)據(jù)集GSE6764 的分析結(jié)果顯示，肝癌組織中ACACBmRNA水平明顯低于正常肝組織，且隨著肝癌的不同發(fā)展階段，正常肝組織、纖維化肝組織、早期肝癌和晚期肝癌組織中ACACB mRNA水平呈梯度下降（a：9.64±1.02，b：5.55±0.79，c：5.12±1.18，d：2.80±0.40，e：2.70±0.67，f：1.77±0.32，Plt;0.01，圖1C）。蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)庫CPTAC 中的分析結(jié)果也表明，ACC2蛋白在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織（癌旁組織：0.42±0.40，腫瘤組織：-0.90±0.77，Plt;0.001，圖1D）。上述研究結(jié)果表明，HCC組織中的ACC2 水平更低，其表達(dá)與肝癌的惡性程度負(fù)相關(guān)。

2.2 構(gòu)建ACC2敲低肝癌細(xì)胞系

本研究在肝癌細(xì)胞系中檢測內(nèi)源性ACC2的表達(dá)水平，Western blot結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞系A(chǔ)CC2的表達(dá)均低于正常肝細(xì)胞MIHA 細(xì)胞，相較之下PLC/PRF/5細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中ACC2 的表達(dá)水平最高，而SNU449、MHCC-97H 細(xì)胞中ACC2表達(dá)水平最低（圖2A）。于是通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)，選擇ACC2表達(dá)水平最高的2個細(xì)胞系PLC/PRF/5和Huh7構(gòu)建了ACC2靶向敲低細(xì)胞模型（圖2B），并在后續(xù)實驗中采用敲低細(xì)胞模型觀察ACC2 對肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

2.3 敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示細(xì)胞在體外正常培養(yǎng)5 d，相較于sgCtrl 組（Huh7：8.31±0.39；PLC/PRF/5：8.30±0.23），sgACC2-1（Huh7：12.36±0.40，Plt;0.001；PLC/PRF/5：12.23±0.41，Plt;0.001）和sgACC2-2（Huh7：13.33±0.34，Plt;0.001；PLC/PRF/5：12.80±0.66，Plt;0.001）組的細(xì)胞增殖能力明顯提高（圖3A）?？寺⌒纬蓪嶒炓诧@示，相較于sgCtrl 組（Huh7：257.30±11.24；PLC/PRF/5：97.33±15.50），sgACC2-1組（Huh7：320.00±22.11，P=0.008；PLC/PRF/5：185.30±20.60，P=0.001）和sgACC2-2 組（Huh7：357.00±17.35，Plt;0.001；PLC/PRF/5：184.30±10.97，P=0.001）的克隆形成能力更強(qiáng)（圖3B）。該部分結(jié)果表明，敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。

2.4 敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移能力

為了觀察ACC2水平敲低對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響，通過劃痕實驗和Transwll實驗檢測肝癌細(xì)胞的體外遷移能力。劃痕實驗結(jié)果顯示，sgACC2-1 組（Huh7：48.93±4.42，Plt;0.001；PLC/PRF/5：41.62±1.84，Plt;0.001）和sgACC2-2 組（Huh7：54.49±3.81，Plt;0.001；PLC/PRF/5：44.25±2.80，Plt;0.001）的細(xì)胞遷移能力顯著高于sgCtrl 組（Huh7：25.38±2.73；PLC/PRF/5：26.90±1.31）（圖4A）。Transwll 實驗也表明，相較于sgCtrl組（Huh7：49.00±4.93；PLC/PRF/5：31.00±4.73），sgACC2-1 組（Huh7：67.00±3.00，P=0.002；PLC/PRF/5：55.00±3.61，Plt;0.001）和sgACC2-2組（Huh7：73.00±6.08，P=0.008；PLC/PRF/5：61.00±3.61，P=0.001）的細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力（圖4B）。結(jié)果表明，敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移能力。

2.5 敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期

為了探索敲低ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制，我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞周期的變化。實驗發(fā)現(xiàn)敲低ACC2后肝癌細(xì)胞G1期減少（Huh7-sgACC2-1：38.06±0.15，Plt;0.001；Huh7-sgACC2：37.29±0.29，Plt;0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-1：38.98±0.78，Plt;0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-2：38.82±0.67，Plt;0.001），S 期增多（Huh7-sgACC2-1：53.33±0.50，Plt;0.001；Huh7-sgACC2：54.29±0.55，Plt;0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-1：45.59±0.33，Plt;0.001；PLC/PRF/5-sgACC2-2：45.42±0.69，Plt;0.001），促進(jìn)了細(xì)胞周期檢查點G1/S的轉(zhuǎn)換（圖5A）。對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測也發(fā)現(xiàn)，敲低ACC2后細(xì)胞周期抑制蛋白p21表達(dá)下降，p-Rb表達(dá)升高，G1 期周期特征性蛋白Cyclin E2 表達(dá)減弱而S 期周期蛋白Cyclin A2表達(dá)增強(qiáng)（圖5B），這些變化都提示敲低ACC2后通過促進(jìn)細(xì)胞周期由G1向S期轉(zhuǎn)換，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。

3 討論

脂肪酸是構(gòu)成細(xì)胞膜的主要成分，也是能量存儲和細(xì)胞信號傳遞的重要分子[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸代謝異常通過對多種關(guān)鍵分子和信號通路的調(diào)控，參與HCC發(fā)生與發(fā)展。首先，脂肪酸代謝可以調(diào)控HCC進(jìn)展的信號通路活化。例如，ATP檸檬酸裂解酶（ATP citrate lyase，ACLY）是脂肪酸從頭合成的第一步，可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性、遷移和侵襲[10]。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白5（fatty acid transport protein-5，F(xiàn)ATP5）通過促進(jìn)ATP的產(chǎn)生抑制AMPK活性，進(jìn)一步激活下游mTOR以支持HCC的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[11]。此外，脂肪酸代謝途徑產(chǎn)生的代謝物還可以直接作為信號分子調(diào)控HCC進(jìn)程。溶血磷脂酸（phospholipids，LPC）是PI3K/AKT、mTOR和MAPK信號通路的重要調(diào)控分子，可以增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲和黏附[12]。油酸處理也可以直接激活FABP5/HIF-1α軸，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的脂質(zhì)積累和細(xì)胞增殖[13]。脂肪酸代謝還能通過對腫瘤微環(huán)境的調(diào)控抑制免疫細(xì)胞殺傷功能，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。例如腫瘤組織中的Treg細(xì)胞可以通過SREBP依賴的脂質(zhì)從頭合成來維持腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的功能狀態(tài)，阻礙機(jī)體抗腫瘤免疫[14]。

鑒于脂肪酸代謝異常參與多種腫瘤包括HCC的發(fā)生發(fā)展過程，靶向脂肪酸代謝的抑制劑可能具有一定的抑癌作用。脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）抑制劑奧利司他在體外和小鼠肝癌模型中均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性[15-16]，該酶抑制劑C75[17]，triclosan21[18]和EGCG[19]在體外也具有抑癌效果。硬脂酰輔酶A去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1）抑制劑CAY10566也成功地改善體內(nèi)外的肝癌進(jìn)展[20-22]。提示靶向脂肪酸代謝的新型抑制劑可以為肝癌的靶向治療提供新的策略。

ACC催化乙酰輔酶A 羧化為丙二酰輔酶A的酶促反應(yīng)過程，是脂肪酸合成途徑的主要限速步驟。有研究發(fā)現(xiàn)，在DEN/CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中，抑制ACC1/2的活性可顯著降低小鼠肝癌模型的腫瘤進(jìn)展[23]。并且，肝臟特異性抑制劑ND-654可以通過模擬ACC1/2的磷酸化阻斷其活性，抑制HCC 的進(jìn)展[24]。但在DEN/CCl4 誘導(dǎo)的小鼠肝癌模型中肝臟特異性ACC1/2 基因敲除反而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞顯著增加[24]。有研究發(fā)現(xiàn)，ACC1在HCC中高表達(dá)并促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展[25]，但ACC2在HCC中的作用機(jī)制仍然未知。本研究通過多個數(shù)據(jù)庫的分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中ACC2的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平均低于正常肝組織，且與預(yù)后不良相關(guān)。體外實驗發(fā)現(xiàn)敲低ACC2可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞周期失調(diào)是導(dǎo)致惡性腫瘤異常增殖的關(guān)鍵因素。G1/S期以及G2/M期2個細(xì)胞周期調(diào)控點的失控會直接導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖[26]。研究表明，多種代謝途徑可以參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，如丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）在G1 期可以發(fā)生核轉(zhuǎn)位，通過cMyc/β-catenin軸激活周期蛋白CyclinD的轉(zhuǎn)錄[27-28]。6-磷酸果糖-2-激酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase，PFKFB）通常在G1期晚期被激活，在營養(yǎng)限制期促進(jìn)糖酵解，從而有利于G1/S期的轉(zhuǎn)換[29]。結(jié)果顯示，敲低ACC2后促進(jìn)了肝癌細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)換，進(jìn)而增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的增殖能力。

本研究發(fā)現(xiàn)HCC中ACC2低表達(dá)，且其表達(dá)與HCC 預(yù)后不良相關(guān)。敲低ACC2 使肝癌細(xì)胞的增殖、遷移能力得到明顯的增強(qiáng)。初步機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，ACC2對肝癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用是通過促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)換實現(xiàn)的。今后將在臨床樣本中驗證ACC2的表達(dá)情況，并進(jìn)一步探索ACC2促進(jìn)肝癌細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的具體機(jī)制。