新型減毒HSV-2疫苗 IFN-γ ELISpot檢測(cè)方法的建立

［摘 要］ 通過比較不同刺激物、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞接種濃度、免疫途徑，建立檢測(cè)新型減毒HSV-2疫苗細(xì)胞免疫水平的IFN-γ ELISpot方法。 對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行減毒HSV-2疫苗免疫，第14天加強(qiáng)免疫，第21天分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，采用IFN-γ ELISpot檢測(cè)該疫苗的細(xì)胞免疫水平。結(jié)果表明：最佳實(shí)驗(yàn)孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒，最佳細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h，最佳細(xì)胞接種濃度為3×106cells/mL，最佳免疫途徑是皮下注射。實(shí)驗(yàn)建立了針對(duì)該疫苗的IFN-γ ELISpot方法，為該疫苗提供了一種檢測(cè)細(xì)胞免疫水平的方法。

［關(guān)鍵詞］ 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)； 細(xì)胞免疫； 干擾素γ

［中圖分類號(hào)］ R392" ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］ A

2型單純皰疹病毒（herpes simplex virus 2，HSV-2）是引起生殖器皰疹的主要病原體。生殖器皰疹是一種性傳播疾病，具有慢性、復(fù)發(fā)性和難以治愈的特點(diǎn)，臨床主要表現(xiàn)為生殖器及肛周部位皮膚粘膜出現(xiàn)皰疹或潰爛。WHO關(guān)于生殖器皰疹最新報(bào)道顯示，全球15～49歲人口中約有13%感染了HSV-2[1]，且HSV-2病毒感染者在面臨人類免疫缺陷病毒１型（human immunodeficiency virus 1，HIV-1）時(shí)，相比未感染者感染HIV-1的概率增加３～4倍[2-3]。目前臨床治療多以抗病毒藥物為主，如阿昔洛韋、泛昔洛韋和伐昔洛韋等[4-5]。這些藥物雖能降低癥狀的嚴(yán)重程度和復(fù)發(fā)頻率，但無法根治感染。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT assay）初次報(bào)道于1983年[6]，是一種能從單細(xì)胞水平反映細(xì)胞免疫的技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)[7]。IFN-γ是Th1細(xì)胞產(chǎn)生的一種豐富的細(xì)胞因子，能夠活化巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞，通常被認(rèn)為其內(nèi)源性水平高低能夠反映機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況[8]。因此通過ELISpot檢測(cè)IFN-γ是目前評(píng)估細(xì)胞免疫水平最常見的方法[9]。但是該技術(shù)尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化，研究人員需要針對(duì)不同的研究對(duì)象，對(duì)刺激物、細(xì)胞濃度、培養(yǎng)時(shí)間、免疫途徑進(jìn)行摸索，才能建立穩(wěn)定的檢測(cè)體系。本課題組前期為預(yù)防HSV-2感染，基于II型單純皰疹病毒野生毒株HG52開發(fā)了一種減毒疫苗（attenuated vaccine），本文旨在建立檢測(cè)該減毒疫苗誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫的IFN-γ ELISpot方法，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6小鼠，7周齡，雌性，SPF級(jí)，購(gòu)于湖北省疾控中心。

1.1.2 試劑和儀器 Mouse IFN-γ precoated ELISpot Kit（內(nèi)包含預(yù)包被的PVDF板、生物素標(biāo)記的抗體、酶聯(lián)親和素、AEC顯色液、Washing buffer、Dilution buffer）、PMA+Ionomycin，購(gòu)于達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，購(gòu)于浙江天杭生物有限公司；PRMI-1640培養(yǎng)基，購(gòu)于Gibco公司；紅細(xì)胞裂解液，購(gòu)于蘭杰柯科技有限公司；短肽，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成；減毒疫苗、疫苗稀釋液IS buffer，由本實(shí)驗(yàn)室制備。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀，購(gòu)自德國(guó)AID公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物免疫 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組注射減毒疫苗，滴度為107CCID50/mL，注射量為100 μL/只；對(duì)照組注射疫苗稀釋液IS buffer，注射量為100 μL/只。間隔14 d，加強(qiáng)免疫一次。

1.2.2 分離脾臟淋巴細(xì)胞 在加強(qiáng)免疫7 d后，頸椎脫臼法處死C57BL/6小鼠，無菌摘取脾臟組織，置于含有PRMI-1640培養(yǎng)基的六孔板中。將脾臟研磨成單個(gè)細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞篩至50 mL離心管中，300×g離心7 min，棄上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，輕輕吹打混勻，裂解2 min，離心棄紅色上清，無菌PBS溶液清洗細(xì)胞2次。用含有10％胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.2.3 ELISpot試驗(yàn)步驟 活化預(yù)包被的PVDF板，加入PRMI-1640培養(yǎng)基，200 μL/孔，室溫靜置10 min后，傾倒培養(yǎng)基；加入調(diào)整好濃度的脾臟淋巴細(xì)胞懸液，100 μL/孔；實(shí)驗(yàn)孔加入實(shí)驗(yàn)組刺激物，陽(yáng)性對(duì)照孔加入PMA+Ionomycin，陰性對(duì)照孔加入含有10％胎牛血清的PRMI-1640培養(yǎng)基，10 μL/孔；將ELISpot板放入37 ℃、5％ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)一定時(shí)間；傾倒孔內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的去離子水，200 μL/孔，4 ℃放置10 min低滲裂解細(xì)胞；用Washing buffer洗板6次，1 min/次；加入生物素標(biāo)記的抗體，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；用Washing buffer洗板6次，1 min/次；加入酶標(biāo)親和素，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；用Washing buffer洗板6次，1 min/次；加入AEC顯色液，100 μL/孔，37℃避光顯色12-20 min；加入去離子水終止顯色，傾倒液體，將板置于室溫陰涼處晾干；使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)分析儀進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 ELISpot試驗(yàn)結(jié)果分析 圖1中的一個(gè)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)分泌IFN-γ 的T淋巴細(xì)胞（spot forming cell，SFC），斑點(diǎn)數(shù)的多少反映著機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。參考文獻(xiàn)[10]并結(jié)合本疫苗的實(shí)際情況，設(shè)定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)組刺激孔的斑點(diǎn)數(shù)大于55個(gè)/106cells，且大于4倍的陰性對(duì)照孔的斑點(diǎn)數(shù)。

對(duì)于計(jì)數(shù)結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism 8.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.005，****p＜0.0001作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 ELISpot方法的建立

1.3.1 刺激物的選擇 隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組小鼠5只，比較短肽池和紫外滅活的疫苗全病毒顆粒作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物的效果。操作步驟參考1.2進(jìn)行。其中，動(dòng)物免疫途徑為皮下注射，接種細(xì)胞濃度為3×106cells/mL，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

1）短肽池 短肽合成是從已知HSV-2開放閱讀框中選擇的[11]（表1）。將單個(gè)短肽按1、10 μg/mL等量混合，制成短肽池作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物。

2）紫外滅活的疫苗全病毒顆粒 將滴度為108CCID50/mL和107CCID50/mL的減毒疫苗于254 nm波長(zhǎng)的紫外線下滅活30 min，簡(jiǎn)寫為UV-VX，作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的選擇 從實(shí)驗(yàn)組小鼠和對(duì)照組小鼠中隨機(jī)抽取5只，將培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整為24、48、72 h。操作步驟參考1.2進(jìn)行。其中，免疫途徑為皮下注射，接種細(xì)胞濃度為3×106 cells/mL；實(shí)驗(yàn)孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒。

1.3.3 細(xì)胞接種濃度的選擇 從實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠中隨機(jī)抽取5只，將接種細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106、2×106、3×106、4×106和5×106 cells/mL。操作步驟參考1.2進(jìn)行。免疫途徑為皮下注射，實(shí)驗(yàn)孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108 CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

1.3.4 免疫途徑的選擇 隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組小鼠10只，分為2組，比較皮下注射（subcutaneous，SC）、肌肉注射（intramuscular，IM）兩種免疫途徑。操作步驟參考1.2進(jìn)行。其中，接種細(xì)胞濃度為3×106 cells/mL，實(shí)驗(yàn)孔刺激物為紫外滅活30 min、原滴度為108 CCID50/mL的疫苗顆粒，培養(yǎng)時(shí)間為24 h。

2 結(jié)果

2.1 刺激物的確定

由圖2可知，當(dāng)短肽池作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)較少，未產(chǎn)生較好的刺激效果；當(dāng)紫外滅活的疫苗全病毒顆粒作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)較多，即原滴度為108 CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒刺激產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)為217.2±36.26個(gè)，原滴度為107CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒刺激產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)22.2±2.94個(gè)，二者呈顯著性差異（p＜0.0001）。從數(shù)據(jù)來看，選擇紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物可產(chǎn)生較好的刺激效果。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的確定

由圖3可知，在刺激物作用下，實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加，但是對(duì)照組小鼠產(chǎn)生的非特異性斑點(diǎn)數(shù)也隨之增加。在培養(yǎng)72 h檢測(cè)時(shí)，對(duì)照組有的孔非特異斑點(diǎn)高達(dá)56個(gè)。在無刺激物作用時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠分泌IFN-γ的脾臟淋巴細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加呈現(xiàn)一定的遞增趨勢(shì)，但幅度很小，斑點(diǎn)數(shù)最多僅24個(gè)。從數(shù)據(jù)來看，為避免對(duì)照組在刺激物作用下產(chǎn)生較多的非特異性斑點(diǎn)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間控制在24～48 h范圍內(nèi)比較合適。

2.3 細(xì)胞接種濃度的確定

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)組斑點(diǎn)數(shù)隨著脾臟淋巴細(xì)胞接種濃度的增加而增加，對(duì)照組斑點(diǎn)數(shù)也呈現(xiàn)一定的遞增趨勢(shì)，但幅度很小。當(dāng)接種濃度為3×106 cells/mL，即每孔細(xì)胞接種數(shù)為3×105cells時(shí)，實(shí)驗(yàn)組小鼠產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)為192.1±29.65個(gè)，對(duì)照組平均斑點(diǎn)數(shù)為3.9±0.48個(gè)，本底干擾小。當(dāng)接種濃度大于3×106 cells/mL時(shí)，有的實(shí)驗(yàn)孔斑點(diǎn)數(shù)大于500個(gè)，如圖5所示出現(xiàn)斑點(diǎn)連片。這種現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)，增大實(shí)驗(yàn)誤差。從數(shù)據(jù)來看，細(xì)胞接種最佳濃度為3×106 cells/mL。

2.4 免疫途徑的確定

由圖6可知，在疫苗免疫滴度為107 CCID50/mL時(shí)，皮下注射產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)為247.9±37.11，肌肉注射產(chǎn)生的特異性斑點(diǎn)數(shù)為234.1±37.36。經(jīng)t檢驗(yàn)分析，這兩種免疫途徑產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)無顯著性差異（p＞0.05）。從數(shù)據(jù)來看，皮下注射產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)略高于肌肉注射產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)。故選擇皮下注射作為該疫苗的免疫途徑。

3 討論與結(jié)論

有效的疫苗接種不僅誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答也同等重要。在特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的常用檢測(cè)方法中，相比MHC肽五聚體染色法、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法，ELISpot試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn)[12]。這些優(yōu)點(diǎn)使得ELISpot試驗(yàn)成為現(xiàn)階段評(píng)估疫苗引起細(xì)胞免疫效應(yīng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但該技術(shù)尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化。影響檢測(cè)體系的因素較多，研究人員需要針對(duì)不同的研究對(duì)象進(jìn)行摸索才能建立穩(wěn)定的檢測(cè)體系。

刺激物選擇是ELISpot技術(shù)的關(guān)鍵因素之一。本研究對(duì)比短肽池和紫外滅活的疫苗全病毒顆粒兩種實(shí)驗(yàn)孔刺激物，選擇經(jīng)紫外滅活30 min、原滴度為108CCID50/mL的疫苗全病毒顆粒作為實(shí)驗(yàn)孔刺激物。合適的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間要排除非特異性斑點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。通過比較，本研究選擇的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為24～48 h。細(xì)胞接種濃度也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素，接種濃度過低斑點(diǎn)產(chǎn)生較少，接種濃度過高會(huì)出現(xiàn)斑點(diǎn)連片現(xiàn)象。綜合考慮下，本研究選擇細(xì)胞接種濃度為3×106 cells/mL。不同的免疫途徑產(chǎn)生的細(xì)胞免疫應(yīng)答效果不同。本研究通過比較皮下注射和肌肉注射兩種免疫途徑，選擇皮下注射作為該疫苗的免疫途徑。本文通過對(duì)刺激物、細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞接種濃度、免疫途徑的摸索，建立了檢測(cè)該新型減毒HSV-2疫苗細(xì)胞免疫水平的IFN-γ ELISpot方法，為后續(xù)研究該疫苗的免疫效果奠定了基礎(chǔ)。

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Establishment of IFN-γ ELISpot Assay for a NewAttenuated HSV-2 Vaccine

XU Yiyan1， HE Qian2， CAI Linkang2， LIU Binlei1

（1 School of Bioengineering and Food， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068，China；2 Wuhan Binhui Biotechnology Co.， Ltd， Wuhan 430073，China）

Abstract： The IFN-γ ELISpot method was established to detect the cellular immune level of a novel attenuated HSV-2 vaccine by comparing the experimental conditions such as different stimulators， cell culture time， cell inoculation concentration， and immune pathway. C57BL/6 mice were immunized with the novel attenuated HSV-2 vaccine， and strengthened on the 14th day. Spleen lymphocytes were isolated on the 21st day. The cellular immune level of the vaccine was detected by IFN-γ ELISPOT assay. The results show that the optimal stimulator of experimental hole is Ultraviolet inactivation HSV-2 particles （1×108CCID50/mL）， the optimal cell culture time is 24-48 h， the optimal cell concentration is 3×106cells/mL， the optimal immune route is subcutaneous injection. The IFN-γ ELISpot assay for the vaccine was established， which provides a method for detecting the cellular immune level of the vaccine.

Keywords： ELISpot； cellular immunity； IFN-γ

［責(zé)任編校： 張 眾］