茯苓對(duì)大鼠腎源性水腫的影響

［摘 要］ 為研究茯苓對(duì)大鼠腎源性水腫的影響，探討茯苓治療腎源性水腫的可能機(jī)制，將150只SD級(jí)大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（12只）和模型組（138只），使用阿霉素對(duì)模型組大鼠建立腎源性水腫模型。隨機(jī)將腎源性水腫模型組大鼠分為非給藥模型組，茯苓粉（生、熟、代培）低、高劑量組，茯苓醇提物低、中、高劑量組，茯苓水提物低、中、高劑量組。每組8只，雌雄各半，連續(xù)21 d灌胃給藥。第0，7，14，21天記錄體重變化，第21天取血，通過(guò)Elisa實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠血清IL-2、IL-6、ANP及BNP水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 茯苓粉（生、熟、代培）對(duì)于水腫程度的緩解（體重）和尿蛋白的降低表現(xiàn)出一定作用。茯苓醇提物對(duì)于腎源性水腫大鼠血清ANP、IL-6的降低效果最為顯著，5種茯苓樣品都可以降低腎源性水腫大鼠血清BNP、IL-2的水平。茯苓可以緩解大鼠腎源性水腫，并降低大鼠血清ANP、BNP、IL-2、IL-6的水平，其中高劑量的熟茯苓對(duì)腎源性水腫大鼠尿蛋白緩解效果最好，茯苓醇提物對(duì)于腎源性水腫大鼠血清ANP、IL-6的降低效果最為顯著，說(shuō)明茯苓對(duì)腎源性水腫的治療具有一定的積極作用。

［關(guān)鍵詞］ 茯苓； 腎源性水腫； 白介素； 利鈉肽

［中圖分類號(hào)］ R285" ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］ A

由腎臟疾病導(dǎo)致的全身性水腫被稱為腎源性水腫，為臨床上最常見(jiàn)的水腫[1-2]。腎源性水腫常由腎臟損傷導(dǎo)致尿蛋白上升進(jìn)而引起的低蛋白血癥所導(dǎo)致。臨床上使用激素聯(lián)合利尿劑治療腎源性水腫，通常水腫癥狀可以緩解，但部分患者會(huì)在治療過(guò)程中出現(xiàn)利尿劑抵抗[3]，同時(shí)該方法難以緩解腎臟損傷。中藥在這方面具有很大優(yōu)勢(shì)，其中茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf]是在治療腎源性水腫中應(yīng)用最多的中藥之一，其味甘、淡、性平，歸心、脾、腎、肺經(jīng)，具有滲水利濕、健脾補(bǔ)中、養(yǎng)心安神等功效[4-6]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》稱茯苓為 “上品”，稱其“利小便，淡滲利水道”。茯苓主要成分茯苓多糖，占其干燥菌核的80%左右。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為水的代謝與肺脾腎三臟關(guān)系密切[7]?！毒霸廊珪纺[脹篇提到“凡水腫等證，乃肺、脾、腎三臟相干之病……故其本在腎”。腎源性水腫發(fā)病的根本原因在腎，但也與脾和肺關(guān)系密切?；谥嗅t(yī)對(duì)于腎源性水腫的認(rèn)識(shí)，中醫(yī)治療腎病綜合征所致水腫常以肺脾腎論治，以及“發(fā)汗、利尿”的方式治標(biāo)，通過(guò)“補(bǔ)氣、益腎、健脾”的方式治本[8]。臨床上治療腎源性水腫的藥方（如五苓散[9-11]、茯苓導(dǎo)水方[12]、溫陽(yáng)利水方[13]、真武湯[14]等）常包含茯苓，但是對(duì)于茯苓治療腎源性水腫的作用機(jī)制并不明確。茯苓為兼性寄生菌，其寄生在松木上，傳統(tǒng)種植方法需砍伐大量松木，代培茯苓采用秸稈、木屑、麥麩、玉米粉、碳酸鈣等添加松木屑混勻制成菌袋后接種茯苓菌株培養(yǎng)[15]。該方法可減少松木資源的破壞，縮短生產(chǎn)周期。但代培茯苓還需進(jìn)一步確定其功效是否和傳統(tǒng)方式培養(yǎng)的茯苓一致。故本研究選取生茯苓粉、熟茯苓粉、代培茯苓粉、茯苓醇提物、茯苓水提物，探究其對(duì)大鼠腎源性水腫的影響，旨在為應(yīng)用茯苓及其不同方式提取物開(kāi)發(fā)相關(guān)食品、藥品提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

150只SD大鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，來(lái)源為北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)的IVC籠具中，每籠2只。動(dòng)物房實(shí)行壓差及溫濕度監(jiān)控和自動(dòng)控制，壓差符合國(guó)家規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，溫度控制范圍為20～25℃，相對(duì)濕度控制范圍為40%～70%。籠內(nèi)換氣40次/h以上，光照12 h（明）/12 h（暗）循環(huán)交替至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2 原料及主要試劑

5種茯苓樣品：生茯苓粉（批號(hào)20171101-1）、熟茯苓粉（批號(hào)20171101-2）、茯苓代培粉（批號(hào)20181010）、茯苓水提物（批號(hào)20200511）、茯苓醇提物（批號(hào)20200512），湖北省中醫(yī)院提供及負(fù)責(zé)質(zhì)量分析；阿霉素，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)；大鼠 IL-2 ELISA 試劑盒、大鼠IL-6 ELISA試劑盒、大鼠ANP ELISA 試劑盒、大鼠BNP ELISA 試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉，國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腎源性水腫模型的建立 取體重180～220 g SD大鼠150只，稱取體重隨機(jī)分為對(duì)照組（12只）和模型組（138只）。第1天對(duì)模型組大鼠尾靜脈注射阿霉素4 mg/kg，第7天以同樣方法注射阿霉素3.5 mg/kg。在造模過(guò)程中對(duì)動(dòng)物進(jìn)行一般行為學(xué)觀察。

第12天，隨機(jī)取出8只對(duì)照組大鼠和71只模型組大鼠放置于代謝籠中以收集24 h尿液，并使用迪瑞H-800全自動(dòng)尿液分析儀檢測(cè)尿蛋白含量。

1.3.2 分組及給藥 排除體重偏離平均值過(guò)大及尿蛋白未達(dá)到＋（0.3 g/L）的模型組大鼠后，取104只阿霉素模型大鼠，雌雄各半，稱取體重隨機(jī)分為13組，每組8只，雌雄各4只。13組分別為模型組、生茯苓粉低劑量組（生低組）、生茯苓粉高劑量組（生高組）、熟茯苓粉低劑量組（熟低組）、熟茯苓粉高劑量組（熟高組）、茯苓代培粉低劑量組（代低組）、茯苓代培粉高劑量組（代高組）、茯苓水提物低劑量組（水低組）、茯苓水提物中劑量組（水中組）、茯苓水提物高劑量組（水高組）、茯苓醇提物低劑量組（醇低組）、茯苓醇提物中劑量組（醇中組）、茯苓醇提物高劑量組（醇高組）。

使用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）進(jìn)行配制。茯苓推薦日服用最大量為60 g，采取人與動(dòng)物的體表面積計(jì)算法換算大鼠等效劑量。茯苓粉（生、熟、代培）低、高劑量組的給藥劑量分別為0.5 、2.0 g/kg，茯苓水提物低、中、高劑量組分別為0.20、0.40、0.80 g/kg，茯苓醇提物低、中、高劑量組分別為0.15、0.30、0.60 g/kg，模型組灌胃等體積0.5%CMC-Na。每天灌胃給藥1次，連續(xù)21 d。

1.3.3 尿檢 在給藥第14天至第16天取出所有大鼠，并放置于代謝籠中收集24 h尿液，使用迪瑞H-800全自動(dòng)尿液分析儀檢測(cè)尿蛋白質(zhì)。

1.3.4 血樣處理 采血后，將血樣室溫放置2 h，使用1000 g離心15 min，取上清放置于-80℃冰箱待測(cè)。

1.3.5 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn) 參考大鼠ELISA試劑盒說(shuō)明書。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)圖表用軟件GraphPad繪制并分析，同時(shí)在圖中反映出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差（standard deviation，SD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿霉素腎源性水腫模型大鼠體重及尿蛋白的變化

阿霉素腎源性水腫模型大鼠體重的變化見(jiàn)圖1。圖1的結(jié)果顯示，在第0天時(shí)，模型組和對(duì)照組大鼠平均體重基本相同，模型組雄性大鼠在第7天和第14天，平均體重為（243.8±15.0）g和（270.4±18.9）g顯著小于對(duì)照組雄性大鼠的（249.0±24.7）g和（310.0±20.7）g；模型組雌性大鼠表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，在第7天和第14天平均體重為（196.2±9.1）g和（203.1±9.5）g，明顯小于對(duì)照組雌性大鼠的（204.5±7.2）g和（221.2±8.9）g。阿霉素造模后模型組體重明顯小于對(duì)照組，提示阿霉素對(duì)大鼠造成了影響，在體重方面說(shuō)明造模過(guò)程產(chǎn)生了效果。同時(shí)，阿霉素降低大鼠體重的現(xiàn)象與大鼠性別無(wú)關(guān)。

經(jīng)過(guò)阿霉素造模后，模型組尿蛋白含量明顯高于對(duì)照組（表1），對(duì)照組大鼠尿蛋白達(dá)到陽(yáng)性的為1只（12.5%），模型組中達(dá)到陽(yáng)性的為62只（87.3%），提示模型組大鼠腎臟已經(jīng)受到損傷，說(shuō)明使用阿霉素對(duì)大鼠進(jìn)行腎源性水腫模型建立成功。

2.2 不同茯苓樣品對(duì)腎源性水腫大鼠體重及尿蛋白的影響

圖2為給藥期間大鼠體重。模型組、茯苓水提物中劑量組（水中組）、茯苓水提物高劑量組（水高組）、茯苓醇提物低劑量組（醇低組）、茯苓醇提物中劑量組（醇中組）、茯苓醇提物高劑量（醇高組）大鼠體重呈先上升再下降的趨勢(shì)，且對(duì)照組體重上升高于其他組，說(shuō)明茯苓水提物、茯苓醇提物降低了大鼠水腫的程度。而代培茯苓低劑量組（代低組）、代培茯苓高劑量組（代高組）、熟茯苓低劑量組（熟低組）、熟茯苓高劑量組（熟高組）大鼠體重呈先上升后下降而后再次上升的趨勢(shì)，在第14天時(shí)體重最低。生茯苓低劑量組（生低組）、生茯苓高劑量組（生高組）體重相對(duì)平穩(wěn)，變化趨勢(shì)不明顯。

在實(shí)驗(yàn)期間，未見(jiàn)大鼠出現(xiàn)厭食等癥狀。阿霉素腎病的造模機(jī)制和病理過(guò)程為阿霉素引發(fā)的自由基和過(guò)氧化物導(dǎo)致足細(xì)胞基底膜結(jié)構(gòu)和功能被破壞，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，腎小管間質(zhì)炎和纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬及腎功能衰竭。阿霉素腎病不同階段對(duì)應(yīng)的體重為4階段：

1）首先腎臟受到損傷，大量蛋白質(zhì)隨尿液排出，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良，大鼠體重下降或上升緩慢；

2）隨著蛋白質(zhì)被排出，血漿蛋白濃度下降，血漿滲透壓下降，血漿中水分逐漸進(jìn)入組織間隙，進(jìn)而產(chǎn)生水腫，大鼠體重快速上升；

3）緩解期，腎臟功能逐漸恢復(fù)，尿蛋白含量下降，同時(shí)血漿蛋白得到補(bǔ)充，血漿滲透壓上升，組織間隙水分進(jìn)入血液，并通過(guò)尿液排出，大鼠體重下降；

4）恢復(fù)期，大鼠身體狀態(tài)恢復(fù)，體重開(kāi)始上升。

故選擇第14天為治療效果最佳時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析。

如圖3所示，經(jīng)過(guò)14天給藥，在雄性腎源性水腫大鼠中，生茯苓高劑量組（生高組）、熟茯苓粉低劑量組（熟低組）、熟茯苓高劑量組（熟高組）、代培茯苓低劑量組（代低組）、代培茯苓高劑量組（代高組）體重下降明顯，且體重下降程度隨給藥劑量上升而增加，水提物低劑量組（水低組）也有明顯下降。在雌性腎源性水腫大鼠中，熟茯苓低劑量組（熟低組）、熟茯苓高劑量組（熟高組）、代培茯苓低劑量組（代低組）、代培茯苓高劑量組（代高組）中大鼠體重下降明顯。

茯苓給藥第14～16天時(shí)，不同茯苓樣品對(duì)腎源性水腫大鼠尿蛋白的影響如表2所示。

表2結(jié)果顯示，在第14～16天時(shí)，給藥生茯苓、熟茯苓、代培茯苓的大鼠尿蛋白程度較低，且熟茯苓組效果最明顯，生茯苓組次之，代培茯苓高劑量時(shí)具有一定效果。

2.2 茯苓對(duì)腎源性水腫大鼠血清IL-6的影響

各組腎源性水腫大鼠血清IL-6水平分析結(jié)果（圖4）顯示，腎源性水腫大鼠血清IL-6表達(dá)在茯苓醇提物中劑量、醇提物高劑量組和生茯苓高劑量組中顯著下降，其他組別變化不顯著。

2.3 茯苓對(duì)腎源性水腫大鼠血清IL-2的影響

各組腎源性水腫大鼠血清IL-2水平分析結(jié)果（圖5）表明，相比較模型組除生茯苓低劑量組和茯苓醇提物低劑量組以外，大鼠血清IL-2水平都有顯著下降，其中熟茯苓和茯苓水提物的劑量上升將導(dǎo)致大鼠血清IL-2下降幅度減小。在生茯苓、代培茯苓、茯苓醇提物組，大鼠血清IL-2隨劑量的增加表達(dá)下降。

2.4 茯苓對(duì)腎源性水腫大鼠血清ANP的影響

各組腎源性水腫大鼠血清ANP水平分析結(jié)果（圖6）顯示，生茯苓高劑量組、茯苓水提物高劑量組、茯苓醇提物低劑量組、茯苓醇提物中劑量組、茯苓醇提物高劑量組，腎源性水腫大鼠血清ANP水平顯著下降，茯苓水提物高劑量組血清ANP水平顯著上升，其他組別沒(méi)有顯著變化。

2.5 茯苓對(duì)腎源性水腫大鼠血清BNP的影響

各組腎源性水腫大鼠血清BNP水平分析結(jié)果（圖7）顯示，與模型組相比，除生茯苓低劑量組以外，茯苓給藥腎源性水腫大鼠其他組別大鼠血清BNP水平都有顯著降低，其中生茯苓、代培茯苓、茯苓醇提物劑量上升時(shí)腎源性水腫大鼠血清BNP水平顯著下降。熟茯苓和茯苓水提物的劑量變化對(duì)大鼠血清BNP表達(dá)影響不大，但與模型組相比顯著下降。

3 討論與結(jié)論

茯苓粉（生、熟、代培）對(duì)于水腫程度緩解（體重）和尿蛋白降低表現(xiàn)出一定作用。茯苓醇提物對(duì)于腎源性水腫大鼠血清ANP、IL-6的降低效果最為顯著，5種茯苓樣品都可以降低腎源性水腫大鼠血清BNP、IL-2的水平。茯苓粉劑成分豐富，作

用效果更加全面；茯苓提取物（水、醇）成分相對(duì)較少，效果針對(duì)性更強(qiáng)。

在本研究中，大鼠血清IL-2和IL-6都有不同程度降低，說(shuō)明炎癥已經(jīng)被緩解。ANP和BNP為降水利尿的重要分子，經(jīng)過(guò)治療后血清ANP和BNP水平下降，說(shuō)明大鼠體內(nèi)滲透壓已恢復(fù)正常水平，體現(xiàn)了茯苓對(duì)腎源性水腫的治療作用。

茯苓中最主要成分是多糖類和三萜類物質(zhì)[16-17]，還含有二萜類、甾醇類等物質(zhì)[18-19]。其中：多糖類物質(zhì)可分為均一多糖和雜多糖；三萜類物質(zhì)主要有開(kāi)環(huán)羊毛甾烷型、脫氫羊毛甾烷型、羊毛甾烷型、開(kāi)環(huán)齒孔甾烷型、齒孔甾烷型、羊毛甾二烯型[18]。Nukaya H[20]等從茯苓醇提物中分離出可以抑制小鼠耳水腫的3β，16α-二羥基木糖-7，9（11），24-三烯-21-伊斯蘭酸、16α-羥基脫氫乙酰膽酸、16α-羥基曲馬酸和脫氫纖維素酸。YY Zhao等[21]發(fā)現(xiàn)茯苓皮乙醇提取物可以顯著增加大鼠尿量及鈉離子排泄。將茯苓皮乙醇提取物繼續(xù)按極性不同分離為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶解物及乙醇提取物的剩余部分，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和正丁醇部分具有顯著的利尿作用，并認(rèn)為其有效成分可能是羊毛甾烷四環(huán)三萜類物質(zhì)[22]。三萜類、二萜類和甾醇類物質(zhì)主要為醇溶性，本研究發(fā)現(xiàn)茯苓醇提物對(duì)于腎源性水腫大鼠血清ANP、IL-6的影響最為顯著，說(shuō)明影響血清ANP、IL-6水平的物質(zhì)可能在三萜類、二萜類和甾醇類中。

Wu Zhenli等[23]發(fā)現(xiàn)茯苓水提物可以降低心衰大鼠水通道蛋白2（AQP2）的表達(dá)及血BNP的水平，并通過(guò)精氨酸升壓素加壓素V2受體蛋白AQP2軸發(fā)揮利尿作用并保護(hù)心臟。So等[24]研究發(fā)現(xiàn)茯苓菌核水提物（WPC）通過(guò)抑制cAMP/PKA和TonEBP/Sgk1信號(hào)通路，阻止AQP2表達(dá)，調(diào)節(jié)腎臟水分平衡。Lee等[25]發(fā)現(xiàn)茯苓菌核水提物（WPC）通過(guò)抑制蛋白尿和腹水來(lái)改善腎病綜合征水通道蛋白和上皮鈉離子通道的表達(dá)，進(jìn)而影響體液調(diào)節(jié)，改善腎臟失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)茯苓水提物可降低腎源性水腫大鼠血清BNP、IL-2水平，與上述研究相符，多糖類主要為堿溶性和水溶性，說(shuō)明降低大鼠血清BNP、IL-2的有效成分可能包含茯苓多糖。綜上所述，茯苓對(duì)腎源性水腫的治療具有一定的積極作用，這為后續(xù)研究提供一些思路。

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Preliminary Study on the Effect of" Poria Cocoson Nephrogenic Oedema in Rats

LIU Kaiwen1，2， FENG Min3，CHENG Wenhua3， SUN Fanzhong3， ZHANG Junlin1，2

（1 School of Biological Engineering and Food Science， Hubei Univ. of Tech.， Wuhan 430068， China;2 Center of Applied Biotechnology， Wuhan University of Bioengineering，Wuhan 430415， China;3" Hubei Provincial Key Laboratory for Applied Toxicology，Wuhan 430070， China）

Abstract： This paper aims to study the effect of" Poria cocos on nephrogenic edema in rats， and to explore the possible mechanism of its treatment. 150 SD rats were randomly divided into control group （12） and model group （138）， and the model was established using doxorubicin. Rats with renal oedema were randomly divided into non-administered model group， with low and high doses of Poria cocos powder （raw， cooked， and cultured）， low， medium and high alcohol extract， and 8 in each group， half of each male and female， for 21d continuously. Weight changes were recorded on day 0，7，14，21， and blood was harvested on day 21， and serum IL-2， IL-6， ANP， and BNP levels were measured by the Elisa assay. Results show that Poria cocos" powder （raw， cooked， and subcultured） had a certain effect on the reduction of oedema degree （weight） and urinary protein， among which cooked Poria cocos powder has the best effect. Poria cocos alcohol extract had the most significant effect on reducing serum ANP and IL-6 in rats with nephrogenic oedema， and all five" Poria cocos samples could reduce the levels of serum BNP and IL-2 in rats with nephrogenic oedema. Poria cocos can relieve nephrogenic edema in rats and reduce the levels of serum ANP， BNP， and IL-2 and IL-6. Among them， high dose of cooked Poria cocos had the best effect on relieving urinary protein in rats with nephrogenic edema， and Poria alcohol extract had the most obvious effect on reducing serum ANP and IL-6 in rats with nephrogenic edema." indicating that it has a positive effect in the treatment of nephrogenic edema.

Keywords： poria cocos; nephrogenic edema; interleukin; natriuretic peptide

［責(zé)任編校： 張 眾］