類器官在肺部疾病研究中的運(yùn)用

李彥軍,劉楊青,章培軍,王 健,王宇星,張年萍

(1.大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)研究所,山西 大同 037009;2.山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系,山東 濟(jì)南 250013)

半個(gè)世紀(jì)前一項(xiàng)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)證明了脊椎動(dòng)物細(xì)胞的巨大自組織能力。即使在完全解離的條件下,細(xì)胞也可以重新聚集并重建器官的原始結(jié)構(gòu)。近年來,這一神奇的特征被用于從組織或干細(xì)胞中重建部分器官甚至完整的器官。這種源自干細(xì)胞的3D培養(yǎng)物稱為類器官。近來類器官技術(shù)的研究受到了科學(xué)界極大的青睞和期待。在哺乳動(dòng)物中研究組織和器官生物學(xué)非常具有挑戰(zhàn)性,特別是在人類中,由于樣本的可及性和倫理問題,進(jìn)展可能會(huì)受到阻礙。因此,類器官的出現(xiàn)進(jìn)一步推動(dòng)了疾病的發(fā)生發(fā)展、藥物的篩選、基礎(chǔ)研究以及再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的探索。在過去十年中,類器官技術(shù)得到了顯著發(fā)展。通過使用類器官技術(shù)培養(yǎng)得到的組織,在微米到毫米尺度上捕獲了真實(shí)器官具備的一些細(xì)胞、解剖及功能標(biāo)志。目前研究人員開始從其他領(lǐng)域(例如生物工程、化學(xué)、物理)中汲取靈感,以產(chǎn)生更適合實(shí)際應(yīng)用且更具生理相關(guān)性的類器官。毫無疑問,這項(xiàng)技術(shù)為未來科學(xué)的發(fā)現(xiàn)創(chuàng)造了一個(gè)充滿可能的世界,但目前這一技術(shù)仍存在一些弊端,類器官能否真正應(yīng)對挑戰(zhàn)仍是一個(gè)謎。

肺是人體呼吸系統(tǒng)中最重要的器官,承載著呼吸、免疫、肺循環(huán)等多種重要的功能。當(dāng)肺部發(fā)生病變時(shí),往往給患者帶來很大的痛苦。探究肺部疾病的發(fā)生發(fā)展,對于臨床上治療肺部疾病有很大的幫助。但傳統(tǒng)的研究方法存在無法克服的缺陷,阻礙了進(jìn)一步探究肺的特性及相關(guān)疾病的深入認(rèn)知。肺類器官技術(shù)作為一種新穎的方法問世,可進(jìn)一步幫助人們更好地認(rèn)清疾病,并尋求更加合適的治療方法。肺類器官是目前最接近實(shí)際肺器官的模型,它很好地再現(xiàn)了肺的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞類型。近年來,肺類器官成為人類肺部疾病建模、藥物篩選和個(gè)性化治療等的有力工具。

1 肺類器官建立

肺由一個(gè)高度分支的管道系統(tǒng)組成,復(fù)雜的管道將空氣帶入肺泡,在肺泡進(jìn)行氣體交換。肺的近端和遠(yuǎn)端區(qū)域包含專門用于不同功能的上皮細(xì)胞:傳導(dǎo)氣道中的基底細(xì)胞、分泌細(xì)胞和纖毛細(xì)胞以及肺泡內(nèi)的Ⅱ型和Ⅰ型細(xì)胞。肺類器官可以從胚胎干細(xì)胞(ESCs)、成體干細(xì)胞(ASCs)或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)中建立[1]。目前建立的肺類器官模型主要有以下四種類型:①由ASCs形成的肺類器官;②由iPSCs和ESCs誘導(dǎo)分化得到的肺類器官;③基于AT2細(xì)胞培養(yǎng)的3D模型;④類器官衍生的氣液界面(ALI)培養(yǎng)模型。

研究報(bào)道美國一個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)借助干細(xì)胞成功培養(yǎng)出迄今為止最接近人體肺結(jié)構(gòu)的類器官,其擁有肺的所有細(xì)胞類型。為了概括肺特定的結(jié)構(gòu)特征和有效的氣體交換,可以通過使用配備氣液界面的微流體裝置來模擬肺結(jié)構(gòu)和功能的復(fù)雜性。目前,微流體裝置和肺類器官被移植在一起,以實(shí)現(xiàn)對類器官培養(yǎng)條件的精確控制。這種組合平臺(tái)有助于進(jìn)一步準(zhǔn)確模擬肺部周圍的復(fù)雜組織微環(huán)境[2]。微型裝置可以有效地概括人體肺泡中微生物感染正常細(xì)胞的免疫反應(yīng),還可用于在機(jī)械刺激時(shí)通過高分辨率顯微成像實(shí)時(shí)可視化這些細(xì)胞反應(yīng)[3]。

腫瘤類器官是利用腫瘤組織培養(yǎng)出來的3D微模型,能很好地再現(xiàn)來源腫瘤組織的結(jié)構(gòu)和功能[4]。腫瘤類器官可以彌合二維癌細(xì)胞系和基于動(dòng)物的模型系統(tǒng)之間的差距。開發(fā)有效的癌癥治療方法需要與生理相關(guān)的體外模型來概括腫瘤的復(fù)雜特征。癌組織起源球體系統(tǒng)已應(yīng)用于肺癌細(xì)胞的原代培養(yǎng)[5]。源自正常組織的類器官也可以用于誘導(dǎo)或者基因編輯模擬肺癌的發(fā)生發(fā)展。Park等[6]從人類支氣管上皮細(xì)胞中建立了類器官,并利用基因編輯技術(shù)上調(diào)c-Myc、Bcl2等基因的表達(dá),隨后再接種到免疫缺陷的小鼠體內(nèi),結(jié)果顯示小鼠肺部產(chǎn)生腫瘤?；颊叩幕顧z或者切除的組織可以體外培養(yǎng)出模擬原始癌癥組織的類器官[7]。微流體平臺(tái)有助于建立類器官研究模型,通過控制氧濃度、機(jī)械因素和化學(xué)藥物濃度來了解與腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和藥物代謝相關(guān)的腫瘤微環(huán)境[8]。此外,微流體的培養(yǎng)系統(tǒng)可以培養(yǎng)出與原始肺腫瘤相似的肺腫瘤類器官,以此實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的個(gè)性化藥物測試并改善治療策略[9-10]。與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)系比較,腫瘤類器官培養(yǎng)系最大的不同之處是增加了基質(zhì)膠,其目的是為了模擬細(xì)胞外基質(zhì)[11]。近年來腫瘤類器官的培養(yǎng)體系由特定的培養(yǎng)基與基質(zhì)構(gòu)成。該系統(tǒng)培養(yǎng)基中的主要成分為改良的DMEM/F12、Glu-MAX、HEPES、B27、EGF、HGF、N2、FGF7、FGF10、Primocin、Noggin、Wnt3A、Gastrin、R-spondin、青霉素/鏈霉素、煙酰胺、乙酰半胱氨酸、前列腺素E2、神經(jīng)調(diào)節(jié)素1、SB202190(p38抑制劑)、A83-01(TGF-beta抑制劑)與Y27632(Rho 激酶抑制劑)等。

2 類器官在不同肺部疾病中的運(yùn)用

2.1慢性阻塞性肺疾病(COPD):COPD是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病。世界衛(wèi)生組織《全球衛(wèi)生估計(jì)》公布COPD是全球第三大死因,僅2019年造成323萬人死亡。在我國慢性阻塞性肺疾病有著較高的發(fā)病率[12],疾病負(fù)擔(dān)不可忽視。已經(jīng)有研究表明,炎性反應(yīng)機(jī)制、蛋白酶-抗蛋白酶失衡機(jī)制和氧化應(yīng)激等機(jī)制共同作用,產(chǎn)生小氣道和肺氣腫兩種重要病變,兩種病變作用造成COPD特征性的持續(xù)性氣流受限。肺上皮受損是COPD主要的病理生理因素,針對肺上皮的修復(fù)或再生藥物的開發(fā)研究是COPD的治療前景策略,已有研究報(bào)道WNT 信號通路可能是藥物開發(fā)及研究的潛在藥物靶點(diǎn)[13-14]。WNT信號通路在干細(xì)胞自我更新、組織穩(wěn)態(tài)和許多器官的傷口修復(fù)中起著的重要作用[15-16]。Huang等[17]通過建立不同的精密切割肺片(PCLS)模型和肺類器官模型,闡明WNT-5A 和 WNT-5B 能夠抑制成纖維細(xì)胞和上皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)肺類器官的形成,其中WNT-5B對肺類器官肺泡上皮祖細(xì)胞的生長和分化的抑制更加明顯。Wnt/β-catenin信號活性在COPD患者肺上皮細(xì)胞中降低,其下調(diào)的機(jī)制包括成纖維細(xì)胞衍生的WNT-5A/5B。

綜上所述,人們可以運(yùn)用類器官進(jìn)一步探尋發(fā)病機(jī)制并尋找能夠有效干預(yù)WNT 信號通路的方法,例如篩選抑制信號通路的藥物等,可能有助于COPD 的肺泡修復(fù)[18]。Ng-Blichfeldt團(tuán)隊(duì)通過培養(yǎng)肺類器官,發(fā)現(xiàn)TGF-β?lián)p害了成纖維細(xì)胞形成上皮類器官的能力,表明慢性肺病(如COPD和IPF)持續(xù)的間充質(zhì)TGF-β活化,可能會(huì)導(dǎo)致上皮修復(fù)缺陷,所以激活誘導(dǎo)的缺陷間充質(zhì)-上皮信號可能有助于COPD患者上皮修復(fù)[19]。此外,Benam等[20]設(shè)計(jì)了一種與 ALI 平臺(tái)集成的人體小氣道芯片,用于模擬COPD的加重。該裝置包含多孔 PDMS 膜分隔的上部空氣通道和下部介質(zhì)通道。正常氣道上皮細(xì)胞或COPD上皮細(xì)胞置于膜上,內(nèi)皮細(xì)胞置于對面。上通道空氣流入形成ALI環(huán)境,促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞分化。在用病毒模擬處理后,與芯片上的正常氣道上皮細(xì)胞比較,COPD芯片分泌的細(xì)胞因子,如巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (M-CSF)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)水平顯著增加,表明這些微流體平臺(tái)可以作為識(shí)別 COPD 惡化相關(guān)生物標(biāo)志物的有效工具。使用這種微流體模型,可以篩選出與炎性反應(yīng)相關(guān)的 COPD惡化的最佳藥物,這驗(yàn)證了該平臺(tái)能夠精確評估藥物療效。

2.2特發(fā)性肺纖維化:特發(fā)性肺纖維化(IPF)是間質(zhì)性肺疾病中最為普遍的形式之一,是一種以肺功能進(jìn)行性喪失為特征的疾病。IPF的特征是氣囊周圍的肺組織中纖維化瘢痕形成,最終導(dǎo)致呼吸困難。隨著全球人口老齡化,IPF的發(fā)病率和死亡率也在增加,而生存率卻沒有很好的改善[21]。因此,采用體外培養(yǎng)肺類器官對 IPF進(jìn)行更加精確的分析,可以幫助人們更好的認(rèn)識(shí)這一疾病的發(fā)生發(fā)展并尋找有效的治療策略?；颊咴葱哉T導(dǎo)多能干細(xì)胞的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞作為3D器官培養(yǎng)的新策略可以幫助人們克服原代細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)等困難,并為IPF提供新的精準(zhǔn)治療方法,從而改善患者的生存和生活質(zhì)量[22]。Stabler等[15]將外源性 TGF-β1添加到肺類器官培養(yǎng)體系中,極大的改善 IPF 疾病體外建模的成功率。Surolia等[23]通過觀察來自 IPF 患者的肺類器官,發(fā)現(xiàn)抑制波形蛋白中間絲 (VimIFs)表達(dá)能夠降低肺成纖維細(xì)胞的侵襲性。Schruf等[24]的研究發(fā)現(xiàn),與 IPF 相關(guān)的 9 種細(xì)胞因子混合物,這些細(xì)胞因子在 IPF 支氣管肺泡灌洗液或痰液樣本中表達(dá)上調(diào),其加入能夠很好模擬真實(shí) IPF 肺中的細(xì)胞因子微環(huán)境。Wynn等[25]利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)成功建立了HPS基因突變的人類胚胎干細(xì)胞衍生的肺類器官,同時(shí)他們觀察到 HPS 基因突變的肺類器官和人類 IPF 患者組織樣本之間存在細(xì)胞因子 IL-11上調(diào)的重疊,IL-11上調(diào)是終末期 IPF 纖維化的關(guān)鍵指標(biāo)。上述研究表明,建立纖維化類器官可以概括 IPF 的重要特征,并有助于 IPF 的治療與藥物篩選。

2.3肺癌:癌癥是全世界主要死因之一,2020年導(dǎo)致全球近1 000萬人死亡,其中(就癌癥新病例而言)肺癌以221萬例位居第二位。肺癌在組織學(xué)上主要分為三種主要類型(腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌)和幾種不太常見的類型(包括腺鱗癌和大細(xì)胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌)[26]。盡管研究者對肺癌的各種組織學(xué)亞型中發(fā)生的復(fù)雜基因組畸變研究較多,但對肺癌侵襲性的認(rèn)識(shí)仍然不是很清晰[27-28]。Shi等[11]成功建立了從患者腫瘤和人源腫瘤組織來源移植瘤模型(PDX) 中培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)類器官的方案,為 NSCLC 的藥物測試和生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了很好的研究模型,該模型可以在較短的時(shí)間內(nèi)篩選出合適藥物用于患者的個(gè)性化治療。該模型的成功建立不僅有利于肺癌生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、篩選和驗(yàn)證,而且還有利于快速評估出合適的療法,尤其適用于治療失敗的腫瘤患者使用。Dijkstra等[29]運(yùn)用個(gè)性化癌癥免疫療法,將外周血淋巴細(xì)胞和自體腫瘤類器官共培養(yǎng),可用于富集錯(cuò)配修復(fù)缺陷型非小細(xì)胞肺癌患者外周血中的腫瘤反應(yīng)性 T 細(xì)胞。免疫療法有望從根本上改變癌癥患者的治療方式,已有研究表明,腫瘤類器官可用于在個(gè)性化的離體模型系統(tǒng)中建立,以支持基于T細(xì)胞的療法。

越來越多的研究表明,類器官可以作為評估患者對抗癌藥物篩選的優(yōu)秀模型。來自肺癌患者的類器官可用于高通量藥物篩選以期為每個(gè)患者提供最有效的抗癌藥物或抗癌藥物的最佳組合[30]。Kim等[26]從原發(fā)性肺癌組織中建立了來自五種肺癌亞型的80個(gè)肺癌類器官活生物庫,涵蓋了95%以上的肺癌患者:腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、腺鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌。其建立的肺癌類器官生物庫保持了它們各自親本組織的組織學(xué)和遺傳特征,有潛力用于患者特異性藥物試驗(yàn)和靶向治療和耐藥機(jī)制的概念驗(yàn)證研究。不同遺傳背景來源的肺癌類器官對藥物的敏感性也不相同,已有研究成功培養(yǎng)出具有兩個(gè)基因突變的肺癌類器官,并利用其分析對奧拉帕利的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)具有BRCA2 p.W2619C突變的類器官比具有BRCA2 p.M965I突變的類器官具有更低的奧拉帕尼IC50。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼嚴(yán)重破壞了具有BRCA2 p.W2619C突變的肺癌類器官的結(jié)構(gòu),PDX進(jìn)一步證實(shí)奧拉帕尼抑制腫瘤生長。Barrera-ro dríguez 等[31]開發(fā)了多細(xì)胞腫瘤球體來分析藥物敏感性的變化并確定獲得多細(xì)胞耐藥性所涉及的分子機(jī)制。Jabs等[32]開發(fā)了一種基于自動(dòng)顯微鏡的觀察法,以使用肺癌患者衍生的類器官同時(shí)研究細(xì)胞死亡和生長停滯,這已被用于篩選臨床相關(guān)的肺癌治療藥物。

2.4COVID-19:2019年12月新型冠狀病毒(COVID-19)爆發(fā)。新冠肺炎疫情目前已成為全球重大的公共衛(wèi)生事件,成為威脅全球人類健康、破壞全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)穩(wěn)定的危險(xiǎn)因素。2020年1月,國際病毒分類委員會(huì)將引起COVID-19的新型冠狀病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征病毒2(SARS-CoV-2)。面對這場大流行病,許多科學(xué)家致力于病毒感染機(jī)制、致病機(jī)制以及有效治療方法的探究?？茖W(xué)家們利用非洲綠猴腎細(xì)胞Vero E6、人肺腺癌細(xì)胞Calu-3、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2等2D培養(yǎng)系對病毒的感染機(jī)制、復(fù)制機(jī)制等方面進(jìn)行了研究[33-36]。雖然2D細(xì)胞培養(yǎng)系易于培養(yǎng)和基因編輯,但它們作為單一類型的細(xì)胞系,不能模擬其在實(shí)際組織中的狀態(tài)。動(dòng)物模型ACE2轉(zhuǎn)基因小鼠也用于SARS-CoV-2研究中,但動(dòng)物模型與人之間的物種隔離不能真正反映病毒的入侵和人體免疫應(yīng)答機(jī)制。面對上述兩種模型的不足,人們可以通過建立肺類器官模型,研究COVID-19的發(fā)病機(jī)理并進(jìn)行藥物篩選以尋找最佳治療策略。肺類器官在模擬人類疾病發(fā)生、研究宿主-病原體之間相互作用和藥物篩選方面擁有巨大的前景。大量的臨床數(shù)據(jù)與生物學(xué)研究均表明,SARS-CoV-2主要通過呼吸道感染肺部,輕癥患者表現(xiàn)為輕微的呼吸道癥狀,重癥患者可因肺損傷、多器官衰竭而死亡[37]。COVID-19患者尸檢報(bào)告顯示,SARS-CoV-2能夠感染支氣管上皮中的分泌細(xì)胞、纖毛細(xì)胞、杯狀細(xì)胞以及肺泡中的AT2細(xì)胞[38-39]。在iPSCs或ESCs 誘導(dǎo)分化形成的肺泡類器官中,SARS-CoV-2只侵染AT2細(xì)胞[40]。在ESCs誘導(dǎo)分化形成的支氣管類器官中,大多數(shù)被感染的是纖毛細(xì)胞,少部分被感染的是分泌細(xì)胞[41]。Tindle等[42]提出了一種由成人干細(xì)胞衍生而來,具有近端和遠(yuǎn)端氣道上皮細(xì)胞的人肺類器官模型,該模型具有可傳代、可擴(kuò)增、個(gè)性化等優(yōu)點(diǎn)。來自成人肺類器官 (ALO)、初級氣道細(xì)胞或 hiPSC 衍生的肺泡 Ⅱ 型 (AT2) 肺細(xì)胞被 SARS-CoV-2 感染,以創(chuàng)建 COVID-19 的體外肺模型。結(jié)果顯示,受感染的 ALO很好地概括了 COVID-19 患者衍生的呼吸道樣本在不同隊(duì)列中的轉(zhuǎn)錄組特征,驗(yàn)證了 COVID-19 人肺模型的可行性,能夠用于 COVID-19 發(fā)病機(jī)制與檢驗(yàn)新療法和疫苗有效性的研究。SARS-CoV-2感染人體組織范圍很廣,包括肺、心臟、大腦等組織系統(tǒng)。為研究SARS-CoV-2特異性感染肺的宿主反應(yīng),Tiwari等[43]建立了ipsc來源的3D人類肺類器官,其通過病毒模擬感染肺類器官,發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞高表達(dá)ACE2和TMPRSS2,并允許SARS-CoV-2感染,宿主因子如神經(jīng)蛋白酶-1 (NRP1)、組織蛋白酶L (CTSL1)、纖溶酶和促肽酶相關(guān)肽酶13 (KLK13)在肺類器官模型中均有表達(dá)。在對感染的反應(yīng)中,肺類器官中大多數(shù)固有免疫、細(xì)胞因子/趨化因子和炎性反應(yīng)小體中的關(guān)鍵基因都上調(diào)。例如,免疫相關(guān)基因STAT1/2、IRF7、CCL5、CXCL10、TNF-α、IL-6、IL-8和IFN與患者表達(dá)的臨床結(jié)果一致,證明細(xì)胞因子風(fēng)暴的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肺損傷。并且研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2感染肺類器官激活了炎性反應(yīng)小體通路相關(guān)基因(NLRP3、ASC、IL-18、caspase-1和NLRC4),證實(shí)炎性反應(yīng)小體激活會(huì)導(dǎo)致肺部炎性反應(yīng)和細(xì)胞死亡。此外,他們通過使用刺突蛋白抑制劑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)病毒進(jìn)入是刺突蛋白介導(dǎo)的。

相關(guān)研究建立了一個(gè) hPSC-LOs 平臺(tái),該平臺(tái)包括表達(dá)(SARS-CoV-2 的受體)的 AT2 樣細(xì)胞。該團(tuán)隊(duì)對受感染的類器官進(jìn)行 RNA-seq 分析,結(jié)果顯示細(xì)胞因子/趨化因子信號傳導(dǎo)上調(diào),僅具有適度的干擾素特征,這模仿了在原發(fā)性人類 COVID-19 肺部感染中觀察到的炎性反應(yīng)變化[40,44]。Lamers等[45]建立了支氣管肺泡類器官模型,通過使用低劑量的干擾素lambda 1治療感染SARS-CoV-2的支氣管肺泡培養(yǎng)物,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在減少病毒復(fù)制和傳播方面非常有效,表明病毒對干擾素具有高度敏感性,干擾素是一種可行的治療選擇。

2.5其他疾病:囊性纖維化(CF)是一種常染色體隱性遺傳病,是由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)基因(CFTR)突變引起的?；蚓庉嬍且环N很有前景的CF療法,因此需要一種無需病毒載體、藥物選擇和報(bào)告基因富集的有效模型。近年來有團(tuán)隊(duì)通過比較不同的轉(zhuǎn)染方法發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)電穿孔是最有效的一種。通過使用這種無VDR方法,在野生型誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)中產(chǎn)生dF508、G542X和G551D突變的效率提高了4.8%～27.2%。當(dāng)它應(yīng)用于攜帶dF508突變的患者來源的iPSC時(shí),實(shí)現(xiàn)了超過20%的精確校正率?；蛐Ｕ龑?dǎo)致iPSC衍生的近端肺類器官以及患者衍生的腺癌細(xì)胞系CFPAC-1中CFTR功能的恢復(fù)。這項(xiàng)研究證明了基于基因編輯的療法對單基因疾病CF的可行性[46]。囊性纖維化的疾病建模通常通過利用患者衍生的iPSC來實(shí)現(xiàn)。Mccauley等[47]發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路的周期性調(diào)節(jié)能夠通過NKX2-1+祖細(xì)胞中間產(chǎn)物使人類iPSC快速定向分化為功能性近端氣道類器官。該類器官具有毛喉毒素誘導(dǎo)的腫脹缺陷,可通過基因編輯來糾正疾病突變。在糾正CFTR突變的基因編輯之前和之后,用毛喉毒素處理囊性纖維化患者特異性氣道上皮類器官,校正后的類器官表現(xiàn)出明顯著的腫脹反應(yīng),而患病的類器官表現(xiàn)出很小的腫脹反應(yīng),這意味著囊性纖維化的類器官將能夠?yàn)獒t(yī)學(xué)或藥物療法提供體外模型。

肺結(jié)核由病原性細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染肺部的引起的疾病,結(jié)核病可防可治,肉芽腫是人類結(jié)核病的重要標(biāo)志。許多研究表明,宿主免疫狀態(tài)與肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān),因此深入理解人體對結(jié)核分枝桿菌的免疫反應(yīng)對于制定結(jié)核病的預(yù)防和治療策略至關(guān)重要。人類肺泡類器官可用于研究MTB與肺上皮之間的直接相互作用[48]。近幾年隨著類器官技術(shù)的興起及利用,利用肺類器官作為結(jié)核病研究模型有令人興奮的前景,但是在其被普遍性用作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?仍然存在一些重要的挑戰(zhàn),例如最主要的是在肺類器官的結(jié)構(gòu)中引入免疫細(xì)胞,其才能涵蓋免疫反應(yīng)的復(fù)雜性和基質(zhì)免疫細(xì)胞在體外感染時(shí)的串?dāng)_。

人類基底細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的類器官可以篩選出影響纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞兩者數(shù)量比例的細(xì)胞因子和蛋白質(zhì),因此可能是治療平衡被破壞的疾病如慢性哮喘的潛在治療方法[1]。Sachs等[30]證明氣道類器官(AO)可作為模擬呼吸道合胞病毒(RSV)等病毒感染的很好模型,并提供了病毒蛋白 NS2 對細(xì)胞遷移和融合直接影響的體外證據(jù),證明在類器官模型中研究中性粒細(xì)胞-上皮相互作用的可能性。Wnt/β-catenin信號通路對肺發(fā)育和肺組織穩(wěn)態(tài)起至關(guān)重要的作用,其在人類肺氣腫和小鼠模型的肺泡上皮細(xì)胞中降低。Wnt/β-catenin 信號的異常激活可誘導(dǎo)來自肺氣腫患者的 3D 肺組織培養(yǎng)物的內(nèi)在肺泡修復(fù)。這些研究表明,Wnt/β-catenin信號可以在成人肺氣腫肺中啟動(dòng)細(xì)胞修復(fù)和組織再生,其可作為肺氣腫組織修復(fù)的潛在治療靶點(diǎn)[49]。

3 結(jié)論與展望

肺類器官在許多肺部疾病的研究與應(yīng)用方面具有巨大的潛力,但同時(shí)也存在一些不足之處。肺類器官模型的局限性之一是缺乏微環(huán)境,包括生物力學(xué)刺激、基質(zhì)細(xì)胞、血管和免疫細(xì)胞。這些成分和結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為和肺組織結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮著重要作用,因此微環(huán)境的缺乏導(dǎo)致本研究使用類器官進(jìn)行研究的范圍受到限制。肺類器官技術(shù)還面臨的問題是成功培養(yǎng)的普遍性和重復(fù)性,只有能精準(zhǔn)重復(fù)類器官的培養(yǎng),才能夠證明類器官培養(yǎng)系統(tǒng)的成熟和可控性,才有可能在各項(xiàng)研究領(lǐng)域中推廣運(yùn)用這一技術(shù),即在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,每個(gè)來源相同的類器官都能產(chǎn)生非常相似的特點(diǎn),包括類器官的大小、組成、3D結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)等方面。因?yàn)轭惼鞴俚目芍貜?fù)性等問題,所以該技術(shù)應(yīng)用在藥物研發(fā)中也面臨著許多挑戰(zhàn)。例如,類器官運(yùn)用于藥物篩選時(shí)要求起始條件相同以便獲得更加真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但是培養(yǎng)的類器官通常大小不一致,如果在類器官的形成過程中控制其大小,則可能會(huì)影響其分化等。當(dāng)前肺類器官有機(jī)體培養(yǎng)系統(tǒng)的另一個(gè)主要缺點(diǎn)是使用Engelbreth-holm-swarm (EHS) 小鼠肉瘤細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。盡管 EHS 基質(zhì)作為類器官支持基質(zhì)得到了最廣泛的應(yīng)用,但由于其有未知成分組成的動(dòng)物腫瘤衍生原料,所以具有一些局限性,包括批次間差異和缺乏組織微環(huán)境[50]。因此,使用 EHS 基質(zhì)培養(yǎng)的類器官通常無法預(yù)測藥物測試和疾病機(jī)制研究中精確且可重復(fù)的生物學(xué)結(jié)果[51]。盡管微流體可用于芯片肺,但由 PDMS 膜兩側(cè)的2D細(xì)胞組成的傳統(tǒng)微流體系統(tǒng)在重現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞-ECM 相互作用方面存在局限性,因此芯片肺的使用仍需進(jìn)一步探索。

盡管癌癥類器官有望反映腫瘤間的異質(zhì)性并評估臨床使用中藥物反應(yīng)的變化,但離體敏感性與最終患者結(jié)果之間的聯(lián)系仍有待證實(shí)。此外,在實(shí)現(xiàn)基于癌癥類器官的個(gè)性化醫(yī)療之前,必須考慮腫瘤內(nèi)異質(zhì)性,因?yàn)橥荒[瘤不同部位的癌細(xì)胞群可能表現(xiàn)出不同的藥物敏感性。腫瘤的異質(zhì)性為患者來源的腫瘤類器官成功建立帶來困難與挑戰(zhàn),由于不同類型的腫瘤微環(huán)境的不同,使得不同個(gè)體組織來源的腫瘤類器官建立培養(yǎng)要求不盡相同,因此仍然需要更多的研究去探索各種腫瘤類器官模型最佳的培養(yǎng)方案。目前腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)依然不是很成熟,培養(yǎng)條件相對復(fù)雜,已建立的腫瘤類器官絕大多數(shù)來源于上皮細(xì)胞或組織,能否通過非上皮細(xì)胞或組織來建立與培養(yǎng)腫瘤類器官,設(shè)計(jì)出更簡單、高效的培養(yǎng)方案仍需進(jìn)一步探索[52]。

類器官作為一種具備獨(dú)特優(yōu)勢,有應(yīng)用前景的模型,相信在未來的發(fā)展中有著廣闊的前景。隨著科學(xué)研究的深入,相信未來一定會(huì)將血管、免疫細(xì)胞等成分和結(jié)構(gòu)引入類器官培養(yǎng)體系中,使類器官更加接近人類結(jié)構(gòu)[26]?；瘜W(xué)合成生物材料能夠?yàn)轭惼鞴偬峁┛烧{(diào)節(jié)的物理刺激和機(jī)械張力(例如剛度、幾何形狀),隨著這一新興技術(shù)的崛起,能夠更好地幫助肺部疾病建模[52]。類器官工程未來的另一新方向是將多種類器官融合和共培養(yǎng),這種技術(shù)的實(shí)現(xiàn)可能需要使用微流體和功能性生物材料進(jìn)行,用于整合器官系統(tǒng)和高度精細(xì)的疾病建模[53]。模擬全身綜合藥物反應(yīng)的“多類器官芯片”,將成為提高新藥發(fā)現(xiàn)成功率的新興技術(shù)[54]。此外,來自臨床個(gè)體癌癥患者組成的類器官生物庫可能有助于癌癥治療的個(gè)性化[55]。類器官與免疫細(xì)胞或其他細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)成了下一個(gè)前沿[7]。近年來爆發(fā)的新型冠狀肺炎給人們帶來了很大的傷害,將肺泡類器官和支氣管類器官在不同培養(yǎng)系統(tǒng)中建立,可以為人們更全面地認(rèn)識(shí)SARS-CoV-2和尋找更完美的治療方法帶來新的思路。同時(shí)伴隨著生物醫(yī)學(xué)與材料學(xué)等多學(xué)科的交叉滲透,高通量測序技術(shù)、器官芯片技術(shù)等新技術(shù)的問世,類器官的發(fā)展將會(huì)更加迅猛。隨著研究進(jìn)一步深入,類器官可以在病因?qū)W機(jī)制、精準(zhǔn)治療、藥物篩選等方面更好地為人類服務(wù)。