以組合生物合成策略為導(dǎo)向的C-核苷類多氧霉素的研究

劉元園，李天竹，熊 莉，龔 蓉，陳文青

武漢大學(xué)藥學(xué)院，組合生物合成與新藥發(fā)現(xiàn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071

核苷類抗生素（Nucleoside antibiotics）是一類重要的微生物次級代謝產(chǎn)物，具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒和除草等多種功效，故在醫(yī)藥、化工以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[1-2]；根據(jù)糖苷鍵的差異，可將其分為N-核苷和C-核苷類抗生素[3]。

多氧霉素（polyoxin）由可可鏈霉菌阿蘇變種（Streptomyces cacaoi var. asoeinsis）和金產(chǎn)色鏈霉菌（Streptomyces aureochromogenes）產(chǎn)生[4]，由核苷骨架（nucleoside skeleton）、 氨甲酰多聚草氨酸（carbamoylpolyoxamic acid，CPOAA） 及聚肟酸（polyoximic acid，POIA）構(gòu)成（圖1）。由于多氧霉素與UDP-N-乙酰葡萄糖胺的結(jié)構(gòu)類似，故為幾丁質(zhì)合成酶的競爭性抑制劑，可阻斷真菌細(xì)胞壁的生物合成。因此，對多種植物真菌病害具有良好的防治效果[5]。馬來亞霉素（malayamycin）為重要的C-核苷類抗生素，由馬來西亞鏈霉菌DSM 14072（Streptomyces malaysiensis DSM 14072）產(chǎn)生，因其具有獨(dú)特的全氫呋喃并吡喃雙環(huán)C-核苷結(jié)構(gòu)（圖1），且能有效抑制小麥穎枯病和白粉病等植物病原真菌而被廣泛關(guān)注[6-8]。近期有研究鑒定了S.malaysiensis DSM 14072 中馬來亞霉素的生物合成基因簇，并初步揭示了其生物合成機(jī)制[9]。

圖1 多氧霉素和馬來亞霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式及生物合成基因簇

圖2 多氧霉素、馬來亞霉素和雜合抗生素的核苷骨架生物合成途徑

多氧霉素具有顯著的抗真菌活性，但其結(jié)構(gòu)中N-糖苷鍵的穩(wěn)定性相對較差，會影響其在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用。本研究采用合成策略將馬來亞霉素基因簇中負(fù)責(zé)C-核苷的truD 和malO 基因整合到多氧霉素相關(guān)的突變株中，設(shè)計(jì)合成了新型C-核苷類多氧霉素Ψ-polyoxin L 和Ψ-polyoxin K，為今后基于二者的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合成多重雜合抗生素奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒

E.coli DH10B、E.coli ET12567（pUZ8002）、E.coli BW25113（pIJ790）、S.aureochromogenes YB172、SA1、SA2、S. malaysiensis DSM 14072、長柄鏈格孢菌（Alternaria alternate）和皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum 3071）均保存于本實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒及其特征見表1 所列。

表1 本研究所用質(zhì)粒

1.1.2 工具酶、試劑及藥品

限制性內(nèi)切酶及T4 DNA 連接酶購自New England Biolabs 公司；高保真PrimeSTAR? Max DNA 聚合酶購自Takara 公司；rTaq DNA 聚合酶和DNA Marker 購自鼎國生物；多片段一步法快速克隆試劑盒購自翌圣生物；質(zhì)粒提取和DNA 膠回收試劑盒購自O(shè)mega 公司；甲酸（質(zhì)譜級）和甲醇（質(zhì)譜級）購自上海安譜；相關(guān)培養(yǎng)基購自O(shè)XOID 公司；其他試劑（分析純）均購買國藥。

1.1.3 引物

本研究中所用引物如表2 所列。

表2 本研究所用引物

1.2 常規(guī)方法

大腸桿菌與鏈霉菌的遺傳操作方法分別參考了相關(guān)文獻(xiàn)[13]，常規(guī)分子的克隆操作均按照說明書進(jìn)行。

1.3 鏈霉菌菌株的發(fā)酵、發(fā)酵樣品的生物測定以及LC-MS 檢測

鏈霉菌的搖瓶發(fā)酵方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]，相關(guān)發(fā)酵樣品的處理與生物測定按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行[12]。

1.4 利用PCR-targeting 技術(shù)同框缺失pJTU4774中polA 基因

將pJTU4774（含有阿伯拉霉素抗性）轉(zhuǎn)至E.coli BW25113（pIJ790）后于30 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，后續(xù)具體實(shí)驗(yàn)操作參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 新型C-核苷類多氧霉素的生物合成途徑設(shè)計(jì)

最近研究表明，馬來亞霉素基因簇中有多氧霉素核苷骨架生物合成所需的所有相關(guān)同源基因，并與之一一對應(yīng)。在多氧霉素的合成過程中，以UMP為起始底物，形成含有尿苷的生物合成過程中間體；而馬來亞霉素的生物合成中，以ΨMP 為起始底物，形成含假尿苷的類似中間體。磷酸烯醇式丙酮酰轉(zhuǎn)移酶PolA 催化UMP 形成3'-EUMP，而MalO 則只能接受ΨMP 為底物形成3'-EΨMP，以確保馬來亞霉素中假尿苷結(jié)構(gòu)的特殊性。隨后，在S-腺苷甲硫氨酸自由基蛋白PolH（MalJ）、磷酸激酶PolQ2（MalE）、磷酸水解酶PolJ（MalL）、α-酮戊二酸/鐵依賴加氧酶PolK（MalM）和轉(zhuǎn)氨酶PolI（MalK）的催化下，形成AHOAP（5'-amino-6'-hydroxyoctosyl acid 2'-phosphate）。在多氧霉素中，α-酮戊二酸/鐵依賴加氧酶PolD 通過催化C-C 鍵斷裂將AHOAP 轉(zhuǎn)化為AHAP（Aminohexuronic acid 2'-phosphate）。而在馬來亞霉素生物的合成途徑中，AHOAP 在α-酮戊二酸/鐵依賴加氧酶MalI 和脫氫酶MalB 的共同催化下形成AHHP（5'-amino-6'-hydroxylheptosyl 2'-phosphate）[15-17]。

考慮到多氧霉素和馬來亞霉素核苷骨架生物合成過程的相似性，以及多氧霉素中各結(jié)構(gòu)單元的生物合成相對獨(dú)立，本研究計(jì)劃中斷相關(guān)模塊的生物合成過程。在此過程中，將保留多氧霉素和馬來亞霉素各自生物合成雜合抗生素所需的模塊，并將這些相關(guān)模塊組裝形成目標(biāo)雜合抗生素。

2.2 定向生物合成Ψ-polyoxin L

在前期研究中， 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了S.aureochromogenes YB172 中polF 基因（推測與POIA生物合成有關(guān)）同框缺失和polA 基因被tsr 抗性基因中斷的突變菌株SA2，借助SA2 進(jìn)行Ψ-polyoxin L 的相關(guān)研究。首先將truD 克隆至整合型載體pIB139 獲得質(zhì)粒pIB139/truD。此外，將malO 基因克隆至pJTU968 的NdeI 和EcoRI 酶切位點(diǎn)。然后用MfeI 和EcoRI 酶切獲得帶有紅霉素抗性基因啟動子ermEp*的malO 片段，并將含有ermEp*啟動子的malO 片段克隆至pIB139/truD 的EcoRI 酶切位點(diǎn)上，驗(yàn)證正確后獲得質(zhì)粒pIB139/truD&malO。

將構(gòu)建的質(zhì)粒pIB139/truD&malO 通過屬間接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入突變菌株SA2 中，篩選得到重組菌株SA2::pIB139/truD&malO，命名為PA1。將PA1 和負(fù)對照SA2::pIB139 進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完畢后經(jīng)草酸調(diào)節(jié)pH 至3-4，并以A. alternate 為指示菌測定生物活性，結(jié)果如圖3A 所示：與SA2::pIB139 相比，PA1恢復(fù)了微弱的抗真菌活性，表明PA1 菌株可能產(chǎn)生了具有抗真菌活性的新化合物。隨后進(jìn)行了LCHRMS 檢測分析，相較于SA2::pIB139，重組菌PA1的發(fā)酵液中能檢測到質(zhì)荷比（[M+H]+）為478.139 9的化合物，與Ψ-polyoxin L 的理論值478.141 6 基本一致；其二級斷裂碎片為460.187 1、417.216 9、399.148 7 和288.094 3 等，與Ψ-polyoxin L 的理論斷裂碎片基本一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究成功產(chǎn)生了具有抗真菌活性的新型雜合抗生素Ψ-polyoxin L。

圖3 重組菌株P(guān)A1 代謝產(chǎn)物的生物活性測定與LC-HRMS 檢測分析

2.3 定向生物合成Ψ-polyoxin K

有研究表明，含有完整結(jié)構(gòu)單元的多氧霉素組分相較于不含POIA 結(jié)構(gòu)單元的組分對T. cutaneum等真菌的抑制活性更強(qiáng)[18]。因此，本研究擬將馬來亞霉素中的C-核苷引入含有完整結(jié)構(gòu)單元的多氧霉素組分中以獲得雜合抗生素Ψ-polyoxin K。前期實(shí)驗(yàn)室保藏了S. aureochromogenes YB172 中polA 基因被tsr 中斷的突變菌株SA1，因此將上述構(gòu)建的質(zhì)粒pIB139/truD&malO 通過屬間接合轉(zhuǎn)移SA1 中篩選得到重組菌株SA1::pIB139/truD&malO，命名為PA2。將PA2 和負(fù)對照SA1::pIB139 進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵完畢后經(jīng)草酸調(diào)節(jié)pH 至3-4，以T. cutaneum 為指示菌進(jìn)行生物活性測定，結(jié)果如圖4A 所示：相較于SA1::pIB139，PA2 恢復(fù)了較強(qiáng)的抗真菌活性。LCHRMS 檢測分析顯示：相較于SA1::pIB139，重組菌PA2 的發(fā)酵液中不僅能夠檢測到Ψ-polyoxin L，還能夠檢測到質(zhì)荷比（[M+H]+）為587.1922 的化合物，其二級斷裂碎片為559.170 3、526.317 9、460.130 2、442.002 4、397.0745 和288.095 7 等，與Ψ-polyoxin K 的理論斷裂碎片基本一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組菌株P(guān)A2 定向產(chǎn)生了Ψ-polyoxin L 和Ψ-polyoxin K，并且Ψ-polyoxin K 顯示出了較強(qiáng)的抗真菌活性。

圖4 重組菌PA2 代謝產(chǎn)物的生物活性測定與LC-HRMS 分析

2.4 在重組菌株P(guān)A2 中加倍多氧霉素基因簇提高雜合抗生素的產(chǎn)量

綜合生物活性測定和高分辨質(zhì)譜檢測等手段的應(yīng)用，確定了重組菌株P(guān)A1 能夠產(chǎn)生Ψ-polyoxin L，重組菌株P(guān)A2 不僅能夠產(chǎn)生Ψ-polyoxin K，還能產(chǎn)生少量的Ψ-polyoxin L，但二者產(chǎn)量都較低，限制了目標(biāo)雜合抗生素的開發(fā)與應(yīng)用。因此，本研究擬將多氧霉素相關(guān)結(jié)構(gòu)單元生物合成途徑的基因簇加倍，以期提高目標(biāo)雜合抗生素的產(chǎn)量。在含有多氧霉素完整生物合成基因簇的質(zhì)粒pJTU4774 的基礎(chǔ)上，采用PCR-targeting 技術(shù)將polA 基因進(jìn)行同框缺失得到質(zhì)粒pJTU4774ΔpolA（圖5A）。以polAidF/R 為鑒定引物進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，結(jié)果如圖5B 所示：pJTU4774 的PCR 產(chǎn)物大小為1.44 kb，連上卡那霉素抗性基因neo 后的質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物大小為2.06 kb，而pJTU4774ΔpolA 的PCR 產(chǎn)物大小為0.62 kb，隨后將PCR 驗(yàn)證正確的質(zhì)粒pJTU4774ΔpolA 進(jìn)行測序驗(yàn)證（圖5C）。

圖5 質(zhì)粒pJTU4774ΔpolA 的構(gòu)建及驗(yàn)證

由于pIB139 與pJTU4774 具有相同的抗性，無法同時通過屬間接合轉(zhuǎn)移的方法整合到底盤菌染色體上。因此，本研究采用了分別帶有ermEp*啟動子的truD 和malO 基因，通過Gibson 重組的方式克隆至pJTU4774ΔpolA 的EcoRI 位點(diǎn)上，得到質(zhì)粒pJTU4774ΔpolA/truD&malO。隨后，通過屬間接合轉(zhuǎn)移的方法將其導(dǎo)入SA1 中，篩選得到重組菌株SA1::pJTU4774ΔpolA/truD&malO，命名為PA3（圖6A）。將重組菌株P(guān)A3 和PA2 同批次發(fā)酵，取等量原始發(fā)酵液以T. cutaneum 為指示菌對其進(jìn)行生物活性測定，檢測結(jié)果如圖6B 顯示：重組菌株P(guān)A3 相較PA2 對T. cutaneum 的抑制作用更強(qiáng)，表明PA3發(fā)酵液中相應(yīng)目標(biāo)雜合抗生素的產(chǎn)量相較PA2 有了明顯的提高。進(jìn)一步的LC-HRMS 分析如圖6C-D所示：PA3 中Ψ-polyoxin L 的產(chǎn)量提高到了原來的150%左右，而Ψ-polyoxin K 的相對產(chǎn)量較PA2 提高到了原來的330%左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過加倍多氧霉素生物合成基因簇pJTU4774ΔpolA，能顯著提高目標(biāo)化合物Ψ-polyoxin L 和Ψ-polyoxin K 的產(chǎn)量。

圖6 多氧霉素基因簇加倍重組菌株P(guān)A3 構(gòu)建示意圖及相關(guān)雜合抗生素產(chǎn)量比較

3 討論與結(jié)論

近年來，面對從天然產(chǎn)物中分離新抗生素越來越緩慢和抗生素耐藥性增長等困境，在全面了解天然抗生素生物合成代謝途徑的基礎(chǔ)上，通過組合生物合成策略對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造成為了破解抗生素開發(fā)困境的重要途徑之一[19]。本研究中，依循組合生物合成策略的指導(dǎo)， 以多氧霉素工業(yè)菌S.aureochromogenes YB172 為底盤菌株，通過改造其生物合成途徑并整合馬來亞霉素中負(fù)責(zé)C-核苷結(jié)構(gòu)的基因truD 和malO，首次定向產(chǎn)生了具有C-核苷結(jié)構(gòu)的新型雜合抗生素Ψ-polyoxin L 和Ψpolyoxin K。此外，通過增加多氧霉素生物合成基因簇的拷貝數(shù)，顯著提高了雜合抗生素Ψ-polyoxin L和Ψ-polyoxin K 的產(chǎn)量。這為今后基于多氧霉素和馬來亞霉素等相關(guān)核苷類抗生素設(shè)計(jì)和合成多重雜合抗生素奠定了基礎(chǔ)。