西藏山羊與柴達木山羊精液品質(zhì)分析研究

李玉玲,馬元梅,王 偉,李明亮,張博皓,張 楠,趙春川

(青海省畜禽資源遺傳保護利用中心,青海 西寧 810016)

精液品質(zhì)檢查的主要的目的在于判定精液品質(zhì)的優(yōu)劣,同時為精液稀釋冷凍保存提供依據(jù)。

種公羊精液品質(zhì)的優(yōu)劣能夠直接影響到母羊的受胎率、羔羊的生產(chǎn)性能以及羊場的效益,影響種公羊精液品質(zhì)的因素有很多,如營養(yǎng)、年齡、季節(jié)等,有關這方面的報道已有很多,但還沒有對西藏山羊和柴達木山羊精液品質(zhì)差異的研究。本文以青海省畜禽遺傳資源保護利用中心科研基地飼養(yǎng)的西藏山羊和柴達木山羊的精液品質(zhì)記錄為資料,分析研究其差異,以最大限度地提高種公羊的利用率,為地方畜禽遺傳資源保護提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1主要儀器設備、器械 電子天平、生物相差顯微鏡(日本OLYMPUS TL4)、顯示屏、恒溫加熱板、精子密度儀(卡蘇公司)、程控冷凍儀(法國卡蘇公司)、細管凍精支架、梅香牌恒溫水浴鍋、恒溫箱、冰箱、剪刀和卡蘇公司0.25 mL的微型細管等。

1.2主要試劑 檸檬酸鈉、蒸餾水、姬姆薩染液、磷酸二氫鈉、甲醛、甲醇、甘油、雙蒸餾水、卵黃、果糖等。

1.3試驗動物與飼養(yǎng)管理 選擇兩個品種年齡相當?shù)某赡旯蚋?5只,共計30只進行試驗。試驗羊均來自青海省畜禽遺傳資源保護利用中心科研基地飼養(yǎng)的西藏山羊和柴達木山羊,均為舍飼,健康且無疾病。

1.4采精方法 采精前清潔種公羊體表,清理雜毛,清洗包皮。每周采精2～3次,每次根據(jù)試驗羊只的體質(zhì)狀況連續(xù)排精兩回(間隔時間為15～20 min)。采用真臺羊假陰道法采精,采精室用具用酒精進行清潔、消毒,將假陰道溫度調(diào)節(jié)到36℃～39℃,對氣壓、潤滑劑進行調(diào)試,直至正常。

1.5稀釋液和冷凍液配制

Ⅰ稀釋液:用電子天平準確稱量蔗糖3.7 g、檸檬酸鈉3.7 g、果糖0.5 g等,試劑先用雙蒸水將其溶解,經(jīng)過濾和消毒后為基礎液備用。待冷卻后(室溫)將基礎液的85 mL放于三角燒瓶中,加入卵黃15 mL,用磁力攪拌器充分攪拌均勻,之后每100 mL該溶液中加入5～10萬IU的青鏈霉素。

Ⅱ冷凍液:取88 mL稀釋液Ⅰ和12 mL甘油放于容器中,搖5 min使其充分混合。

1.6精液的稀釋與平衡 精液采集后,將鏡檢合格的精液立即用Ⅰ液按稀釋總量一半的比例進行等溫稀釋,待降溫后將水浴狀態(tài)下儲精杯置于5℃的冰箱內(nèi)平衡3 h。在經(jīng)過第一次稀釋平衡的精液中再加入含冷凍保護劑的等溫Ⅱ液至稀釋總量,然后放入5℃的冰箱內(nèi)繼續(xù)平衡1 h。

1.7細管凍精的制作 按《山羊精液冷凍保存技術操作規(guī)程》進行分裝,水平排放在細管架上放入程控冷凍儀,冷凍7～8 min后投入液氮中。

1.8鏡檢及凍精保存 從制作好的細管凍精中隨機抽取1～3支,在40℃～44℃溫水中解凍13～15 s,然后在顯微鏡下觀察解凍后的活力,活力檢測在0.3以上便可收集保存,否則棄去不用。將制作好的細管凍精裝入凍精袋,標注公羊的品種、凍精數(shù)量、精液活力以及生產(chǎn)日期等信息后便可裝入液氮罐長期保存。

1.9精液品質(zhì)檢查

1.9.1鮮精品質(zhì)檢查 鮮精采集后,先用10 μL 移液搶取出5 μL于載玻片上,蓋上蓋玻片,放入38℃恒溫相差顯微鏡下觀察其活力,再用電子天平稱重法計算出采精量,最后用法國卡蘇公司密度儀測定精子密度。

1.9.2凍精品質(zhì)檢查 將同一批次的細管凍精置于38℃溫度下,用同一時間水浴方法進行解凍,檢查凍后活力。

1.9.3精子畸形率和精子頂體完整率檢查 在400倍光學顯微鏡下檢查精子畸形率,在1 000倍顯微鏡下觀察精子頂體。對精子畸形率和精子頂體完整率進行檢查時,每個抹片至少觀察200以上精子(分左右兩個區(qū)),取兩片的均值。根據(jù)精子頂體的外形和損傷情況,將精子頂體分為4種類型,即:Ⅰ正常:頂體形態(tài)完好,有明顯的頂脊,頂體部分呈均勻一致的紫色,核環(huán)部分呈規(guī)則的月牙形。Ⅱ頂體輕微膨脹:頂脊消失,頂體外援不規(guī)則;頂體部分的染色深淺不一。Ⅲ嚴重膨脹:頂體嚴重膨脹后,其邊緣出現(xiàn)皺褶,有明顯的條紋或者膨大呈冠狀。Ⅳ頂體脫落:頂體部分脫落(頂體形成缺口并脫離或翻轉(zhuǎn))或頂體完全脫落。Ⅰ為正常完好精子,后三種均屬頂體損壞精子。試驗重復3批次以上。

精子畸形率(%)=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%

精子頂體完整率(%)=頂體完整精子數(shù)/總精子數(shù)×100%

1.10精液品質(zhì)指標 精液量、精子密度、精子活力、精子畸形率以及精子頂體完整率。

1.11冷凍精液標準

冷凍精液符合GB20557-2006《山羊冷凍精液》中的要求,即每支細管凍精凍精劑量值≥0.18 mL;活力≥35%;直線前進運動精子數(shù)≥1.5×107個;精子畸形率≤20%;頂體完整率≥40%;細菌數(shù)≤800個。

1.12數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結果用平均數(shù)±標準差(Mean±SE)表示,再用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行處理和分析,以P<0.05作為差異顯著性判斷的標準。

2 結果與分析

2.1西藏山羊和柴達木山羊的鮮精品質(zhì)指標

由表1可知,西藏山羊精液量平均為1.17 mL,柴達木山羊精液量平均為1.65 mL,柴達木山羊精液量高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子活力為69%,柴達木山羊平均精子活力為70.33%,柴達木山羊精子活力高于西藏山羊,二者差異極顯著(P<0.01);西藏山羊平均精子密度為2.763×1010個/mL,柴達木山羊平均精子密度為2.915×1010個/mL,柴達木山羊精子密度高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子畸形率為9.23%,柴達木山羊平均精子畸形為7.08%,柴達木山羊精子畸形率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子頂體完整率為87.03%,柴達木山羊平均精子頂體完整率為91.47%,柴達木山羊精子頂體完整率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05)。精液顏色均為乳白色。

表1 西藏山羊和柴達木山羊的鮮精品質(zhì)指標

2.2西藏山羊和柴達木山羊的凍精品質(zhì)指標

由表2可知,西藏山羊平均精子活力為35.54%,柴達木山羊平均精子活力為37.18%,柴達木山羊凍精精子活力高于西藏山羊,二者差異顯著(P<0.05);西藏山羊平均精子畸形率為13.65%,柴達木山羊平均精子畸形率為11.15%,柴達木山羊凍精精子畸形率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05);西藏山羊平均精子頂體完整率為82.73%,柴達木山羊平均精子頂體完整率為84.92%,柴達木山羊凍精精子頂體完整率高于西藏山羊,二者差異不顯著(P>0.05)。

表2 西藏山羊和柴達木山羊凍精品質(zhì)指標

3 結論與討論

3.1影響種公羊精液品質(zhì)不同的因素很多,如品種、個體大小、飼養(yǎng)管理水平、采精頻率、日照和季節(jié)等。許多研究表明,在同樣的飼養(yǎng)管理條件下,公羊的品種不同,其生產(chǎn)的精液品質(zhì)也不同,有的甚至差異很大。同一品種內(nèi),不同個體之間精液品質(zhì)也會存在很大的差異。本研究發(fā)現(xiàn),在飼養(yǎng)條件相同、健康狀況良好的情況下,西藏山羊精液品質(zhì)次于柴達木山羊。初步判斷可能是由于二者遺傳基因不同所致,具體原因還需進一步研究。

3.2凍精解凍和精液冷凍同樣重要。對冷凍保存的精液,只有用適宜的解凍方法,才能保證其復蘇良好,要避免因操作不當而影響凍精質(zhì)量的評定[3]。只有解凍后活力≥35%,才能保證精液有受胎能力。本試驗中兩個山羊品種的精子在解凍后的活力均高于35%,符合GB20557-2006《山羊冷凍精液》標準。制作凍精應嚴格按照操作規(guī)程進行,必須把控好冷凍精液的每一個環(huán)節(jié),避免因發(fā)生不必要的試驗誤差而影響試驗結果。精子畸形率直接影響體外受精和胚胎移植,接受精子畸形率較高的母羊妊娠幾率較低。本試驗中兩個山羊品種精子畸形率均低于20%,符合GB20557-2006《山羊冷凍精液》標準。