樺褐孔菌多酚類物質的相關研究進展

張慧敏 安芳芳 吳宇圳 鄭永標

（福建師范大學生命科學學院，福建福州 350117）

樺褐孔菌Inonotus obliquus，是一種生長于白樺樹上的藥用真菌[1]，主要生長在北半球北緯40°~50°的地區(qū)，分布于俄羅斯西伯利亞、俄羅斯遠東地區(qū)、北歐、日本北海道、朝鮮、中國黑龍江、中國長白山等地。早在16世紀，北歐、東歐等國家已用樺褐孔菌治療癌癥、糖尿病[1]等疾病，俄羅斯將樺褐孔菌稱為“西伯利亞靈芝”。近年來，韓國、美國等國家將樺褐孔菌提取物加入沐浴露、精華乳、補水面膜、洗發(fā)液、抗皺眼霜等各種美妝產(chǎn)品中，作為抗氧化劑廣泛使用。我國對樺褐孔菌的開發(fā)利用處于起步階段，市場上的產(chǎn)品大多數(shù)為用于泡水的菌塊，由子實體制成的壓片糖果或是代用茶等，少數(shù)為美妝產(chǎn)品，如“稀物集”松茸蘑菇系列、“皙島”白樺茸酵母水等。目前，樺褐孔菌的相關產(chǎn)品存在主要功效成分不明確，化學質量標準有待進一步確定等問題。近年來研究表明，樺褐孔菌含有豐富的多酚類物質，具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抑菌[4]等作用。此外，樺褐孔菌野生資源有限，且人工栽培子實體較為困難。因此，近年來學者常用樺褐孔菌液體深層培養(yǎng)菌絲體及代謝產(chǎn)物來替代野生樺褐孔菌子實體開發(fā)相關產(chǎn)品。筆者總結樺褐孔菌中多酚類物質的化學結構、生物活性、提取工藝及采用液體發(fā)酵技術提高樺褐孔菌多酚類物質相關研究，以期為樺褐孔菌的開發(fā)與利用提供參考。

1 樺褐孔菌多酚類物質的結構鑒定

近年來，學者發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌中含有化學結構多樣的多酚類物質，2007—2021年[5?9]，共報道28種樺褐孔菌多酚類物質（表1、圖1），其中，25種多酚類物質（序號1—25）從子實體中分離得到，3種多酚類物質（序號26—28）從菌核中分離得到。此外，4?羥基?3，5?二甲氧基苯甲酸2?羥基?1?羥甲基乙酯（序號1），2，5?二羥對苯甲酸（序號7），Inonoblins A、B、C（序號17—19）為樺褐孔菌中發(fā)現(xiàn)的新天然化合物。

圖1 樺褐孔菌多酚類物質的化學結構

表1 樺褐孔菌多酚類物質的種類

2 樺褐孔菌多酚類物質的生物活性

2.1 抗氧化作用

樺褐孔菌多酚類物質具有較強的抗氧化能力，能通過清除羥基自由基、抑制脂肪氧合酶活性、淬滅H2O2、抑制脂質過氧化反應等多種途徑發(fā)揮其抗氧化作用[10]。CUI等[11]用80%乙醇提取及冷凍干燥技術在室溫下從樺褐孔菌子實體中獲得多酚類物質提取物，質量濃度為10~50μg/mL，該提取物對過氧化氫誘導的細胞損傷具有較好的保護作用，且質量濃度為50μg/mL的多酚類物質提取物的作用效果與0.4 mg/mL的過氧化氫酶相當。高晗等[12]采用鄰二氮菲?Fe2+氧化法與鄰苯三酚活性測定法，發(fā)現(xiàn)0.2%的樺褐孔菌多酚類物質對羥自由基和超氧自由基的清除率可達69.58%、82.01%。潘林等[13]在超聲?微波協(xié)同萃取法輔助下，用50%乙醇提取樺褐孔菌多酚類物質，發(fā)現(xiàn)提取物對DPPH自由基清除率的IC50值為9.03μg/mL，對羥自由基清除率的IC50值為2.03 mg/mL。上述研究結果表明，樺褐孔菌多酚類物質具有較好的抗氧化活性，具有進一步研究的價值。

高愿軍等[14]用48%乙醇于75℃下浸提樺褐孔菌50 min，得到的粗提物用乙酸乙酯萃取獲得多酚類物質，發(fā)現(xiàn)該多酚類物質可提高昆明種小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶及過氧化氫酶的活性，顯著提高血清中的總抗氧化能力，并可降低小鼠血清中丙二醛（MDA）含量。而蔡建秀等[10]利用無菌級小鼠構建對照試驗，體外抗氧化試驗發(fā)現(xiàn)，4.0 mg/mL樺褐孔菌多酚類物質對H2O2誘導的小鼠紅細胞溶血抑制率為69.65%，與對照組相比，樺褐孔菌多酚類物質可極顯著地抑制小鼠肝勻漿自發(fā)性產(chǎn)生的MDA；體內抗氧化試驗，注射樺褐孔菌多酚類物質的小鼠體內肝組織MDA的產(chǎn)生也受到顯著抑制，抑制率可達66.84%，且小鼠血清與肝勻漿中谷胱甘肽過氧化物酶活性極顯著增強。因此，上述動物試驗表明，樺褐孔菌多酚類物質在體內外均具有明顯的抗氧化作用。具有抗氧化活性的物質不僅能預防衰老，還能預防許多由自由基引起的與老化相關的疾病，對相關產(chǎn)品的開發(fā)具有借鑒作用。

2.2 抗腫瘤作用

樺褐孔菌的多酚類物質具有明顯的細胞毒活性。YUKI等[15]用80%甲醇浸提樺褐孔菌子實體，提取分離的7種多酚類物質（序號1—7）對4種癌細胞（A549、PA?1、HL?60和U937）均具有較強的細胞毒性，但對正常細胞系（IMR90）的細胞毒性較低；其中，3，4?二羥基苯甲丙酮（序號3）對正常細胞的半致死量LD50為272.8μmol/L，對癌細胞PA?1的LD50為12.2μmol/L，具有較好的成藥性。流式細胞儀分析表明，3，4?二羥基苯甲丙酮（序號3）作用于G2/M期，且能通過阻斷I?kBα激酶激活來抑制核因子kB，從而刺激腫瘤壞死因子?α誘導細胞凋亡；進一步構效分析發(fā)現(xiàn)，分子尾部帶有醛或酮的3，4?二羥基苯甲丙酮（序號3）比帶有游離羧基的咖啡酸（序號2）具有更強的抗腫瘤活性。MIZUSHINA等[16]發(fā)現(xiàn)咖啡酸（序號2）和3，4?二羥基苯甲丙酮（序號3）能夠直接與拓撲異構酶Ⅱ結合，抑制其活性（IC50值分別為15μmol/L、10μmol/L），顯著抑制人結腸癌HCT116細 胞 的 增 殖（LD50分 別 為70.0μmol/L、49.4μmol/L），并使細胞周期停止在G2/M期，且呈劑量依賴性。

以上研究結果表明，樺褐孔菌多酚類物質具有誘導腫瘤細胞凋亡和抑制拓撲異構酶Ⅱ活性等作用，具有較大的治療腫瘤潛力，但其作用機制有待進一步研究，也需要通過動物試驗與臨床試驗來進一步評估其抗腫瘤作用。

2.3 抑菌作用

樺褐孔菌多酚類物質有較好的抑菌作用。戴航宇等[17]用50%乙醇，在60℃，料（g）液（mL）比為1∶20的條件下浸提樺褐孔菌子實體粉末，獲得樺褐孔菌多酚類物質對大腸桿菌、葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、沙門氏菌均有抑制活性；當樺褐孔菌多酚類物質質量濃度為10 mg/mL時，對金黃葡萄球菌抑制效果最好，抑菌圈直徑達19.5 mm，比對枯草芽孢桿菌、單增李斯特菌、大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈分別高23.4%、8.9%、18.2%和40.2%，對革蘭氏陽性菌的抑制能力優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

3 樺褐孔菌多酚類物質提取工藝優(yōu)化

對樺褐孔菌多酚類物質的提取工藝優(yōu)化，有利于樺褐孔菌多酚類物質的充分開發(fā)利用。樺褐孔菌多酚類物質的分子結構中有多個酚羥基，極性較大，易溶解于醇、醚、酮類溶劑，乙醇是一種滲透性強、提取率高、毒性小的萃取劑[18]。樺褐孔菌多酚類物質的常用提取溶劑為乙醇?水。高洋等[19]用70%乙醇，料（g）液（mL）比為1∶20，于80℃條件下提取樺褐孔菌多酚類物質，含量達3.2%。張梅梅等[20]通過正交試驗優(yōu)化樺褐孔菌多酚類物質的提取條件，用50%乙醇，料（g）液（mL）比1∶10，提取溫度50℃，浸提時間45 min，多酚類物質的提取率為3.1%。

為了進一步提高多酚類物質的提取率，研究者還采用超聲波與微波輔助技術進一步優(yōu)化提取工藝。梁麗雅等[21]采用超聲波輔助提取樺褐孔菌多酚類物質，通過正交試驗優(yōu)化的最佳工藝為60%乙醇，超聲處理時間30 min，超聲功率500 W，料（g）液（mL）比1∶30，在此條件下提取的多酚類物質對DPPH自由基清除率可達75.39%。董琦等[22]通過微波輔助提取樺褐孔菌多酚類物質，最佳工藝為50%乙醇，料（g）液（mL）比1∶50，微波功率560 W，微波時間180 s，樺褐孔菌多酚類物質提取率為3.19%。樺褐孔菌多酚類物質提取工藝的優(yōu)化為樺褐孔菌產(chǎn)品開發(fā)提供保障。

4 樺褐孔菌多酚類物質發(fā)酵工藝優(yōu)化

樺褐孔菌多酚類物質具有較好的生物活性，在醫(yī)療產(chǎn)品與食品方面具有較好的開發(fā)前景，但樺褐孔菌的野生資源有限，制約樺褐孔菌的相關產(chǎn)品研發(fā)。近年來，通過液體發(fā)酵獲得樺褐孔菌菌絲體并提高多酚類物質含量成為樺褐孔菌的重要研發(fā)方向。

研究表明，通過向培養(yǎng)液中添加5‐氮雜胞苷、木質纖維材料、糙米混合物、激發(fā)子、有機溶劑等，可有效地提高樺褐孔菌液體發(fā)酵產(chǎn)物中的多酚類物質含量。趙艷霞等[23]在培養(yǎng)液中添加100μmol/L的5‐氮雜胞苷，能提高樺褐孔菌菌絲體內與多酚類物質合成相關的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4?香豆酸輔酶A連接酶（4CL）、硬毛素合成酶（SPS）基因的表達水平，改變SPS啟動子區(qū)的組蛋白甲基化修飾，提高組蛋白H3K4、H3K36的甲基化修飾水平，使樺褐孔菌菌絲體細胞內多酚類物質積累量由對照組的28.7 mg/g提高至46.6 mg/g，胞外多酚類物質的體積質量由對照組的66.9 mg/L提高至92.3 mg/L。ZHU等[24]向液體培養(yǎng)液中分別添加木質纖維材料小麥秸稈、甘蔗渣、稻草，使樺褐孔菌胞外多酚類物質質量分數(shù)分別提高106.9%、67.6%、151.2%，胞內多酚類物質質量分數(shù)分別提高26.1%、38.9%、45.3%，三者胞外多酚類物質中的表兒茶素?3?沒食子酸酯、表沒食子兒茶素?3?沒食子酸酯、phelligridin G均顯著增加，此外還大量生成對照培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)的Davallialactone、inoscavin B。王艷梅等[25]將玉米、紅小豆、糙米（1∶1∶1）混合并粉碎至顆粒直徑0.25 mm以下，用該基質培養(yǎng)的樺褐孔菌，多酚類物質質量分數(shù)可達22.48 mg/g。魏志文等[26]在樺褐孔菌液體培養(yǎng)液中加入50μg/L黑曲霉細胞壁碎片作為真菌激發(fā)子，培養(yǎng)的樺褐孔菌菌絲體胞內和胞外多酚類物質體積質量最高為102.15 mg/L、311.91 mg/L；進一步研究表明真菌激發(fā)子能夠顯著提高一氧化氮合酶活性，進而提高一氧化氮的含量，從而提高樺褐孔菌的代謝速率，最終提高多酚類物質的產(chǎn)量。沈夢薇等[27]在樺褐孔菌培養(yǎng)基中添加能夠改變細胞膜通透性的丙酮，進而影響細胞對營養(yǎng)物質的吸收，可提高樺褐孔菌胞內外多酚類物質產(chǎn)量與活性，其中胞內多酚類物質質量分數(shù)達7.84 mg/g，是對照組的2.5倍，且二苯代苦味肼基自由基清除率達85.97%，為對照組的3倍。此外，光照條件對多酚類物質的生成也有影響[28]。

以上研究結果表明，5‐氮雜胞苷、木質纖維材料、糙米混合物、多糖類物質、有機溶劑等誘導劑是提高樺褐孔菌發(fā)酵培養(yǎng)時胞內外多酚類物質含量的有效方法。

5 展望

總結樺褐孔菌多酚類物質的結構、生物活性及提取工藝的研究進展，為樺褐孔菌開發(fā)利用提供參考。樺褐孔菌多酚類物質不僅具有抗氧化、抗腫瘤和抑菌等作用，還具有改善肝臟脂質[29]、抑制肝細胞凋亡[30]、調節(jié)血脂水平[31]、提高外周淋巴細胞的生存能力[32]、調節(jié)血糖[33]、緩解宿醉[34]和延長食用油貨架期[35]等作用，具有較廣闊的市場應用前景。但由于樺褐孔菌野生資源有限，其各類產(chǎn)品的研發(fā)受限制，尤其是基于多酚類物質功能性產(chǎn)品的開發(fā)。采用液體發(fā)酵技術生產(chǎn)菌絲體來代替野生樺褐孔菌，是樺褐孔菌資源利用的重要研究方向。目前通過添加各種誘導劑提高樺褐孔菌多酚類物質總含量的研究取得一些進展，但對提高哪種多酚類物質含量的研究未見報道，今后應加強這方面的研究，為樺褐孔菌資源的高效利用及制定多酚類物質的化學標準提供依據(jù)。另外，多糖與三萜類成分也是樺褐孔菌的主要功效成分，如何與多酚類物質相結合來開發(fā)功能多樣的樺褐孔菌產(chǎn)品，也是樺褐孔菌資源利用的重要領域。