甘蔗渣多酚的超聲輔助提取工藝優(yōu)化研究

張展鵬,慎 璐,李 燦*

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) a.基輔學(xué)院;b.生物工程學(xué)院,山東 濟(jì)南 250353

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)屬于禾本科(Poaceae),喜濕熱,喜光,在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)均有分布,是重要的糖料原產(chǎn)品和全世界第二大生物能源作物[1-3],我國廣西貴族自治區(qū)的甘蔗種植面積居國內(nèi)之首,占全國六成以上[4]。甘蔗是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物,生產(chǎn)數(shù)量在世界范圍內(nèi)可以排進(jìn)前三[5]。近年來,國內(nèi)外許多學(xué)者對甘蔗多酚研究的數(shù)據(jù)顯示,甘蔗多酚具有良好的抗氧化、抑制血糖、降低血脂、抑菌、抗腫瘤等功效[6-8]。侯小濤等[9]對甘蔗多酚進(jìn)行了體外抗菌實(shí)驗(yàn),研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),甘蔗多酚對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌都有著一定的抑制作用,這為甘蔗多酚的抑菌藥用價值提供了基礎(chǔ)。廖澤勇[10]運(yùn)用MTT法檢測后,計算甘蔗葉黃酮類物質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的生長抑制率,實(shí)驗(yàn)顯示葉黃酮類物質(zhì)對六種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用,其中對Hela和Caco-2腫瘤細(xì)胞的抑制效果尤為明顯。

傳統(tǒng)工藝大多使用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取,但是有機(jī)溶劑的消耗量大,提取工藝成本高,對環(huán)境也會造成危害[11-13]。超聲輔助提取技術(shù)作為一種新型的提取方法,基本原理是利用超聲波在提取液中引起的空化現(xiàn)象,加速提取物中目標(biāo)成分的釋放和轉(zhuǎn)移[14-15]。相比于傳統(tǒng)的提取方法,超聲輔助提取多酚技術(shù)具有操作簡便、提取效率高、提取時間短、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)[16]。本文利用單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面法結(jié)合,研究超聲波技術(shù)輔助甘蔗多酚的提取,旨在優(yōu)化甘蔗多酚提取工藝,提高多酚的提取率和純度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

甘蔗渣(烘干粉碎備用);無水乙醇;植物總酚(TP)含量檢測試劑盒(索萊寶生化試劑盒事業(yè)部);酶標(biāo)儀(BioTek Instruments,Inc.);數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司);微型離心機(jī)(美國Andy Bio公司);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

使用植物總酚(TP)含量檢測試劑盒進(jìn)行沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。(標(biāo)準(zhǔn)品5 mg沒食子酸、試劑一Folin-Ciocalteu試劑、試劑二Na2CO3溶液)

取不同質(zhì)量濃度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.625、0.156、0.078、0.039、0.020 mg·mL-1)50 μL,依次加入250 μL試劑一,渦旋混勻2 min后,各加入250 μL試劑二和450 μL蒸餾水,渦旋混勻后靜置10 min,于760 nm處測定吸光度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖1所示,求得回歸方程y=3.946 2x+0.008 4,R2=0.995 6。

1.2.2 甘蔗多酚提取量的測定

甘蔗渣樣品烘干稱重,粉碎,過50目篩(微孔直徑280 μm),稱取1 g,加入適量乙醇溶液,使用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行輔助提取,一段時間后,離心取上清液待測。根據(jù)測沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程,計算樣本質(zhì)量濃度y(mg·mL-1),最終得到甘蔗多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)=y×提取液體積÷樣本質(zhì)量。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

取30 g經(jīng)粉碎過50目篩(微孔直徑280 μm)的甘蔗粉末,選擇合適的液料比,加入一定濃度的乙醇溶液,在特定的水浴溫度和超聲功率下,對其進(jìn)行一定時間的超聲輔助提取。提取結(jié)束后放入離心機(jī)12 000 r/min,25 ℃,離心10 min,取上清液,待測。探究不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)(35%、45%、55%、65%、75%)、不同的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)、不同超聲時間(15、25、35、45、55、65 min)、不同水浴溫度(30、40、50、60、70 ℃)和不同超聲功率(75、85、95、105、115 W)對甘蔗多酚提取量的影響,其中將各因素初始水平固定為乙醇體積分?jǐn)?shù)45%、液料比10∶1 (mL·g-1)、水浴溫度45 ℃、超聲時間25 min、超聲功率95 W。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)各個單因素試驗(yàn)對甘蔗多酚產(chǎn)量的不同影響,使用Design-Expert13軟件,響應(yīng)面Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計原理設(shè)計四因素三水平共29組響應(yīng)面對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析,從而得到甘蔗多酚提取的最佳工藝。響應(yīng)面分析因素表如表1所示。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 影響甘蔗多酚提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多酚提取量的影響

水浴溫度固定45 ℃,液料比10∶1(mL·g-1),在95 W的超聲功率下,將乙醇體積分?jǐn)?shù)作為單變量,分別取值35%、45%、55%、65%、75%,提取25 min。結(jié)果如圖2所示。

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,甘蔗多酚提取量先增加后減少。在乙醇體積分?jǐn)?shù)55%時甘蔗多酚提取量最高,為8.12 mg·g-1;乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%時甘蔗多酚提取量最低,為6.37 mg·g-1。乙醇作為溶劑可以有效的溶解多酚類的化合物。在低濃度下,乙醇體積分?jǐn)?shù)越高,甘蔗多酚的萃取效率越高,但在一定濃度以上,乙醇的萃取效率受到其他因素的制約,如乙醇分子的空間排列和分布密度等,甘蔗多酚的萃取效率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而逐漸降低[17]。因此,提取甘蔗多酚工藝的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對甘蔗多酚提取的影響

2.1.2 液料比對多酚提取量的影響

水浴溫度固定45 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)55%,在95 W的超聲功率下,將液料比作為單因素變量,分別在10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1(mL·g-1)的條件下,提取25 min,結(jié)果如圖3所示。

當(dāng)液料比低于15∶1(mL·g-1)時,隨著提取液的增多,甘蔗多酚的提取率大幅度提高,在液料比數(shù)值較低時,其變化對甘蔗多酚的提取率影響較大。較低的液料比下,甘蔗粉末不能充分地與提取液接觸混勻,減少了甘蔗多酚的溶出,合適的液料比可以促進(jìn)多酚的轉(zhuǎn)移和溶解,從而增加多酚的提取量。然而,過高的液料比會增加溶劑的使用,對產(chǎn)品的分離純化造成影響,有機(jī)溶劑的殘留使多酚應(yīng)用受限,也會導(dǎo)致成本過高。液料比超過15∶1(mL·g-1)后,甘蔗多酚的提取率開始逐漸下降,當(dāng)液料比到達(dá)25∶1(mL·g-1)后,對于甘蔗多酚的提取率影響十分微弱。因此,甘蔗多酚最佳提取液料比為15∶1(mL·g-1)。

圖3 液料比對甘蔗多酚提取的影響

2.1.3 超聲時間對多酚提取量的影響

水浴溫度固定45 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)55%,液料比為15∶1(mL·g-1),在95 W的超聲功率下,將超聲時間作為單因素變量,分別超聲15、25、35、45、55、65 min,進(jìn)行提取,結(jié)果如圖4所示。

從超聲時間15 min開始,甘蔗多酚的提取量逐步增加,一直到35 min時達(dá)到峰值為7.05 mg·g-1,適當(dāng)?shù)某晻r間可以增加多酚與溶劑之間的物質(zhì)傳遞速率,促進(jìn)多酚的提取。而后隨著時間的增加,甘蔗多酚的提取量開始下降,在65 min時最低為4.74 mg·g-1。在35 min時甘蔗多酚的提取已經(jīng)達(dá)到飽和,繼續(xù)進(jìn)行超聲,超聲波能量的累積和吸收會引起提取液中溫度的升高、壓力的變化等多種復(fù)雜作用,對甘蔗多酚的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響,致使甘蔗多酚降解。過長的時間也會導(dǎo)致甘蔗多酚的氧化,最終產(chǎn)量有所損失。這些因素相互作用造成甘蔗多酚提取量的變化,在使用超聲波技術(shù)輔助提取時,選取超聲時間要考慮多酚的穩(wěn)定性,避免過度超聲造成不利影響。因此,甘蔗多酚提取工藝的最佳提取時間為35 min。

圖4 時間對甘蔗多酚提取的影響

2.1.4 水浴溫度對甘蔗多酚提取的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)55%,液料比15∶1(mL·g-1),在95 W的超聲功率下,將水浴溫度作為單因素變量,分別在30、40、50、60、70 ℃的溫度下,提取35 min,結(jié)果如圖5所示。

隨著溫度的升高,甘蔗多酚的提取量增加明顯。因?yàn)闇囟鹊纳呖梢源龠M(jìn)乙醇分子與甘蔗中多酚分子之間的相互作用,從而提高多酚分子的溶解度和滲透性,有利于多酚的溶解和擴(kuò)散[18]。在50 ℃時,提取量達(dá)到了最大值為10.84 mg·g-1。但是在超過50 ℃之后,溫度提高,多酚的提取率卻開始下降,降低幅度相較于之前上升幅度顯著減小,在長時間的高溫下,多酚受熱發(fā)生反應(yīng)生成其他物質(zhì)[19]。因此,甘蔗多酚提取工藝的最佳提取溫度為50 ℃。

2.1.5 超聲功率對多酚提取量的影響

水浴溫度50 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)55%,液料比15∶1(mL·g-1),將超聲功率作為單因素變量,分別在75、85、95、105、115 W的功率下,提取35 min,結(jié)果如圖6所示。

甘蔗多酚的提取量隨著超聲功率的增大而增多,在105 W處達(dá)到最高點(diǎn),多酚提取量為17.35 mg·g-1,繼續(xù)增大超聲功率,多酚提取量開始下降。超聲波作用可以引起植物細(xì)胞壁的物理破碎,釋放多酚類化合物。同時細(xì)胞液內(nèi)部會產(chǎn)生劇烈的液流和振動,增加了料液間的質(zhì)量傳遞,促進(jìn)了甘蔗多酚的溶解和擴(kuò)散,在空化作用下甘蔗多酚更快的進(jìn)入溶劑[20-21],導(dǎo)致甘蔗多酚的提取量增加。但是當(dāng)超聲功率過大時,反而會對物質(zhì)產(chǎn)生破壞[22-23],影響甘蔗多酚的提取效率。超聲功率的選擇應(yīng)根據(jù)具體的提取物質(zhì)、設(shè)備性能和工藝要求進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。過低的功率可能導(dǎo)致提取效果不理想,而過高的功率可能導(dǎo)致不良反應(yīng)或能源浪費(fèi)。在實(shí)際操作中,需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn),確定最佳的超聲功率條件以實(shí)現(xiàn)最佳的多酚提取效果。因此,甘蔗多酚提取工藝的最佳超聲功率為105 W。

圖6 超聲功率對甘蔗多酚提取的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表2為29組試驗(yàn)的結(jié)果,對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析整理,得回歸模型方程為:Y=17.88+0.809 0A-3.17B+0.300 9C-0.197 3D-0.858 3AB+0.458 7AC+0.014 8AD+0.429 1BC+0.269 1BD+0.222 0CD-5.78A2-1.88B2-3.31C2-2.27D2

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析

表3(續(xù))

圖7所示為使用Design-Expert軟件,通過對上述回歸方程模型進(jìn)行分析,所得的各個因素交互影響甘蔗多酚產(chǎn)量的三維響應(yīng)面圖。在響應(yīng)面的分析中,曲面坡度和等高線是兩個非常重要的指標(biāo),用于反映因素的影響程度和交互作用的強(qiáng)度。曲面坡度是指響應(yīng)面模型的曲率程度,即響應(yīng)變量在不同因素取值下的敏感程度。如果曲面坡度越陡峭,說明響應(yīng)變量對該因素的變化越敏感,該因素對響應(yīng)變量的影響越大。相反,如果曲面坡度越平緩,則說明該因素對響應(yīng)變量的影響越小。等高線則用于反映兩個因素之間的交互作用程度。如果等高線呈橢圓形且曲線密集,則表明兩個因素之間的交互作用對響應(yīng)變量的影響顯著。反之,如果等高線呈圓形且曲線稀疏,則說明兩個因素之間的交互作用對響應(yīng)變量的影響不顯著。如圖7所示,交互項(xiàng)CD(水浴溫度與超聲功率)的等高線近似于圓形,交互項(xiàng)BC(液料比與溫度)和交互項(xiàng)BD(液料比與超聲功率)的響應(yīng)面坡度較緩,說明其響應(yīng)量變化較小,交互作用均不顯著,這與上述方差分析的結(jié)果一致。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化最佳工藝驗(yàn)證

使用響應(yīng)面軟件對甘蔗多酚提取工藝的最佳條件進(jìn)行預(yù)測,得最適條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58.215 8%、液料比10.853 9∶1(mL·g-1)、水浴溫度49.334 ℃、超聲功率103.075 W。在此條件之下,甘蔗多酚提取量理想值為19.097 4 mg·g-1。將預(yù)測數(shù)據(jù)可行化,即乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、液料比11∶1(mL·g-1)、水浴溫度49 ℃、超聲功率103 W,在此條件下做三次平行試驗(yàn),進(jìn)行驗(yàn)證,得到甘蔗多酚提取質(zhì)量的平均值為18.87 mg·g-1,與預(yù)測值接近,表明該響應(yīng)面模型真實(shí)、準(zhǔn)確、有效。

3 結(jié) 論

我國的甘蔗資源充足,價格低廉,甘蔗渣作為甘蔗加工過程中的副產(chǎn)品,鮮有科研人員進(jìn)行研究?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明,甘蔗多酚在調(diào)節(jié)免疫和控制血糖方面具有良好功效,值得進(jìn)一步開發(fā)利用。在本研究中,經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面設(shè)計,使甘蔗多酚的提取工藝得到優(yōu)化,影響甘蔗多酚提取量的4種主要因素影響力由大到小分別為:液料比(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、水浴溫度(C)、超聲功率(D)。優(yōu)化后的方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、液料比11∶1(mL·g-1)、水浴溫度49 ℃、超聲功率103 W,超聲時間35 min,測得甘蔗多酚產(chǎn)量18.87 mg·g-1。相比較于傳統(tǒng)提取方法,該方法提取效率高,顯著地縮短了提取周期,并且操作簡單,易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn),為甘蔗多酚的提取提供了依據(jù)。

根據(jù)報道顯示,不同品種甘蔗的甘蔗多酚存在差異,個別品種的甘蔗多酚產(chǎn)量要明顯高于其他。導(dǎo)致這種差異的因素有很多,例如甘蔗生長環(huán)境的不同,基因品種不同,生長時間不同等。因此需要更多的研究來確定這些因素對甘蔗多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響,并開發(fā)出適當(dāng)?shù)姆N植和加工方法來提高甘蔗多酚的含量,有助于降低成本,提高生產(chǎn)效率,從而促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。