菠蘿泛菌與水稻白葉枯病菌雙重PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

徐會永 楊雪 臧號昱 潘銳 谷春艷

關(guān)鍵詞：菠蘿泛菌；白葉枯病菌；雙重PCR

由水稻黃單胞菌XanthorrLonas oryzae pv．or3lzae引起的水稻白葉枯病是水稻上常見的一種細(xì)菌性病害，與稻瘟病、水稻紋枯病并稱水稻三大病害，一般引起減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致減產(chǎn)50%以上。而近年來在世界多國的水稻上發(fā)現(xiàn)一種由菠蘿泛菌Pantoea ananatis引起的新型細(xì)菌病害，其癥狀與白葉枯病類似，病斑沿葉尖擴(kuò)展，稻葉失水干枯，在我國多省也相繼報(bào)道了該病害，其侵染性強(qiáng)、致病率高、危害性大，造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)。

在實(shí)際生產(chǎn)中，這兩種細(xì)菌性病害發(fā)生時(shí)期相近、病癥相似，難以準(zhǔn)確分辨且存在混發(fā)的情況，增加了防治難度。目前單一針對白葉枯病菌或菠蘿泛菌的PCR檢測方法已有報(bào)道，但這兩種病害的雙重PCR檢測方法尚未見報(bào)道。因此，建立一種簡便、快速、靈敏度高的雙重PCR檢測方法，明確致病菌種類對于病害的防治具有重要的意義。

泛菌屬看家基因acnA編碼順烏頭酸酶（aconi-tate hydratase），本研究利用生物信息學(xué)的方法對acnA基因進(jìn)行序列比對，設(shè)計(jì)了22對特異性引物，分別與已知的白葉枯病菌檢測引物X0080進(jìn)行配對并篩選，建立了一種雙重PCR檢測方法。該方法可同時(shí)檢測樣品中是否含有白葉枯病菌和菠蘿泛菌，為水稻種子檢測、田間監(jiān)測及制定針對性的防治措施提供技術(shù)支撐。

1材料和方法

1.1供試菌株

供試菠蘿泛菌HQOI為本實(shí)驗(yàn)室2021年于安徽省霍邱縣田間分離并保存，其余參試菌株（表1）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2DNA提取

本研究中所有菌株均使用NB培養(yǎng)基培養(yǎng)（每升含牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母提取物1.0g，蔗糖10.0g，pH7.0～7.2，其中固體培養(yǎng)基中含15.0g瓊脂粉）。將供試菌株劃線培養(yǎng)于NB固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)2d后，挑取單菌落于NB液體培養(yǎng)基中，180r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（艾科瑞，AG21007）操作說明提取DNA。

1.3引物設(shè)計(jì)

通過基因測序得到菠蘿泛菌HQO1中acnA的基因序列，同時(shí)下載NCBI（www．ncbi．nlm．nih．gov）公布的其余泛菌屬acnA基因序列，通過DNA-MAN軟件進(jìn)行序列比對，分析7種菌的差異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物（表2）。

1.4雙重PCR檢測方法的建立

PCR反應(yīng)體系：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）（艾科瑞，AG11112）12.5uL，20umol/L上、下游引物各0.5uL，20umol/L X0080上、下游引物各0.5uL，模板DNA 1uL，ddH90 9.5uL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃變性30s；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶判斷檢測結(jié)果。

為了測試雙重PCR檢測方法的靈敏度，選用菠蘿泛菌與白葉枯病菌的DNA作為模板進(jìn)行梯度檢測。設(shè)定2種DNA的初始濃度各為100ng/uL，并按10倍梯度依次稀釋，所得到的DNA作為模板，后續(xù)檢測方法同上。

1.5水稻樣品檢測

種子處理：稱取10g水稻種子置于容器中，加入15mL無菌水浸沒種子，靜置2h后吸取上清液作為待測樣品，通過建立的雙重PCR檢測方法進(jìn)行檢測。

葉片處理：選取病健交接處的葉片置于培養(yǎng)皿中，加入無菌水漂洗2次，加入75%乙醇浸泡處理15s后用無菌水漂洗2次，用滅過菌的剪刀剪成小段放入1.5mL離心管中，研磨破碎后加入無菌水，2h后吸取上清液作為待測樣品，通過建立的雙重PCR檢測方法進(jìn)行檢測。

2結(jié)果與分析

2.1差異位點(diǎn)篩選與引物設(shè)計(jì)

本研究通過文獻(xiàn)查閱和序列比對，選擇泛菌屬的看家基因acnA作為篩選基因。在菠蘿泛菌HQOI基因組中，acnA長度為2682bp，另從NCBI下載其余泛菌屬的acnA基因序列（Gene ID為66825758、58737924、67451744、65789518、61251203、57346462），運(yùn)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，共發(fā)現(xiàn)了9處差異較大位點(diǎn)（圖1）?；谶@9處差異位點(diǎn)，共設(shè)計(jì)了22對引物（表2）。

2.2特異性引物篩選

雙重PCR檢測方法需要2對特異性引物在同一反應(yīng)體系下擴(kuò)增不同的目標(biāo)序列，2對特異性引物之間在近似種屬是否存在錯(cuò)配是雙重PCR檢測方法建立的關(guān)鍵。為了篩選到合適的特異性引物，本研究以近似種屬為模板，將引物X0080分別與22對引物進(jìn)行組合，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測的結(jié)果如圖2所示。不同引物的擴(kuò)增結(jié)果分為以下4種：1）在非目標(biāo)泳道擴(kuò)增出條帶或在陽性對照泳道出現(xiàn)若干條帶，說明該引物不具有特異性（a-440，a-875，a-1066，a-1132，a-839，a-404， a-1030，a-1096，a-466，a-501，a-657，a-1977，a-452，a-643，a-709，a-1493，a-1270，a-273）;2）在陽性對照泳道出現(xiàn)2條帶，但其中一條帶亮度較弱，說明該引物靈敏度低（a-2386，a-2350）；3）在陽性對照泳道出現(xiàn)2條帶，但不易區(qū)分，說明該引物的產(chǎn)物大小與白葉枯病菌的特異性引物產(chǎn)物大小接近（a-274）；4）在陽性對照泳道出現(xiàn)2條帶，非目標(biāo)泳道均為空白，說明該引物組合可以從菠蘿泛菌與白葉枯病菌中特異性擴(kuò)增出兩條DNA條帶，分子量分別為910bp與162bp，而未能從近似種屬的菌株及空白對照擴(kuò)增出條帶（a-910）。

2.3雙重PCR檢測方法的特異性

為了進(jìn)一步驗(yàn)證引物a-910與引物X0080的特異性，選取了12種常見的細(xì)菌基因組DNA為模板（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測結(jié)果如圖3所示，只有菠蘿泛菌和白葉枯病菌能分別擴(kuò)增出清晰的目的條帶，且均無非特異性雜帶出現(xiàn)，位置和相應(yīng)的白葉枯病菌對照組（泳道1）以及菠蘿泛菌對照組（泳道2）-致，其他種屬的細(xì)菌（泳道3～12）與空白對照均未擴(kuò)增出條帶，說明本研究設(shè)計(jì)并篩選的引物a-910在與引物XO080組合后的雙重PCR檢測方法具有種屬特異性，可以將白葉枯病菌和菠蘿泛菌與其他種屬病菌區(qū)分開。

2.4雙重PCR檢測方法的靈敏度

利用已建立起來的PCR方法進(jìn)行靈敏度檢測，結(jié)果顯示（圖4），該組引物在25uL的反應(yīng)體系中可穩(wěn)定地從至少1pg/uL的基因組模板中擴(kuò)增得到910bp與162bp的特異性條帶。

2.5雙重PCR檢測方法的抗干擾能力

為了進(jìn)一步測試雙重PCR檢測方法的抗干擾能力，選取作為供試菌株，在含有菠蘿泛菌和白葉枯病菌的雙重PCR檢測方法中分別加入以上5種供試菌株，測試在同屬種存在的條件下，該體系是否能進(jìn)行有效擴(kuò)增。結(jié)果如圖5所示，本研究的雙重PCR檢測方法在其他同屬種菌存在的情況下，依然能擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，目標(biāo)條帶大小也與之前一致，說明該方法的特異性并不受到同屬種菌的影響。

2.6水稻樣品檢測

為了驗(yàn)證雙重PCR檢測方法的實(shí)際應(yīng)用情況，隨機(jī)選取6種市售水稻品種種子和6份田間發(fā)病的葉片進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示（圖6，圖7），運(yùn)用該方法能從帶菠蘿泛菌和白葉枯病菌樣品的上清液中特異地?cái)U(kuò)增出2條帶，分子量大小分別為910bp與162bp，能從帶菠蘿泛菌樣品的上清液中特異地?cái)U(kuò)增出910bp的條帶，能從帶白葉枯病菌樣品的上清液中特異地?cái)U(kuò)增出162bp的條帶，而未能從其他樣品擴(kuò)增出條帶，說明該方法可以用于水稻樣品中菠蘿泛菌與白葉枯病菌的快速分子檢測。同時(shí)對此批樣品進(jìn)行傳統(tǒng)的菌株分離、測序鑒定，與雙重PCR檢測結(jié)果一致，再次說明了該方法的可靠性。

3結(jié)論與討論

菠蘿泛菌引起的水稻病害是近年來危害極其嚴(yán)重的一種新型細(xì)菌病害，該病害發(fā)生迅速，從發(fā)現(xiàn)發(fā)病中心到全田蔓延，僅需要1～2d，在適合的條件下，3～5d就可以導(dǎo)致全田毀滅，損失慘重。在實(shí)際生產(chǎn)中，因發(fā)病癥狀和白葉枯病相似，容易被當(dāng)成白葉枯病進(jìn)行防治，但是使用防治白葉枯的藥劑無法控制該病害的蔓延，同時(shí)該病害不僅在抽穗期易發(fā)生，在移栽后也容易發(fā)生，導(dǎo)致死苗。這兩種病害雖然癥狀相似，但在防治藥劑、防治時(shí)期均有較大的差異，因此研究早期的快速檢測技術(shù)極其重要，對癥下藥才能有效地減少損失。PCR檢測作為一種檢測方法，相較于傳統(tǒng)耗時(shí)耗力的篩選分離，具有簡便、快速、易操作的優(yōu)點(diǎn)，常被用于日常的檢測工作中。目前針對單一白葉枯病菌或者菠蘿泛菌的PCR檢測方法已有了報(bào)道，但這兩種病害在實(shí)際情況中存在混發(fā)的情況，單一檢測耗時(shí)耗力，為病害的防治造成了極大的困難。

本研究基于泛菌屬看家基因acnA，設(shè)計(jì)并篩選出了一對引物a-910，將其與已報(bào)道的白葉枯病菌檢測引物X0080進(jìn)行組合，成功建立了一種雙重PCR檢測方法。結(jié)果顯示，利用該檢測方法，可從樣品中特異性地檢測出菠蘿泛菌和白葉枯病菌，靈敏度高，25uL體系中可穩(wěn)定地從至少1pg/uL的基因組DNA模板中擴(kuò)增出特異性條帶；在實(shí)際應(yīng)用中，可從帶有菠蘿泛菌和白葉枯病菌的水稻種子或者發(fā)病葉片中一次性同時(shí)檢測出菠蘿泛菌和白葉枯病菌，為水稻種子檢測、田間監(jiān)測及精準(zhǔn)防治提供了技術(shù)支撐。

然而，本方法也有局限性。菠蘿泛菌不僅僅是致病菌，同時(shí)也是一種內(nèi)生菌，本文所研究的檢測方法無法區(qū)分檢測的菠蘿泛菌是內(nèi)生菌還是致病菌，但這并不影響本文中雙重PCR檢測方法對水稻樣品的檢測結(jié)果。菠蘿泛菌的確是一種內(nèi)生菌，但是在水稻上其占比非常低。郭鶴寶等在2019年從8個(gè)不同基因型水稻種子中分離了146株內(nèi)生泛菌，但其中并沒有分離到菠蘿泛菌P．a(chǎn)nanatis。本年度本團(tuán)隊(duì)利用該檢測方法完成了來自不同地區(qū)的35份疑似病樣的檢測，菠蘿泛菌檢出率為62.8%，在后續(xù)的調(diào)查中，這些地區(qū)均發(fā)生了水稻新型細(xì)菌病害，對檢測地區(qū)的發(fā)病組織進(jìn)行取樣分離、純化，經(jīng)公司測序鑒定病原菌為菠蘿泛菌P．a(chǎn)nanatis，檢測準(zhǔn)確率100%。為了提高檢測的準(zhǔn)確率，降低假陽性率，本團(tuán)隊(duì)目前也正在開展如何區(qū)分菠蘿泛菌是致病菌還是內(nèi)生菌這方面的研究，計(jì)劃從水稻中分離不具有致病性的菠蘿泛菌，然后進(jìn)行全基因測序，與致病性的菠蘿泛菌進(jìn)行對比，找出差異點(diǎn)，從而區(qū)分內(nèi)生菌菠蘿泛菌和致病菌菠蘿泛菌。