鄭寬瑜 熊智琦 魏治鐳 吳闊 王茂森 蘇曉霞 巴宗 次仁措姆 王田田 張仲凱
關(guān)鍵詞:高原;番茄;辣椒;萵苣;番茄斑萎病毒
為解決農(nóng)民增收和蔬菜供應(yīng)的問(wèn)題,西藏自治區(qū)將蔬菜產(chǎn)業(yè)作為重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)進(jìn)行扶持發(fā)展。2021年昌都市蔬菜種植面積已達(dá)4335.5hm2,其中露地蔬菜面積4057.36hm2,設(shè)施蔬菜面積達(dá)278.14hm2。種植的蔬菜種類(lèi)主要有:萵苣、青椒、番茄、小白菜、大白菜、結(jié)球甘藍(lán)、黃瓜、蔥、蒜苗、香菜、蘿卜、菠菜和花菜等。昌都市卡若區(qū)主要蔬菜為溫室和大棚種植的番茄、辣椒和生菜,露地種植的主要有萵苣、白菜和辣椒。西藏大部分蔬菜種植地區(qū)處于3000m以上的高海拔地區(qū),露地種植的蔬菜病害發(fā)生較少,溫室和大棚蔬菜近年來(lái)發(fā)展較快,病毒病和白粉病發(fā)生普遍。其中,昌都市卡若區(qū)溫室和大棚蔬菜及露地栽培的番茄、辣椒和萵苣病毒病發(fā)生普遍,引起嚴(yán)重減產(chǎn),蔬菜質(zhì)量下降。本項(xiàng)目開(kāi)展之前,該區(qū)域尚無(wú)對(duì)蔬菜病害開(kāi)展系統(tǒng)調(diào)查和研究的工作。近年來(lái)全球番茄、辣椒和萵苣主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生普遍,其中,番茄和辣椒上主要有薊馬傳播的正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒引起的斑萎病和菜豆金色花葉病毒屬Begornoozrus病毒引起的曲葉病,侵染番茄的病毒類(lèi)致病因子(包括病毒、衛(wèi)星病毒、病毒衛(wèi)星分子和類(lèi)病毒)多達(dá)312種,侵染辣椒的病毒多達(dá)62種,侵染萵苣的病毒10余種。
為明確昌都市卡若區(qū)的蔬菜主要病毒種類(lèi),本研究對(duì)昌都市卡若區(qū)溫室和大棚及露地栽培的蔬菜主要病毒病害進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查,對(duì)侵染蔬菜的主要病毒進(jìn)行檢測(cè)鑒定。通過(guò)ELISA檢測(cè)明確昌都市卡若區(qū)蔬菜主要病毒種類(lèi),進(jìn)一步以電子顯微鏡制樣觀察、RT-PCR擴(kuò)增及序列分析鑒定主要病毒,為西藏高原蔬菜生產(chǎn)中病毒病綠色防控提供指導(dǎo)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
1.1.1材料
于2020年6月-10月在西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)對(duì)溫室、大棚和露地栽培蔬菜進(jìn)行病毒病調(diào)查。采集感染病毒病的番茄、辣椒和萵苣葉片和果實(shí)樣品共計(jì)42份。
1.1.2主要試劑
負(fù)染色制樣試劑為戊二醛固定液,鉬酸銨染色劑;超薄切片制樣試劑按照參考文獻(xiàn)中的方法配制;反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Quick RT Master Mix(康為,中國(guó))。
1.1.3抗體
番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt vtrus,TSWV)、馬鈴薯Y病毒(potato virus Y,PVY)、煙草花葉病毒(tobacco mosalc virus,TMV)、番茄花葉病毒(tomato mosaic virus.ToMV)、鳳果花葉病毒(pepino mosaic virus,PepMV)、番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、煙草環(huán)斑病毒(tobacco ringspot virus,TRSV)、黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus,CMV)單克隆抗體由浙江大學(xué)吳建祥教授提供,羊抗鼠二抗購(gòu)自Abcom(英國(guó))。
1.2方法
1.2.1ELISA檢測(cè)
對(duì)采集的42份樣本進(jìn)行病毒種類(lèi)檢測(cè),待檢測(cè)病毒有8種,包括TSWV、PVY、TMV、ToMV、PeP-MV、TYLCV、TRSV、CMV。將待測(cè)樣品、實(shí)驗(yàn)室保存的上述8種病毒陽(yáng)性對(duì)照樣品、健康無(wú)病毒的番茄陰性對(duì)照樣品及空白對(duì)照加入酶標(biāo)板,100uL/孔,37℃,3h,PBST洗板。加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉板,200uL/孔,37℃,30min,待其干燥后加入多抗,100uL/孔,37℃,3h,PBST洗板。加入酶標(biāo)二抗(羊抗兔),100uL/孔,37℃,3h,PBST洗板。加入底物顯色劑,100uL/孔,室溫,顯色。
1.2.2負(fù)染色制樣透射電子顯微鏡觀察
將采集樣品按照參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行負(fù)染色制樣,制備樣品置于FEI(TaicnaiG2 Spirit)透射電子顯微鏡觀察、拍照。根據(jù)負(fù)染色電子顯微鏡觀察結(jié)果,初步推測(cè)引起主要病害的病毒種類(lèi)。
1.2.3超薄切片制樣透射電子顯微鏡觀察
按照參考文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行超薄切片制樣,制備樣品置于FEI(TaicnaiG2 Spirit)透射電子顯微鏡觀察、拍照。
1.2.4TSWV N基因擴(kuò)增克隆和序列分析
根據(jù)負(fù)染色及超薄切片觀察結(jié)果,推測(cè)采集樣品受到番茄斑萎病毒感染,根據(jù)已報(bào)道的TSWVN基因序列設(shè)計(jì)特異引物TSWV N-F: 5'-AT-GTCTAAGGTTAAGCTCACTAAGG-3 7,
TSWVN-R: 5r_TTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGTC_3;,擴(kuò)增目的片段大小為777bp。采用TRIzoI(Thermo Fisher Scientific,美國(guó))提取各樣品總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Quick RT Master Mix(康為,中國(guó))制備cDNA。PCR反應(yīng)體系(25uL):TaqDNA mix 12.5uL,TSWV N-R(10umol/L)1uL,TSWVN-F(10umol/L)1uL,cDNA模板5uL,ddH20 5.5uL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃4min;94℃30s,55℃30 s,72℃30s,30個(gè)循環(huán);72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行純化回收,并連接到pMD18-T克隆載體(TaKaRa)上,之后熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a(TaKaRa)中。在含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選后,送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測(cè)序。測(cè)序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行在線(xiàn)比對(duì),并將得到的序列與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的TSWVN基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。使用軟件MEGA 6.0的鄰接法(neighbor-join-ing,N)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),Bootstrap重復(fù)1000次。
2結(jié)果與分析
2.1西藏昌都市卡若區(qū)的蔬菜主要病毒病
溫室和大棚蔬菜中,番茄、辣椒和生菜病毒病發(fā)生較為嚴(yán)重。番茄植株表現(xiàn)為葉部褪綠、萎蔫,果實(shí)白化、黃化、僵硬、環(huán)斑(圖1a,b)。辣椒葉部出現(xiàn)褪綠斑或環(huán)斑,頂葉萎蔫,果實(shí)表現(xiàn)為黃化斑或褪綠斑(圖1c,d)。生菜葉部有褐色壞死斑點(diǎn)或壞死斑,植株矮化(圖1e)。上述癥狀特點(diǎn)與正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒引起的斑萎病相似,到后期番茄和辣椒發(fā)病率超過(guò)70%以上,生菜發(fā)病率達(dá)到50%,嚴(yán)重影響蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量。溫室和大棚栽培的其他蔬菜如瓜果類(lèi)南瓜和黃瓜等未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒病癥狀。
露地栽培的蔬菜中,萵苣病毒病發(fā)生嚴(yán)重,根據(jù)不同發(fā)病時(shí)期葉部表現(xiàn)為褪綠(早期)、黃化(中期)和壞死斑(后期),植株嚴(yán)重矮化(圖1f),與已報(bào)道的番茄斑萎病毒侵染引起的萵苣斑萎病相似。其次為辣椒斑萎病,葉部和果實(shí)癥狀與溫室和大棚栽培的相似,發(fā)病率約30%以上。露地栽培的其他蔬菜如白菜等未見(jiàn)明顯的病毒病。
2.2西藏昌都市卡若區(qū)主要蔬菜病毒種類(lèi)的ELISA檢測(cè)
對(duì)采集的42份樣本進(jìn)行8種病毒種類(lèi)檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果如表1所示,在42份樣本中,共檢出TSWV、PVY以及PepMV 3種病毒。TSWV檢出率為40.48%,PVY檢出率為28.57%,PepMV檢出率為21.43%。辣椒中的檢出病毒以單一侵染為主,番茄中的檢出病毒以混合侵染為主。PVY及PePMV在番茄中具有較高的檢出率,分別為45.00%和35.00%,高于在辣椒中的檢出率(PVY14. 29%,PePMV 9.52%)。混合侵染的組合類(lèi)型包括TSWV+PVY+PepMV、TSWV+PVY、TSWV+PepMV、PVY+PepMV。
2.3侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣樣品的番茄斑萎病毒屬病毒形態(tài)特征
對(duì)表現(xiàn)番茄斑萎病毒病癥狀的番茄、辣椒及萵苣樣品20YV257、20YV181、20YV176進(jìn)行負(fù)染色和超薄切片制樣,透射電子顯微鏡觀察。負(fù)染色樣品中均觀察到直徑約80~120nm的球形病毒粒體,與orthotospoviruses的粒體形態(tài)相似。超薄切片制樣中,番茄果實(shí)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中分布較多直徑約85nm的球形病毒粒體,聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中,部分病毒粒體聚集于液泡內(nèi)的囊泡中,細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整(圖2a);辣椒果實(shí)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布較多直徑約85nm的球形病毒粒體,聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi),與較多線(xiàn)粒體相連,病毒粒體多分布于靠近細(xì)胞壁的細(xì)胞質(zhì)中,葉綠體結(jié)構(gòu)不完整(圖2b)。萵苣葉部細(xì)胞中,分布有直徑約85nm的球形病毒粒體,早期受侵染的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布少量單個(gè)病毒粒體,葉綠體中嗜鋨顆粒增加,后期受侵染的細(xì)胞中,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)多個(gè)病毒粒體聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池,葉綠體和線(xiàn)粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失(圖2c)。根據(jù)病毒粒體形態(tài)和細(xì)胞內(nèi)病毒粒體聚集特征分析,番茄、辣椒和萵苣樣品受orthotospoviruses感染,與代表種TSWV在寄主植物細(xì)胞內(nèi)的分布特征類(lèi)似。
2.4侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣的TSWV N基因擴(kuò)增
用TSWV N基因引物對(duì)番茄(20YV257、20YV258)、辣椒(20YV181、20YV268、20YV270)和萵苣樣品(20YV176)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,從番茄、辣椒和萵苣樣品中擴(kuò)增出目的條帶,大小約770bp(圖3)。經(jīng)測(cè)序后得到的序列在NCBI中進(jìn)行提交,得到的NCBI序列號(hào)分別:OP893535(20YVr76);
OP893534(20YV181)、OP893536(20YV257)、OP893537(20YV258)、OP893538(20YV268)、OP893539(20YV270)。上述6條序列在NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì),均與NCBI上注冊(cè)的TSWV一致性最高,達(dá)99%以上。
2.5侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣的TSWV N基因序列分析
將本研究得到的6條TSWVN基因序列與NCBI上國(guó)內(nèi)外其他地區(qū)TSWV-N基因序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果如圖4所示,從西藏昌都番茄、辣椒和萵苣分離得到的6條TSWV-N基因序列與云南TSWV煙草分離物(MF193425)、云南TSWV鬼針草分離物(MF805764)、云南TSWV豌豆分離物(KY495609)、云南TSWV煙草分離物(MF193426)及云南番茄分離物(JF960235)聚在同一分支,表明TSWV西藏昌都分離物與云南TSWV分離物親緣關(guān)系最近。
3結(jié)論與討論
TSWV是目前已報(bào)道的病毒中發(fā)生分布范圍最廣和寄主植物最多的植物病毒,在全球熱帶、亞熱帶和溫帶均有發(fā)生,侵染的植物多達(dá)84科1090多種。由于溫室、大棚等設(shè)施蔬菜的普及,近10年來(lái)TSWV進(jìn)一步快速蔓延。自2010年應(yīng)用N基因克隆、測(cè)序,氨基酸序列推導(dǎo)和病毒粒體在細(xì)胞內(nèi)的分布特征發(fā)現(xiàn)TSWV在我國(guó)云南番茄和煙草上發(fā)生以來(lái),至2020年,已在我國(guó)18個(gè)省(區(qū)、市)發(fā)現(xiàn)TSWV侵染番茄和辣椒等作物,TSWV是近年來(lái)引起云南番茄、辣椒和萵苣類(lèi)蔬菜(萵苣、生菜和油麥菜)病毒病的優(yōu)勢(shì)種。TSWV侵染后引起褪綠、花葉、黃化和壞死等癥狀,導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)品質(zhì)量下降和產(chǎn)量損失。在自然條件下,TSWV主要通過(guò)西花薊馬Frankliniella occidentalis傳播,2022年又報(bào)道可通過(guò)辣椒種子傳播。西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)的蔬菜生產(chǎn)區(qū)域(包括溫室、大棚和露地)平均海拔3000m以上,在2020年之前未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒病,隨著智能化溫室的推廣普及,為病毒病發(fā)生提供了適宜的條件,而種子攜帶病毒促進(jìn)了病毒的遠(yuǎn)距離傳播。本研究發(fā)現(xiàn)卡若區(qū)溫室內(nèi)番茄、辣椒和生菜上由TSWV引起的斑萎病發(fā)病率較其他病毒高,而且在露地栽培的萵苣和辣椒上發(fā)病率也很高,說(shuō)明TSWV已適應(yīng)高原缺氧和紫外線(xiàn)強(qiáng)的環(huán)境。在發(fā)病區(qū)域,未發(fā)現(xiàn)傳毒介體西花薊馬,也未發(fā)現(xiàn)其他雜草或作物有TSWV引起的癥狀,推測(cè)由種子攜帶病毒傳播的可能性較大。應(yīng)加強(qiáng)對(duì)蔬菜種子攜帶TSWV的檢測(cè),在育苗期應(yīng)及時(shí)抽樣檢測(cè),從源頭和早期開(kāi)展蔬菜病毒病的預(yù)防,減少斑萎病引起的蔬菜產(chǎn)量損失和質(zhì)量下降。
本研究明確了西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)溫室和大棚栽培番茄、辣椒和生菜及露地栽培辣椒和萵苣上發(fā)生的主要病毒為T(mén)SVVV、PVY及PepMV,且以TSWV的檢出率最高。進(jìn)一步對(duì)檢出TSWV的樣品進(jìn)行電子顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)為典型的正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒粒體;通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增克隆和序列分析,明確西藏昌都市卡若區(qū)蔬菜感染的TSWV與TSWV云南分離物親緣關(guān)系最近。本研究首次報(bào)道了西藏自治區(qū)TSWV的發(fā)生,為該區(qū)域蔬菜斑萎病及TSWV侵染引起的其他作物病害的監(jiān)測(cè)預(yù)警與綠色防控提供了依據(jù)。