種鴿飼糧磷水平對(duì)乳鴿血清生化指標(biāo)、非靶向代謝物及組織中磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

安勇，秦士貞，史兆國(guó)，龔莉媛,，張帥，計(jì)峰

種鴿飼糧磷水平對(duì)乳鴿血清生化指標(biāo)、非靶向代謝物及組織中磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)的影響

1北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056009；3甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070

【目的】通過探討親鴿飼糧中添加不同水平無(wú)機(jī)磷對(duì)乳鴿血清生化指標(biāo)、非靶向代謝物和小腸及腎臟中磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的影響，為快速生長(zhǎng)期乳鴿的磷營(yíng)養(yǎng)調(diào)控提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x取192對(duì)健康成年銀王鴿（40周齡），隨機(jī)分為4組，每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6對(duì)種鴿，產(chǎn)蛋后由親鴿自然孵化和哺育乳鴿。試驗(yàn)期包括孵化期和哺育期，共46d。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧（總磷含量0.3%），其余3個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%、0.4%和0.8%無(wú)機(jī)磷，各組飼糧中Ca含量均為1.40%。分別收集7、14和21日齡乳鴿血清分析Ca、P含量，堿性磷酸酶（ALP）活性和甲狀旁腺素（PTH）水平；檢測(cè)鴿乳中Ca和P含量；測(cè)定腸道（十二指腸和空腸）磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體（NaPi-Ⅱb、PiT-1、PiT-2）及腎臟磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體（NaPi-Ⅱa、PiT-1、PiT-2）的基因表達(dá)水平；檢測(cè)14和21日齡對(duì)照組和磷添加（0.4%和0.8%）組乳鴿血清中的非靶向代謝物?！窘Y(jié)果】（1）隨著親鴿日糧中磷添加水平的增加，鴿乳中磷含量極顯著上升（＜0.01）。（2）飼糧添加磷對(duì)乳鴿血清磷、ALP活性和PTH水平均未產(chǎn)生影響，而0.8%磷添加組血清鈣含量極顯著下降（＜0.01）。隨著日齡增長(zhǎng)，乳鴿血清ALP和PTH水平均顯著降低（＜0.05）。（3）各日齡乳鴿小腸NaPi-IIb表達(dá)水平隨親鴿飼糧磷含量增加均有上升趨勢(shì)，但差異不顯著（＞0.05）。7和14日齡乳鴿PiT-1和PiT-2 mRNA在腎臟的表達(dá)量均極顯著高于腸道（＜0.01），但21日齡時(shí)腎臟和腸道的表達(dá)量相近，甚至PiT-1在腎臟的表達(dá)量低于空腸。7和14日齡乳鴿PiT-1 mRNA表達(dá)隨飼糧磷水平增加而增加，7和21日齡時(shí)，0.4%加磷組PiT-2 mRNA表達(dá)水平高于0.8%組（＜0.05），采樣部位和飼糧磷水平對(duì)7和14日齡PiT-1基因表達(dá)以及21日齡PiT-2基因表達(dá)有互作影響（＜0.05）。14日齡時(shí)，0.8%加磷組腎臟NaPi-Ⅱa mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組和0.4%處理組。（4）14和21日齡時(shí)，對(duì)照組和加磷組乳鴿之間的顯著差異代謝物中約50%為脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子，其次是有機(jī)酸及其衍生物，再次是苯系物等某些有機(jī)物，且差異代謝物涉及到的主要代謝途徑包括碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝、遺傳物質(zhì)合成及脂肪代謝等?！窘Y(jié)論】（1）親鴿飼糧中的磷水平顯著影響其分泌的鴿乳含磷量，而乳鴿血磷含量較穩(wěn)定，但是高磷組血鈣含量下降，這有可能表明鴿對(duì)高磷耐受性較差。（2）乳鴿腎臟中PiT-1和PiT-2 mRNA表達(dá)大多隨飼糧磷含量增加而增加，具體調(diào)控機(jī)制有待研究。（3）血液代謝組數(shù)據(jù)表明磷參與乳鴿體內(nèi)多種重要的代謝過程，如脂肪代謝和骨骼礦化等。

磷；鴿；生化指標(biāo)；代謝組；轉(zhuǎn)運(yùn)載體

0 引言

【研究意義】為了滿足動(dòng)物磷需要，飼糧中需額外添加無(wú)機(jī)礦物質(zhì)磷，加強(qiáng)飼糧磷在家禽腸道的吸收規(guī)律研究，對(duì)生產(chǎn)中磷的高效利用以及減少磷排放對(duì)環(huán)境的污染都具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義[1]。然而，迄今對(duì)鴿飼糧中磷的吸收利用規(guī)律尚無(wú)研究。鴿已發(fā)展為我國(guó)第四大家禽，鴿肉不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且具有較高的藥用價(jià)值。鴿是晚成鳥，出殼后需要親鴿哺喂，雌雄親鴿嗉囊均會(huì)分泌鴿乳，隨著乳鴿日齡的增加，鴿乳分泌量逐漸減少，哺喂飼料含量增加，約1個(gè)月后乳鴿才能獨(dú)立采食，故本文研究了種鴿飼糧磷水平對(duì)鴿乳中磷含量以及乳鴿磷吸收代謝的影響，以期探討快速生長(zhǎng)期乳鴿的磷營(yíng)養(yǎng)調(diào)控。【前人研究進(jìn)展】磷是家禽必需的礦物元素之一，具有重要的生物學(xué)功能，對(duì)于核酸代謝、能量代謝、脂質(zhì)代謝、酶的激活、維持細(xì)胞膜完整性和骨骼礦化等都具有重要作用[2]。非靶向代謝組能夠提供生物樣品中存在的所有代謝物的復(fù)合譜，全面挖掘小分子代謝物，從整體反映代謝物的變化[3]。目前代謝組學(xué)已應(yīng)用于了解生物體的營(yíng)養(yǎng)狀況、生理狀態(tài)或者外界環(huán)境之間相互作用的分析研究[4]。眾所周知?jiǎng)游镅搴写罅苛状x中間產(chǎn)物和終產(chǎn)物，體內(nèi)磷穩(wěn)態(tài)維持主要是通過調(diào)控腸道磷吸收、骨骼磷的沉積和釋放以及腎臟對(duì)磷的重吸收過程[5]。雞小腸磷吸收和腎臟重吸收均受鈉依賴性磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NaPi-）調(diào)控[6]，其中腸道參與磷主動(dòng)吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)載體主要有NaPi-IIb（type IIb Na-dependent Pi cotransporter）、無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體1（inorganic Pi transporter 1，PiT-1）和無(wú)機(jī)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體2（inorganic Pi transporter 2，PiT-2）三種[7-9]。NaPi-IIb主要在雞的十二指腸中表達(dá)，是小腸中最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[10-13]。而NaPi-IIa主要調(diào)控腎臟對(duì)磷的重吸收[14-16]。已有研究表明飼糧磷水平是影響肉雞體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)量的主要因素[5, 13, 17]，鴿上尚未見相關(guān)研究報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】因?yàn)榱追€(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重疾病，故有必要研究鴿體內(nèi)磷吸收的分子調(diào)控機(jī)制，探討磷營(yíng)養(yǎng)對(duì)快速生長(zhǎng)期乳鴿的生理作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究親鴿飼糧中添加不同水平無(wú)機(jī)磷對(duì)乳鴿血清生化指標(biāo)（Ca、P、ALP活性和PTH水平）、非靶向代謝物和小腸及腎臟中磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因表達(dá)量的影響，為快速生長(zhǎng)期乳鴿的磷穩(wěn)態(tài)及其營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年10—12月在北京密云霍書林養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。

1.2 動(dòng)物、飼糧和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共選取192對(duì)健康成年銀王鴿（40周齡），試驗(yàn)鴿采用籠養(yǎng)，每籠一對(duì)親鴿，內(nèi)有棲架和蛋窩。試驗(yàn)鴿隨機(jī)分為4組，每個(gè)處理組8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)6對(duì)鴿子。受精蛋由種鴿自然孵化，孵化出的乳鴿由親鴿哺喂，每對(duì)親鴿哺喂2只乳鴿（2+2模式），共384只乳鴿（公母混合）。試驗(yàn)期包括孵化期和哺育期，持續(xù)46d，預(yù)試期10 d，飼喂對(duì)照組低磷飼糧（總磷0.3%），以盡量耗竭親鴿體內(nèi)可以動(dòng)用的磷儲(chǔ)存。親鴿自由采食和飲水，飼糧為玉米-大豆全價(jià)顆粒料，鴿舍每天光照16 h，舍內(nèi)溫度控制在（15±5）℃。其余飼養(yǎng)管理按常規(guī)操作。

親鴿日糧的組成和營(yíng)養(yǎng)水平見表1。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，其余3個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)日糧中添加0.2%、0.4%和0.8%無(wú)機(jī)磷（飼料級(jí)CaHPO4·2H2O，純度≥98.0%，北京康普匯維科技有限公司）。用洗凈的建筑砂（不含磷）調(diào)整各處理組日糧中的磷酸氫鈣用量[12]。各組飼糧中Ca含量均為1.40%。飼料及其他樣品中的Ca和P含量分別按照乙二胺四乙酸二鈉絡(luò)合滴定法（GB/T 6437-2018）和鉬黃分光光度法（GB/T 6436-2018）進(jìn)行測(cè)定，并用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)大豆粉（GBW 10013 (GSB-4)，地球物理地球化學(xué)勘查研究所）對(duì)礦物元素檢測(cè)質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 樣品采集和處理

分別于乳鴿7、14和21日齡時(shí)，從每個(gè)處理組各重復(fù)中隨機(jī)選取1只健康乳鴿翅靜脈采血，2 000×離心15 min后收集血清-20℃保存?zhèn)錅y(cè)Ca、P、ALP活性和PTH水平，另取部分血清-80℃保存用于非靶向代謝組學(xué)分析。血清Ca、P和ALP活性采用全自動(dòng)生化分析儀（Hitachi 7600，日本）測(cè)定，血清PTH水平采用ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）檢測(cè)。

采用斷頸法致死采樣乳鴿，從其嗉囊中收集鴿乳-20℃保存，以備測(cè)Ca和P含量。隨著乳鴿日齡的增長(zhǎng)，鴿乳分泌量逐漸減少，谷物飼料含量增加[18]，所以需仔細(xì)棄去嗉囊內(nèi)容物樣品中的谷粒飼料，由于部分乳鴿嗉囊內(nèi)容物量少，故每2份鴿乳樣品等量混合為一個(gè)待測(cè)樣[19]。鴿乳樣品室溫下解凍后，于65℃干燥24 h，然后粉碎過篩。鴿乳中Ca和P含量的測(cè)定方法同飼料樣品。

小心打開宰后乳鴿的腹腔，取出小腸段，將腸道內(nèi)容物輕輕擠出。立即剪下十二指腸U型彎曲處（約5 cm）、空腸后段（Meckel’s憩室前約5 cm）和左側(cè)腎臟（左下部位），在生理鹽水中漂洗干凈后，迅速置于液氮中速凍，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存待測(cè)mRNA表達(dá)量。

采用Trizol方法（北京金普來生物科技有限公司）提取樣品總RNA，使用瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的RNA質(zhì)量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M5 Super QPCR RT kit，北京聚合美生物科技有限公司）將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，置于-20 ℃保存。采用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR法（2X Realtime PCR Super mix kit, 北京聚合美生物科技有限公司）測(cè)定小腸（十二指腸和空腸段）中NaPi-IIb、PiT-1和PiT-2的mRNA表達(dá)水平，以及腎臟中的NaPi-IIa、PiT-1和PiT-2的mRNA表達(dá)水平，擴(kuò)增儀器為CFX Connect PCR instrument（Bio-Rad）。用β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）作為內(nèi)參基因，上述目的基因和β-actin引物序列見表2。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系共20 μL：1 μL cDNA，10 μL 2× Realtime PCR Super mix，上游引物和下游引物各0.5 μL，dd H2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性2 m，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。每個(gè)樣品測(cè)定3個(gè)重復(fù)，采用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[19-20]。

表1 種鴿試驗(yàn)日糧配方和營(yíng)養(yǎng)水平（飼喂基礎(chǔ)）

1)維生素為每千克日糧提供：維生素A. 9000 IU；維生素D3.2400 IU；維生素E. 24 IU；維生素K3. 3 mg；維生素B1. 2.4 mg；維生素B2. 7.5 mg；維生素B6. 4 mg；維生素B12. 0.026 mg；煙酰胺. 26 mg；D-泛酸. 11 mg；葉酸，1.4 mg；生物素，0.16 mg。2)復(fù)合微量元素為每千克日糧提供：銅. 15 mg；鐵. 99 mg；鋅. 95 mg；錳. 97 mg；碘. 1.35 mg；硒. 0.45 mg。3)為洗凈的建筑砂，用于調(diào)整各處理組日糧中的磷酸氫鈣用量，實(shí)測(cè)無(wú)磷含量。4)粗蛋白、鈣和磷為實(shí)測(cè)值，其余營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)為計(jì)算值

1)Vitamins provided the following per kilogram: Vitamin A. 9000 IU (retinyl acetate); Vitamin D3. 2400 IU; Vitamin E. 24 IU (dl-α-tocopheryl acetate); Vitamin K3. 3 mg; Vitamin B1. 2.4 mg; Vitamin B2. 7.5 mg; Vitamin B6. 4 mg; Vitamin B12. 0.026 mg; Nicotinamide. 26 mg; D-pantothenic acid, 11 mg; Folic acid. 1.4 mg; Biotin. 0.16 mg.2)Minerals provided the following per kilogram: Cu. 15 mg; Fe. 99 mg; Zn. 95 mg; Mn. 97 mg; I. 1.35 mg; Se. 0.45 mg.3)Washed building sand with no detectable P and Ca, was used to adjust the amounts of calcium hydrophosphate in each group diet.4)CP, Ca and total P were analyzed, while all others were calculated data

1.4 代謝組分析血清樣本制備

從對(duì)照組、0.4%和0.8%無(wú)機(jī)磷添加組中隨機(jī)選取14和21日齡的乳鴿血清樣品各18份（相同日齡下每組6個(gè)樣品），室溫溶化后，取100 μL血清樣本于2 mL離心管中，加入400 μL提取液（乙腈﹕甲醇=1﹕1），渦旋混勻30 s后，低溫超聲提取30 min（5 ℃，40 KHz），將樣品于-20 ℃靜置30 min，再離心15 min（4 ℃，13 000×），最后移取上清液上機(jī)分析。同時(shí)，取等體積的所有樣本混合制備成質(zhì)控樣本（QC），在儀器分析過程中，每6個(gè)樣本中插入一個(gè)QC樣本，以考察整個(gè)分析過程的重復(fù)性。

1.5 血清樣品的代謝組分析

分析平臺(tái)為超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-TripleTOF，AB SCIEX）系統(tǒng)。色譜條件：10 μL樣本經(jīng)BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm，Waters）分離后進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)，流動(dòng)相A：水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B：乙腈/異丙醇（1/1）（含0.1%甲酸）。分離梯度：0—0.1 min，流動(dòng)相B 0%—5%；0.1—2 min，流動(dòng)相B 5%—25%；2—9 min，流動(dòng)相B 25%—100%；9—13 min，流動(dòng)相B維持100%；13.0—13.1 min，流動(dòng)相B 100%—0%；13.1—16 min，流動(dòng)相B維持0%。流速為0.40 mL·min-1，柱溫為40 ℃。

表2 引物序列表

質(zhì)譜條件：信號(hào)采集采用正負(fù)離子掃描模式，質(zhì)量掃描范圍（m/z）：50—1 000。離子噴霧電壓：正離子電壓5 000 V，負(fù)離子電壓4 000 V，去簇電壓80 V，噴霧氣50 psi，輔助加熱氣50 psi，氣簾氣30 psi，離子源加熱溫度550 ℃，20—60 V循環(huán)碰撞能。

1.6 數(shù)據(jù)預(yù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

LC-MS原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)處理軟件Progenesis QI（Waters公司，美國(guó)）進(jìn)行基線過濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣，數(shù)據(jù)矩陣用80%規(guī)則去除缺失值，再進(jìn)行空缺值填補(bǔ)（原始矩陣中最小值填補(bǔ)）。為減小樣品制備及儀器不穩(wěn)定帶來的誤差，用總和歸一化法對(duì)樣本質(zhì)譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行歸一化，得到歸一化后的數(shù)據(jù)矩陣。同時(shí)刪除QC樣本相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＞30%的變量，并進(jìn)行l(wèi)og10對(duì)數(shù)化處理，得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。同時(shí)將質(zhì)譜信息與代謝公共數(shù)據(jù)庫(kù)HMDB（http：//www.hmdb.ca/）和Metlin（https：//metlin.scripps.edu/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，得到代謝物信息。

預(yù)處理后的數(shù)據(jù)上傳美吉生物云平臺(tái)（https:// cloud.majorbio.com）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用R軟件包ropls（Version1.6.2）進(jìn)行主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLS-DA，partial least squares discriminant analysis），并使用7次循環(huán)交互驗(yàn)證來評(píng)估模型的穩(wěn)定性。此外，進(jìn)行方差檢驗(yàn)和差異倍數(shù)分析。顯著差異代謝物的選擇基于PLS-DA模型得到的變量權(quán)重值（VIP）和方差顯著性檢驗(yàn)值來確定，VIP＞1，＜0.05的代謝物為顯著差異代謝物，并通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Gene Genotype）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路注釋，獲得差異代謝物參與的通路。利用Python軟件包scipy（Version1.0.0）進(jìn)行通路富集分析，并通過Fisher精確檢驗(yàn)獲得與試驗(yàn)處理最相關(guān)的生物學(xué)途徑。

采用SPSS（version 20.0）軟件中的一般線性模型（GLM）程序?qū)ρ謇砘笜?biāo)和鴿乳鈣磷含量進(jìn)行雙因素方差分析，試驗(yàn)因子包括飼糧添加磷水平、乳鴿日齡及二者交互作用；對(duì)組織（小腸和腎臟）中磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因（NaPi-Ⅱb、PiT-1、PiT-2）表達(dá)量進(jìn)行雙因素方差分析，試驗(yàn)因子包括飼糧添加磷水平、采樣部位及二者交互作用；對(duì)腎臟中NaPi-IIa基因表達(dá)量進(jìn)行單因素（飼糧磷水平）方差分析。差異顯著者均用LSD法進(jìn)行均值比較，以＜0.05作為差異顯著性檢驗(yàn)水平，＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

種鴿飼糧添加磷對(duì)7、14和21日齡乳鴿體重?zé)o任何影響（＞0.05），數(shù)據(jù)已發(fā)表[21]。

2.1 鴿乳鈣、磷含量

各組種鴿日糧中的總磷含量（測(cè)定值）分別為0.30%、0.54%、0.77%和1.28%。乳鴿嗉囊內(nèi)容物（鴿乳）中的鈣和磷含量見表3，隨著親鴿日糧中無(wú)機(jī)磷添加水平的增加，鴿乳磷含量極顯著上升（＜0.01）。而0.8%無(wú)機(jī)磷添加組的鴿乳鈣含量極顯著低于其他各組（＜0.01）。此外，隨著乳鴿日齡的增長(zhǎng)，鴿乳中鈣含量明顯上升（＜0.01），而磷含量明顯下降，其中前期（7—14 d）變化較大（＜0.01），后期（14—21 d）變化減緩（0.047）。日齡和磷添加水平對(duì)鴿乳磷含量有極顯著的交互作用（＜0.01）。

2.2 血清鈣、磷含量、ALP活性和PTH水平

試驗(yàn)期乳鴿血清中鈣、磷、ALP活性和PTH水平見表4。飼糧加磷水平對(duì)乳鴿血清磷含量、ALP活性和PTH水平均未產(chǎn)生影響（＞0.05），但對(duì)血清鈣含量有顯著影響（＜0.01），0.8%無(wú)機(jī)磷組乳鴿血清鈣極顯著低于0.2%和0.4%組，且和對(duì)照組相比也有下降趨勢(shì)，但差異不顯著（＞0.05）。此外，日齡極顯著影響乳鴿血清鈣含量、ALP活性和PTH水平，與7日齡相比，14日齡乳鴿血清鈣極顯著提高（＜0.01），ALP活性極顯著降低（＜0.01），PTH水平也顯著降低（＜0.05）；與14日齡相比，21日齡乳鴿血清ALP活性和PTH水平均極顯著降低（＜0.01）。日齡和磷添加水平對(duì)血清磷含量有顯著的交互作用（=0.02）。

2.3 磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體（NaPi-IIa、NaPi-IIb、PiT-1和PiT-2）基因表達(dá)

飼糧添加磷對(duì)7、14和21日齡乳鴿十二指腸和空腸腸段NaPi-IIb表達(dá)水平的影響結(jié)果列于表5。由表5可知，各日齡乳鴿小腸NaPi-IIb表達(dá)水平隨親鴿飼糧磷含量增加均有上升趨勢(shì)，但差異不顯著（＞0.05）。不同腸段（十二指腸和空腸）NaPi-IIb表達(dá)水平無(wú)顯著差異，腸段和飼糧加磷水平之間也無(wú)互作（＞0.05）。

飼糧添加磷對(duì)7、14和21日齡乳鴿十二指腸、空腸和腎臟PiT-1和PiT-2表達(dá)水平的影響結(jié)果列于表6。由表6可見，7和14日齡乳鴿腎臟PiT-1和 PiT-2表達(dá)水平均極顯著高于十二指腸和空腸（＜0.01），然而，21日齡乳鴿十二指腸和腎臟PiT-1表達(dá)水平未見明顯不同，且空腸PiT-1表達(dá)水平最高（＜0.01）。21日齡乳鴿不同組織（十二指腸、空腸和腎臟）的PiT-2表達(dá)量未見差異。

種鴿飼糧添加磷水平顯著影響乳鴿體內(nèi)PiT-1 mRNA的表達(dá)水平。7日齡時(shí)，0.8%加磷組乳鴿PiT-1表達(dá)水平極顯著高于其他各組（＜0.01，表6）；14日齡時(shí)，0.4%和0.8%加磷組乳鴿PiT-1表達(dá)水平顯著高于其他各組（＜0.05）；此外，7和21日齡時(shí)0.4%加磷組乳鴿PiT-2表達(dá)水平顯著高于0.8%組（＜0.05），而對(duì)照組、0.2%和0.8%三組之間無(wú)顯著差異。7和14日齡時(shí)，采樣部位和飼糧加磷水平對(duì)乳鴿PiT-1表達(dá)水平有明顯互作（＜0.05）；21日齡時(shí)，采樣部位和飼糧加磷水平對(duì)乳鴿PiT-2基因表達(dá)有極顯著互作（＜0.01，表6）。

表3 飼糧磷水平和乳鴿日齡對(duì)鴿乳中鈣和磷含量的影響

數(shù)據(jù)為每組8個(gè)重復(fù)的平均值，每2個(gè)樣品等比例混合為一個(gè)測(cè)定值。同列不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01），不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Each value represents the mean of 8 replicates with one determination of 2 samples in equal ratios. Different capital letters in the same column indicate extremely significant difference (＜0.01), and different lowercase letters in the same column show significant differences. (＜0.05). The same as below

表4 飼糧磷水平和乳鴿日齡對(duì)乳鴿血清鈣、磷含量、ALP活性和PTH水平的影響1)

1)數(shù)據(jù)為每組8個(gè)重復(fù)的平均值 Each value represents the mean of 8 replicates

不同日齡各組乳鴿腎臟NaPi-IIa表達(dá)情況見圖1。14日齡時(shí)，0.8%加磷組乳鴿NaPi-IIa表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和0.4%組（＜0.05）；但7和21日齡時(shí)，種鴿飼糧加磷水平對(duì)乳鴿腎臟NaPi-IIa表達(dá)無(wú)顯著影響（＞0.05）。

2.4 乳鴿血清代謝組數(shù)據(jù)

在14和21日齡乳鴿血清樣本中共提取到11 628個(gè)質(zhì)譜峰。經(jīng)搜庫(kù)（自建庫(kù)、Metlin、HMDB等）定性分析，共鑒定出639種代謝物，其中正離子模式鑒定到250種代謝物，負(fù)離子模式鑒定到389種代謝物。通過PLS-DA可以有效地區(qū)分組間分析值，14和21日齡乳鴿各組樣品PLS-DA得分圖見圖2，圖中兩組樣品分離程度越大，說明分類效果越顯著。

如圖2所示，所有血清樣本均在95%置信區(qū)間內(nèi)，14日齡時(shí)，對(duì)照組和0.8%加磷組乳鴿樣本在正離子模式下有明顯的分離趨勢(shì)，而對(duì)照組和0.4%加磷組之間有部分重疊，表明種鴿飼糧中添加0.8%無(wú)機(jī)磷較0.4%添加水平對(duì)14日齡乳鴿代謝的影響更大。當(dāng)乳鴿21日齡時(shí)，0.4%和0.8%加磷組有部分重疊，而對(duì)照組與其他兩組樣品能明顯分開，表明對(duì)照組與其他加磷組相比乳鴿代謝有明顯不同。為了驗(yàn)證PLS-DA模型是否存在過擬合，對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，以確保后續(xù)結(jié)果可靠，設(shè)置檢驗(yàn)為200次，R2和Q2分別用來評(píng)價(jià)PLS-DA模型的解釋能力和預(yù)測(cè)能力，累計(jì)值越大，說明模型越穩(wěn)定可靠，驗(yàn)證模型結(jié)果（圖3）顯示Q2截距小于R2，Q2回歸線截距小于0，且回歸直線呈現(xiàn)左低右高的趨勢(shì)，表明PLS-DA模型穩(wěn)健可靠，未發(fā)生過擬合，可進(jìn)一步根據(jù)VIP分析篩選差異代謝物。

表5 飼糧加磷水平對(duì)不同日齡乳鴿小腸NaPi-IIb基因表達(dá)水平的影響

數(shù)據(jù)為每組6個(gè)樣品的平均值（n=6）。NaPi-IIb mRNA表達(dá)水平是以β-actin mRNA表達(dá)水平為基礎(chǔ)的相對(duì)數(shù)值，且用對(duì)照組乳鴿十二指腸樣品基因表達(dá)的ΔCt平均值校正其余各組分析值

Each value represents the mean of 6 replicates (n=6). Data were presented as the mean fold changes in relative expression of NaPi-IIb, compared with β-actin, calculated relative to the respective values in duodenum of squabs in the control group

NaPi-Ⅱa mRNA表達(dá)水平是以β-actin mRNA表達(dá)水平為基礎(chǔ)的相對(duì)數(shù)值，且用對(duì)照組乳鴿腎臟該基因表達(dá)的ΔCt平均值校正其余各組分析值。a,b柱形圖上方字母不同表示差異顯著（P＜0.05）

表6 飼糧加磷水平對(duì)不同日齡乳鴿小腸和腎臟PiT-1和PiT-2基因表達(dá)水平的影響

數(shù)據(jù)為每組6個(gè)樣品的平均值（n=6）。同行標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.01），同行標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。PiT-1和PiT-2 mRNA表達(dá)水平是以β-actin mRNA表達(dá)水平為基礎(chǔ)的相對(duì)數(shù)值，且用對(duì)照組乳鴿十二指腸樣品相應(yīng)基因表達(dá)的ΔCt平均值校正其余各組分析值

Each value represents the mean of 6 replicates (n=6). Means within the same row lacking a common upper superscript differ (＜0.01), means within the same row lacking a common lower superscript differ (＜0.05). Data were presented as the mean fold changes in relative expression of PiT-1 and PiT-2 respectively, compared with β-actin, calculated relative to the respective values in duodenum of squabs in the control group

Component1第一主成分解釋度，Component2第二主成分解釋度：（A1）正離子模式，14日齡；（A2）負(fù)離子模式，14日齡；（B1）正離子模式，21日齡；（B2）負(fù)離子模式，21日齡

通過單因素ANOVA檢驗(yàn)值初步篩選對(duì)照組、0.4%和0.8%加磷組乳鴿血清中的差異代謝物（＜0.05），在14和21日齡乳鴿樣本中分別篩選出110和39種差異代謝物，再通過PLS-DA模型的VIP值對(duì)差異代謝物進(jìn)一步檢驗(yàn)（VIP＞1），篩選VIP＞1、＜0.05的代謝物為組間差異代謝物。因?yàn)樯鲜鯬LS-DA檢驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)照組和加磷組樣品區(qū)別大于不同加磷水平組，所以本文僅討論對(duì)照組與加磷組（0.4%和0.8%）的比較結(jié)果。

14日齡時(shí)對(duì)照組和0.4%加磷組共篩選出21種差異代謝物，包括9種正離子和12種負(fù)離子化代謝物，其中有6種豐度顯著上調(diào)（＜0.05），15種豐度顯著下調(diào)（＜0.05），注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的差異代謝物可分為如下6種類型：脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子（10種）、有機(jī)酸及其衍生物（3種）、苯基丙酮和聚酮（2種）、苯系物（1種）、有機(jī)氧化合物（1種）和有機(jī)雜環(huán)化合物（1種）。14日齡時(shí)對(duì)照組和0.8%加磷組共鑒定出37種差異代謝物，包括13種正離子和24種負(fù)離子化代謝物，其中有4種豐度顯著上調(diào)（＜0.05），33種豐度顯著下調(diào)（＜0.05），注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的差異代謝物可分為如下7種類型：脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子（10種）、有機(jī)酸及其衍生物（10種）、有機(jī)雜環(huán)化合物（8種）、苯系物（2種）、苯基丙酮和聚酮（2種）、木酚素、新木酚素和相關(guān)化合物（1種）和有機(jī)氧化合物（1種）。

（A1）正離子模式，14日齡；（A2）負(fù)離子模式，14日齡；（B1）正離子模式，21日齡；（B2）負(fù)離子模式，21日齡

21日齡時(shí)對(duì)照組和0.4%加磷組共鑒定出15種差異代謝物，包括8種正離子和7種負(fù)離子化代謝物，其中有10種豐度顯著上調(diào)（＜0.05），5種豐度顯著下調(diào)（＜0.05），注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的差異代謝物可分為如下5種類型：脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子（6種）、有機(jī)酸及其衍生物（3種）、苯基丙酮和聚酮（1種）、苯系物（1種）和有機(jī)聚合物（1種）。21日齡時(shí)對(duì)照組和0.8%加磷組共鑒定出22種差異代謝物。包括7種正離子和15種負(fù)離子化代謝物，其中有12種豐度顯著上調(diào)（＜0.05），10種豐度顯著下調(diào)（＜0.05），注釋到HMDB數(shù)據(jù)庫(kù)的差異代謝物可分為如下4種類型：脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子（11種）、有機(jī)酸及其衍生物（7種）、苯系物（2種）和有機(jī)氧化合物（1種）。由此可知定性到的與試驗(yàn)處理相關(guān)的大多數(shù)差異代謝物為脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子，其次是有機(jī)酸及其衍生物。表7和8分別列出了14和21日齡時(shí)對(duì)照組和2個(gè)加磷組之間共同的差異代謝物的質(zhì)譜信息、VIP、表達(dá)及值情況，14日齡時(shí)共同差異代謝物有9種，21日齡共同差異代謝物有4種。

利用MetaboAnalyst軟件對(duì)乳鴿血清中的差異代謝物進(jìn)行KEGG通路富集分析。當(dāng)校正值＜0.05時(shí)，認(rèn)為此通路存在顯著富集情況，試驗(yàn)結(jié)果表明，14日齡時(shí)對(duì)照組和0.4%加磷組乳鴿血清樣本中21種具有顯著差異的代謝物共注釋到2條顯著富集的代謝通路，主要涉及消化功能（膽汁分泌）及碳水化合物代謝（戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化）；而同日齡對(duì)照組和0.8%加磷組差異代謝物注釋到維生素B6及能量代謝（氧化磷酸化）途徑，但校正值未達(dá)到顯著水平（表9）；21日齡時(shí)對(duì)照組和0.4%加磷組乳鴿血清樣本中15種具有顯著差異的代謝物共注釋到2條顯著富集的代謝通路，主要涉及脂質(zhì)代謝（膽酸合成）及感官系統(tǒng)（味覺傳導(dǎo)）；而同日齡對(duì)照組和0.8%加磷組差異代謝物注釋到神經(jīng)系統(tǒng)（多巴胺能突觸）、內(nèi)分泌系統(tǒng)（催乳素和胰高血糖素信號(hào)通路）、碳水化合物代謝（檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝）、氨基酸代謝（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、β-丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸及組氨酸代謝）、二級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成（Monobactam）、感官系統(tǒng)（味覺傳導(dǎo)）、維生素代謝（硫胺素）、轉(zhuǎn)錄（氨基酰-tRNA生物合成）及消化功能（蛋白質(zhì)消化和吸收）等（校正＜0.05）。

表8 21日齡乳鴿血清中對(duì)照組與2個(gè)加磷組之間的共同差異代謝物

表9 14和21日齡乳鴿血清中對(duì)照組與加磷組之間的差異代謝物KEGG通路富集分析

3 討論

3.1 鴿乳鈣、磷含量

在乳鴿出殼的前幾天，親鴿嗉囊上皮細(xì)胞層開始脫落并分泌一種物質(zhì)——鴿乳，鴿乳是乳鴿早期生長(zhǎng)過程中獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的唯一來源，前人研究表明乳鴿相對(duì)生長(zhǎng)速度快、生長(zhǎng)強(qiáng)度大，與鴿乳所提供的營(yíng)養(yǎng)密不可分[18, 22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明隨著親鴿日糧中無(wú)機(jī)磷添加水平的增加，鴿乳中的磷含量極顯著上升，說明親鴿采食的飼料營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)其分泌的鴿乳的營(yíng)養(yǎng)成分具有顯著影響。所有處理組飼糧中Ca含量均為1.40%，但0.8%添加組的鴿乳鈣含量極顯著低于其余各組。雞飼糧中適宜的鈣磷比一般為2﹕1到1﹕1，本試驗(yàn)0.8%無(wú)機(jī)磷添加組種鴿飼糧鈣磷比雖在此適宜范圍內(nèi)，其分泌的鴿乳中鈣含量卻降低，說明鴿體內(nèi)對(duì)磷的利用情況可能不同于雞，本研究團(tuán)隊(duì)前期研究表明鴿嗉囊中的微生物多樣性最豐富[23]，ZELLER等[24]證明微生物來源的內(nèi)源性和外源添加的植酸酶在肉雞嗉囊中對(duì)降解植酸具有協(xié)同作用，故有理由推測(cè)鴿對(duì)飼料中植酸磷的利用優(yōu)于雞，從而對(duì)添加高磷飼料的耐受性較差，另一方面，也有報(bào)道指出肉雞攝入高磷不利于體內(nèi)鈣的代謝[25-26]，當(dāng)飼糧含磷量為1.10%—1.15%（鈣水平為0.9%）時(shí)肉雞采食量和日增重均明顯降低[27]，本試驗(yàn)中高磷組鴿乳鈣含量顯著降低的產(chǎn)生原因有待進(jìn)一步研究。

鴿乳富含礦物元素[28]，本試驗(yàn)中鴿乳鈣含量隨著日齡（7—21 d）增長(zhǎng)而上升，而磷含量隨著日齡（7—21 d）增長(zhǎng)而下降，前人也報(bào)道鈣含量隨日齡（1—28 d）增加線性增加，磷含量線性減少[29]，0—3日齡鴿乳中Ca的含量比4—6日齡中降低11.8%，P提高18.2%[30]，本次研究結(jié)果與前人報(bào)道一致，鴿乳中礦物元素的變化趨勢(shì)可能與乳鴿在不同生長(zhǎng)階段的生理需求有關(guān)。

3.2 血清鈣、磷、ALP活性和PTH水平

已知血清磷是反映機(jī)體磷營(yíng)養(yǎng)水平的敏感指標(biāo)，本試驗(yàn)中乳鴿血清磷未受試驗(yàn)處理的影響，表明乳鴿能高效利用鴿乳中的磷，同時(shí)對(duì)血磷含量具有一定的調(diào)控能力，其值維持在一定生理范圍內(nèi)，不隨鴿乳磷含量的變化而變化。但0.8%加磷組乳鴿血清鈣含量極顯著低于0.2%和0.4%組，有意思的是，乳鴿血清中鈣含量的變化趨勢(shì)與飼糧加磷對(duì)鴿乳中鈣含量的影響結(jié)果一致，即高磷處理不僅降低了鴿乳鈣含量，也降低了乳鴿血清鈣水平，這驗(yàn)證了鴿對(duì)高磷飼料的耐受性較差的說法[21]。

PTH是參與調(diào)控鈣磷代謝的重要激素之一，其主要作用是維持血鈣濃度正常，通過加強(qiáng)破骨作用，使鈣從骨中動(dòng)員出來。此外，PTH通過破骨細(xì)胞活動(dòng)使骨磷進(jìn)入血液。前人報(bào)道飼糧中添加0%—0.45%無(wú)機(jī)磷對(duì)22—42日齡肉仔雞血清PTH水平無(wú)顯著影響[31]，本試驗(yàn)中乳鴿PTH的分泌也未受試驗(yàn)處理的影響，與前人報(bào)道一致。此外，飼糧磷缺乏對(duì)7—42日齡肉雞血清ALP活力無(wú)顯著影響[32]，本試驗(yàn)中乳鴿血清ALP活性未受鴿乳磷水平的影響，其變化趨勢(shì)與肉雞報(bào)道一致。本研究中ALP活力和PTH水平均隨著乳鴿日齡增加顯著降低，這可能與幼齡動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

3.3 磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體（NaPi-IIa、NaPi-IIb、PiT-1和PiT-2）基因表達(dá)

目前國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為，雞等家禽腸道磷吸收的主要部位是小腸[33]，而磷在小腸各段中的主要吸收部位具有種屬特異性，利用結(jié)扎腸段技術(shù)研究磷在哺乳動(dòng)物小腸中的主要吸收部位時(shí)發(fā)現(xiàn)，大鼠小腸磷吸收的主要部位是十二指腸和空腸，而小鼠的主要部位是回腸[34]。目前尚未查閱到有關(guān)鴿體內(nèi)磷吸收特性的研究報(bào)道，由于鴿為飛禽，腸道前段發(fā)揮的生理功能更為重要，故本試驗(yàn)比較了乳鴿十二指腸和空腸段磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)情況。不同日齡乳鴿十二指腸和空腸NaPi-Ⅱb mRNA表達(dá)水平均無(wú)差異，7和14日齡十二指腸和空腸PiT-1表達(dá)無(wú)差異，14和21日齡十二指腸和空腸PiT-2表達(dá)也無(wú)差異，結(jié)果表明磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因表達(dá)量在十二指腸與空腸之間幾乎無(wú)區(qū)別，而肉雞NaPi-Ⅱb mRNA主要在十二指腸表達(dá)，空腸次之，回腸幾乎不表達(dá)；且腸道后段是PiT-1和PiT-2基因的主要表達(dá)部位[35]。磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)量在肉鴿腸道各段之間的差異小于肉雞可能與其生理特點(diǎn)有關(guān)，鴿消化道與體型的比例是7﹕1，而雞是8﹕1，較短的消化道的優(yōu)點(diǎn)主要是有利于飛行，腸道長(zhǎng)度較短可通過發(fā)育良好的腸絨毛網(wǎng)以及腸道內(nèi)酸性更強(qiáng)進(jìn)行補(bǔ)償。

有研究報(bào)道，低磷日糧可促進(jìn)肉仔雞小腸中NaPi-Ⅱb mRNA的表達(dá)[33, 35]，但本試驗(yàn)中各日齡乳鴿小腸NaPi-IIb表達(dá)水平隨親鴿飼糧磷含量增加均有上升趨勢(shì)，且飼糧添加磷顯著促進(jìn)7和14日齡乳鴿磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體PiT-1的基因表達(dá)，21日齡時(shí)0.4%加磷組PiT-2 mRNA表達(dá)量最高。肉雞試驗(yàn)表明，0.45%非植酸磷水平組7、14和21日齡肉仔雞十二指腸PiT-1 mRNA表達(dá)量顯著低于對(duì)照組[35]，由上可知，本試驗(yàn)結(jié)果有別于肉雞磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體表達(dá)隨飼糧磷水平的變化規(guī)律，原因可能與動(dòng)物種類不同有關(guān)，表明鴿腸道對(duì)磷的吸收調(diào)控可能不同于雞，關(guān)于鴿體內(nèi)磷轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)及其調(diào)控未見任何報(bào)道，具體作用機(jī)制尚有待研究。

在正常生理?xiàng)l件下，腎臟是無(wú)機(jī)磷排泄的主要途徑。在不同的飼糧磷情況下，關(guān)于腸道磷吸收及腎臟磷排泄有兩種不同的觀點(diǎn)，一種認(rèn)為當(dāng)飼糧磷超過需要量時(shí)，腸道磷吸收會(huì)降低[36]，但另有研究者認(rèn)為，該情況下腸道磷吸收不會(huì)降低，只是腎臟磷的排泄增加[37]。另外腎臟還具有重吸收磷的功能，本試驗(yàn)7和14日齡乳鴿PiT-1和PiT-2 mRNA在腎臟的表達(dá)量均極顯著高于腸道，表明PiT-1和PiT-2在幼齡乳鴿腎臟重吸收磷過程中具有重要作用，而隨著年齡增長(zhǎng)，腸道發(fā)育成熟，其在腎臟中的重要性降低。此外，雞腎臟中存在磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NaPi-Ⅱa，其在腎臟的磷重吸收中發(fā)揮重要作用[38-39]。隨飼糧非植酸磷水平增加，22—42日齡肉雞腎臟NaPi-Ⅱa mRNA表達(dá)量呈線性下降[31]，但41周齡矮小型蛋雞腎臟NaPi-Ⅱa mRNA表達(dá)量隨日糧中非植酸磷水平的提高而線性增加[40]。而本試驗(yàn)中0.8%加磷組14日齡乳鴿NaPi-Ⅱa表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組和0.4%組。上述研究結(jié)果不一致的原因可能與試驗(yàn)動(dòng)物的種類、年齡和飼糧營(yíng)養(yǎng)組成等因素有關(guān)。

3.4 乳鴿血清非靶向代謝組

眾所周知，磷以多種形式參與動(dòng)物體內(nèi)眾多的物質(zhì)形成及代謝過程，如與脂蛋白結(jié)合形成磷脂蛋白，參與細(xì)胞膜磷脂雙分子層的構(gòu)建；以ATP形式參與體內(nèi)能量代謝，為維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)并發(fā)揮其生理功能提供能量；以磷酸根形式參與機(jī)體遺傳物質(zhì)DNA、RNA的組成，在動(dòng)物遺傳信息的傳遞中發(fā)揮重要作用。此外，磷還具有維持體液酸堿穩(wěn)態(tài)等作用。目前家禽磷營(yíng)養(yǎng)研究大多集中在不同日糧磷水平對(duì)體內(nèi)特異性功能指標(biāo)的調(diào)控作用，而關(guān)于鴿對(duì)磷吸收代謝未見報(bào)道。代謝組學(xué)使用高通量方法定量測(cè)定生物樣品中的小分子代謝物，被認(rèn)為是疾病早期診斷、生物標(biāo)志物鑒定和代謝途徑表征的有力工具。為初步了解快速生長(zhǎng)期乳鴿的磷穩(wěn)態(tài)及其營(yíng)養(yǎng)作用，本試驗(yàn)研究了親鴿飼糧中添加不同水平無(wú)機(jī)磷對(duì)乳鴿血清非靶向代謝物的影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，14和21日齡加磷組和對(duì)照組乳鴿之間的顯著差異代謝物中約50%為脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子，其次是有機(jī)酸及其衍生物，再次是苯系物等某些有機(jī)物，證明了磷在肉鴿體內(nèi)的主要功能為參與脂肪代謝。磷是三磷酸腺苷、核酸、磷脂和多種輔酶的重要組成成分，在糖降解、能量和脂質(zhì)代謝等過程中發(fā)揮著重要的作用。飼料缺磷可導(dǎo)致黑鯛體內(nèi)氧化磷酸化受損，從而抑制三羧酸循環(huán)[41]。肉雞[27]和蛋雞[42]試驗(yàn)也表明，日糧磷水平的提高使得肝臟脂肪酶活性顯著增加，且飼喂低磷飼糧的肉雞胸肉脂肪酸含量較高，高磷可能影響雞肉中飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸含量，尤其是長(zhǎng)鏈脂肪酸，高磷抑制肝臟中蘋果酸酶活性，提高胰腺脂肪酶活性[27]，而關(guān)于磷對(duì)肉鴿脂肪代謝的調(diào)控機(jī)制有待研究。此外，與對(duì)照組相比，14日齡加磷組乳鴿血清中的小分子代謝物葫蘆素B顯著下調(diào)，飼糧中添加0.4%和0.8%無(wú)機(jī)磷使血清中葫蘆素B含量分別降低為對(duì)照組的56%和50%，對(duì)小鼠的研究表明葫蘆素B可通過誘導(dǎo)血管生成從而促進(jìn)骨再生，臨床上有望作為骨骼缺失的治療藥物[43]，本試驗(yàn)表明磷參與調(diào)控肉鴿骨骼組織的形成和維持[21]，其具體調(diào)控機(jī)制有待深入研究。

試驗(yàn)中差異代謝物涉及到的代謝途徑包括碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝以及遺傳物質(zhì)合成等。受飼糧添加磷影響的碳水化合物代謝途徑涉及戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝，其中檸檬酸和琥珀酸（亞乙基二羧酸）均被認(rèn)為是三羧酸循環(huán)中的關(guān)鍵參與者；受飼糧添加磷影響的氨基酸代謝途徑有苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、β-丙氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸及組氨酸代謝，其中丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸代謝通路都與嘌呤核苷酸的從頭合成有關(guān)；磷還參與體內(nèi)膽汁分泌、膽酸合成等脂質(zhì)代謝。綜上所述，磷在肉鴿體內(nèi)參與多種非常重要的代謝過程。

4 結(jié)論

（1）親鴿飼糧中的磷水平顯著影響其分泌的鴿乳含磷量，而乳鴿血磷含量較穩(wěn)定，但是高磷組血鈣含量下降，這有可能表明乳鴿對(duì)高磷耐受性較差。

（2）乳鴿腎臟中PiT-1和PiT-2 mRNA表達(dá)大多隨飼糧磷含量增加而增加，具體調(diào)控機(jī)制有待研究。

（3）血液代謝組數(shù)據(jù)表明磷參與乳鴿體內(nèi)多種重要的代謝過程，如脂肪代謝和骨骼礦化等。

致謝：感謝北京密云霍書林養(yǎng)殖場(chǎng)、河北靈壽縣田佳家庭農(nóng)場(chǎng)和山東武城縣廣運(yùn)林海肉鴿養(yǎng)殖家庭農(nóng)場(chǎng)在試驗(yàn)實(shí)施過程中提供的幫助。

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Influences of Phosphorus Level in Diet of Parent Pigeons on Biochemical Index, Untargeted Metabolomics Profile of Serum, and Gene Expression of Phosphate Transporters in Squabs

1Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097;2College of Life Science and Food Engineering, Hebei University of Engineering, Handan 056009, Hebei;3College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070

【Objective】The aim of this study was to investigate the effects of different levels of inorganic phosphorus (P) on serum biochemical parameters, non-targeted metabolites, and expression of phosphate transporter genes in the small intestine and kidney of pigeon, so as to provide a theoretical basis for the regulation of phosphorus nutrition in pigeon during the period of rapid growth.【Method】A total of 192 pairs of parental Silver King pigeons (40 weeks of age) were randomly allocated to four treatment groups, each consisting of eight replicates of 6 pairs per replicate. The study lasted for 46 days including the phases of egg-hatching and squab-rearing. Dietary treatments included the basal diet (containing 0.3% of P), the basal diet supplemented with 0.2%, 0.4%, or 0.8% inorganic P. The calcium (Ca) content in diets of parent birds were kept at 1.40% in every group. The levels of Ca, P, PTH and ALP activity in serum of 7, 14 and 21 d old squabs were determined, and the content of Ca and P in crop milk were analyzed. The gene expression of Pi transporters (NaPi-Ⅱb, PiT-1, and PiT-2) in small intestine (duodenum and jejunum), and Pi transporters (NaPi-Ⅱa, PiT-1, and PiT-2) in kidney of squabs were determined. Serum metabolome profiles of 14 and 21 d old squabs in the groups of control, 0.4% and 0.8% P-supplemented were analyzed. 【Result】(1) The P contents in crop milk sampled from squabs were very significantly (＜0.01) increased by P supplementation in diets of parent pigeons. (2) No significant effect of P supplementation in diet of parent birds on serum P level, ALP activity and PTH level of squabs were observed in this study. However, the serum Ca content in birds of 0.8% P supplemental group decreased very significantly (＜0.01). The serum ALP and PTH level of squabs significantly decreased with increased age (＜0.05).(3) There was a tendency of increased gene expression of NaPi-IIb in small intestine of squabs with dietary P levels of breeding birds, however, the difference was not significant (＞0.05). The expression profile of PiT-1 and PiT-2 in kidney of squabs at the age of 7 and 14 d were very significantly higher (＜0.01) than those in duodenum and jejunum. However, the difference of the mRNA expression level of PiT-1 and PiT-2 between kidney and intestine was not observed at the age of 21 d, and the PiT-1 value of kidney samples was even lower than that of jejunum. The mRNA expression levels of PiT-1 of 7 and 14 d old squabs were significantly increased by dietary P levels of breeding birds. The mRNA expression of PiT-2 in the group of dietary 0.4% P supplementation was significantly higher (＜0.05) than that of 0.8% group when the squabs were 7 and 21 d old. The interaction of tissue and dietary P levels was significant (＜0.05) on PiT-1 mRNA level of 7 and 14 d, and PiT-2 mRNA level of 21 d old birds. The mRNA expression level of NaPi-IIa in kidney of 14 d squabs significantly decreased in the group of 0.8% P supplementation, compared with the control and 0.4% group. (4) At the age of 14 and 21 d, about half of the significantly different metabolites among the control and P-added groups were included in the category of lipids and lipid-like molecules, organic acids and derivatives was the second, and benzenoids next. The biological pathways involved in the metabolism of differentially expressed metabolites were mainly carbohydrate metabolism, metabolism of protein and amino acids, translation and lipid metabolism etc. 【Conclusion】(1) There was a significant effect of P supplementation in the diet of parent pigeons on P content in crop milk fed to squabs. The values of serum P of young birds were stable. However, the serum Ca of squabs in the group of highest dietary P treatment decreased, which might indicate that pigeons were intolerant to high dietary P level. (2) The expression levels of P transporters (PiT-1 and PiT-2) mRNA in the kidney mostly increased with dietary P supplementation. The regulation mechanisms of P reabsorption in pigeons need to be studied further. (3)The serum metabolome profiles of squabs indicated that P was involved in many important metabolic processes, such as lipid metabolism and bone mineralization etc.

phosphorus; pigeon; biochemical index; metabolome; transporter

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.23.017

2023-03-15；

2023-05-25

北京市農(nóng)林科學(xué)院改革與發(fā)展課題（XMS201906）、北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所課題（201705）

安勇，E-mail：982356929@qq.com。通信作者計(jì)峰，E-mail：jifengji@sina.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）