BRD4 通過靶向GSTP1 調(diào)控食管癌TE-1細(xì)胞順鉑敏感性

張獻(xiàn)棣 陳明軍

作者單位：212000 江蘇大學(xué)京江學(xué)院檢驗(yàn)科

食管癌是常見惡性腫瘤類型, 全球每年新發(fā)約60 萬例, 因其死亡人數(shù)超54 萬例, 其中我國約占50%［1］。由于早期癥狀不明顯, 缺少漿膜易侵犯和轉(zhuǎn)移, 治療后復(fù)發(fā)率較高, 食管癌患者5 年總體生存率為25%～47%［2,3］。目前在新輔助以及中晚期食管癌患者綜合治療方案中化療無疑發(fā)揮著關(guān)鍵作用, 因此提高化療效果以及識別早期復(fù)發(fā)的危險因素將對最終改善患者預(yù)后有重要的意義。溴結(jié)構(gòu)域蛋白4(bromodomain containing 4, BRD4)是識別蛋白賴氨酸乙?；瘹埢年P(guān)鍵結(jié)構(gòu)蛋白, 可廣泛調(diào)節(jié)表觀遺傳修飾和基因轉(zhuǎn)錄的眾多分子進(jìn)程, 近來被認(rèn)為是淋巴瘤、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的潛在治療靶標(biāo), 但其在食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用研究較少［4-7］。本研究中首次聚焦于BRD4 對食管癌化療敏感能力的影響, 基于生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析BRD4 在食管癌中的表達(dá)水平及其與化療藥物關(guān)鍵解毒酶GSTP1 之間的聯(lián)系, 結(jié)合靶向處理探究BRD4 在食管癌細(xì)胞順鉑敏感性調(diào)控中作的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及培養(yǎng)條件 TE-1 購自于上海中喬新舟生物科技, 并附有短串聯(lián)重復(fù)序列鑒定檢驗(yàn)報告；TE-1 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基, 添加終濃度為1%青霉素和鏈霉素(雙抗), 置恒溫培養(yǎng)箱37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)和傳代。

1.1.2 主要耗材和試劑 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染專用Opti MEM 培 養(yǎng) 基、雙 抗( 美 國Gibco 公 司)；FBS( 以 色列Biological Industries 公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、二甲基亞砜(DMSO)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、細(xì)胞高效RIPA 裂解液、Western blot 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑(北京索萊寶公司)；蛋白酶抑制劑Cocktails(美國ApexBio 公司)；高敏型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測曝光液、180 kDa 蛋白Marker(南京諾唯贊公司)；順鉑(Cisplatin, DDP)、(+)-JQ1 粉劑(上海Selleck 公司)；一抗稀釋液(蘇州新賽美生物科技有限公司)；兔抗人B 淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma 2, Bcl-2)、Bcl-2 關(guān)聯(lián)X 蛋白(Bcl-2-associated X protein, Bax)、谷 胱 甘 肽 硫 基 轉(zhuǎn) 移 酶P1(Glutathione S-transferase P, GSTP1) 和 鼠 抗 人GAPDH抗體(武漢三鷹公司)；兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 切割體(cleaved-caspase-3)抗體(美國CST 公司)；兔抗人BRD4 抗體(美國abcam 公司)；HRP 偶聯(lián)的抗鼠和抗兔二抗(南京川博公司)； LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國ThermoFisher 公司)；siRNA-BRD4(5'-GGAGA UGACAUAGUCUUAATT-3')、siRNA-GSTP1(5'-ACACC GTGGTCTATTTCCCAGTTCG-3')以及陰性對照(上海生工生物工程有限公司)；增強(qiáng)型CCK-8(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)驗(yàn)證 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov) 獲 取TCGA-ESCA 項 目STAR 流程的RNAseq 數(shù)據(jù)并提取TPM 格式的數(shù)據(jù), 樣本中共174 例腫瘤組織, 11 例癌旁正常組織, 采用R (4.2.1)版本, R 包：ggplot2［3.3.6］, stats［4.2.1］, car；根據(jù)數(shù)據(jù)格式特征選擇獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計并進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化, 配對樣本采用配對樣本t 檢驗(yàn)：提取對應(yīng)編號配對的癌旁和癌樣本(共計8 對), 數(shù)據(jù)處理方法：log2(value+1)；利用GEPIA2 在線分析工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/)分析BRD4 與GSTP1 分子表達(dá)相關(guān)性：設(shè)置相關(guān)系數(shù)為Pearson。

1.2.2 siRNA 及藥物處理 將TE-1 細(xì)胞接種于6 孔板中, 待細(xì)胞覆蓋率達(dá)50%左右更換為不含雙抗培養(yǎng)基, 將細(xì)胞分為3 組：陰性對照組(Negative control, 轉(zhuǎn)染無序序列)、干擾BRD4 組(轉(zhuǎn)染siRNA-BRD4)；干擾GSTP1 組(轉(zhuǎn)染siRNA-GSTP1)進(jìn)行處理, 取適量LipofectamineTM2000 和各siRNA 溶液混合于Opti MEM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染處理細(xì)胞6 h, 去除轉(zhuǎn)染試劑繼續(xù)培養(yǎng)24 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；待6 孔板TE-1 細(xì)胞數(shù)目至70%～80%左右, 去除培養(yǎng)基PBS 清洗后分別加入稀釋后含不同濃度(+)-JQ1 (25、50 和100 nM), 對照組加入等體積DMSO；(+)-JQ1 預(yù)處理對DDP 殺傷影響：采取(+)-JQ1(50 nM) 處理24 h 后加入DDP (5 μg/ml, 最高濃度液由無菌水現(xiàn)配現(xiàn)用)或等體積無菌水繼續(xù)處理24 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次或設(shè)置3 個以上復(fù)孔。

1.2.3 Western blot 檢測TE-1 細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白經(jīng)不同實(shí)驗(yàn)處理后TE-1 細(xì)胞總蛋白用含有PMSF 和蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解提取, 經(jīng)12%或15%濃度SDS-PAGE 膠電泳后轉(zhuǎn)PVDF 膜于含0.5%脫脂奶粉TBST 液中室溫封閉1 h, 凋亡相關(guān)抗體根據(jù)說明書推薦稀釋后4℃孵育PVDF 膜過夜, TBST 洗膜后孵育對應(yīng)二抗(稀釋比為1∶8000)室溫孵育1 h 后繼續(xù)洗凈即可采用ECL 化學(xué)發(fā)光自顯, 利用軟件將目的條帶灰度數(shù)值化, 并與GAPDH 的灰度值作歸一化處理后計算各蛋白表達(dá)差異。

1.2.4 CCK-8 實(shí) 驗(yàn) 檢 測(+)-JQ1 預(yù) 處 理 對TE-1 細(xì)胞DDP 敏感性的影響 將3×103個TE-1 細(xì)胞接種于96 孔 板 每 孔 中, 隨 機(jī) 分 為2 組：(+)-JQ1 處 理 組(50 nM)以及對照組(等體積DMSO 溶液), 設(shè)置5 個復(fù)孔分別繼續(xù)培養(yǎng), 24 h 后將DDP 按濃度梯度(3.125、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/ml)加入處理24 h, 并于處理結(jié)束后每孔加10 μl 的CCK-8 溶液, 避光振蕩孵育0.5～1.0 h 后在酶標(biāo)儀上分別檢測450、650 nm 波長下每孔吸光度值, 650 nm 作為參考波長進(jìn)行雙波長測定, 分 組 間 使 用R 包：ggplot2［3.3.6］, drc［3.0-1］分別計算細(xì)胞活性(百分?jǐn)?shù)), 擬合模型(log-logistic法)計算DDP 的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)值［8］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布則通過方差齊性檢驗(yàn), 兩組以上比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA), 獨(dú)立樣本采用t 檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析食管癌中BRD4 表達(dá)水平 TCGA 數(shù)據(jù)解析后結(jié)果顯示, 食管癌腫瘤組織中BRD4 的mRNA 總體表達(dá)水平相較于癌旁正常組織有明顯升高［(5.61±0.57)VS(4.80±0.59)］, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0000＜0.001)。見圖1A。進(jìn)一步通過對比配對腫瘤和癌旁正常組織樣本發(fā)現(xiàn), 食管癌患者食管癌組織中BRD4 表達(dá)水平(5.57±0.31)普遍顯著高于其癌旁正常組織的(4.77±0.44), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0016＜0.01)。見圖1B。

2.2 食管癌中BRD4 與GSTP1 表達(dá)的聯(lián)系 為揭示BRD4 與食管癌化療敏感性的聯(lián)系, 本研究使用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn), 在食管癌化療藥物耐藥形成過程中關(guān)鍵解毒結(jié)合酶GSTP1 與腫瘤組織中BRD4 表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.26, P=0.00029＜0.001)。見圖2A。結(jié)合靶向siRNA 處理Western blot 結(jié)果顯示, siRNA-BRD4 處理后食管癌TE-1 細(xì)胞中BRD4 和GSTP1 的表達(dá)水平較NC 組均有明顯升高, 而siRNA-GSTP1 后TE-1 細(xì)胞中GSTP1 表達(dá)下調(diào)未對BRD4 蛋白產(chǎn)生明顯影響。見圖2B。進(jìn)一步采取BRD4 靶向抑制劑的梯度濃度處理證實(shí), 伴隨(+)-JQ1 濃度升高TE-1 細(xì)胞中GSTP1 蛋白的表達(dá)水平較陰性對照組出現(xiàn)明顯下降趨勢, 而由于(+)-JQ1 主要是通過結(jié)合于BRD4 的溴結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用,僅在最高濃度處理(100 nM)組食管癌細(xì)胞中BRD4 出現(xiàn)表達(dá)抑制作用。見圖2C。

圖2 食管癌中BRD4 與GSTP1 表達(dá)之間聯(lián)系

2.3 (+)-JQ1 增強(qiáng)DDP 對食管癌TE-1 細(xì)胞的殺傷作用 低濃度的(+)-JQ1(50 nM)處理可引起食管癌TE-1細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)下調(diào)以及凋亡相關(guān)蛋白Bax 表達(dá)上升, 但對caspase-3 并無明顯影響, 而在與DDP 聯(lián)合應(yīng)用時可見caspase-3 的活化形式cleavedcaspase-3 的相比DDP 單獨(dú)使用組細(xì)胞有顯著表達(dá)上調(diào)。Western blot 結(jié)果表明, (+)-JQ1 預(yù)處理抑制BRD4的功能可以提高DDP 對食管癌細(xì)胞的殺傷作用。見圖3。

圖3 (+)-JQ1 預(yù)處理對DDP 殺傷TE-1 細(xì)胞的影響

2.4 靶向抑制BRD4 提高TE-1 細(xì)胞對DDP 的敏感性 CCK-8 結(jié)果顯示, 食管癌TE-1 細(xì)胞經(jīng)抑制BRD4蛋白功能［(+)-JQ1, 50 nM, 24 h］預(yù)處理后可顯著提高對化療藥物DDP 的敏感性, DMSO 對照組DDP 的IC50值為(19.43±0.59)μg/ml, 而(+)-JQ1 預(yù)處理后降至(10.46±0.24)μg/ml, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。以上結(jié)果表明, 食管癌細(xì)胞中BRD4 可能參與對化療藥物DDP 敏感性調(diào)控。見圖4。

圖4 (+)-JQ1 預(yù)處理對TE-1 細(xì)胞對DDP 的IC50 值影響

3 討論

BRD4 作為溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域(bromodomain and extra-terminal domain, BET)蛋白家族中研究較為廣泛的結(jié)合蛋白之一, 主要通過其N 端兩個串聯(lián)溴結(jié)構(gòu)域(bromodomains, BDs)即BD1 和BD2 與組蛋白質(zhì)或非組蛋白質(zhì)(主要為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)上已發(fā)生乙?；揎椀馁嚢彼釟埢嘟Y(jié)合, 進(jìn)而招募、活化正轉(zhuǎn)錄延伸因 子b(positive transcription elongation factor b, P-TEFb)到啟動子近端區(qū)域(promoter-proximal regions)磷酸化RNA 聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, PolⅡ)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄和延伸, 從而發(fā)揮調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、代謝調(diào)控和免疫應(yīng)答等作用［9-11］。因此, BRD4 的表達(dá)和功能失調(diào)與多種疾病有關(guān), 包括癌癥、免疫紊亂和代謝疾病等, 尤其是在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的BRD4 主要通過調(diào)控程序性細(xì)胞死亡(program cell death, PCD)進(jìn)程參與眾多類型腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展［12-17］。本研究中通過整理TCGA 數(shù)據(jù)庫中食管癌相關(guān)信息解析后發(fā)現(xiàn), 食管癌組織中BRD4 的mRNA 表達(dá)整體水平明顯高于癌旁正常組織；配對樣本數(shù)據(jù)也顯示, 與正常組織相比同一患者的腫瘤樣本中BRD4 出現(xiàn)明顯上調(diào)。目前腫瘤研究表明, 對于肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等患者而言, 高表達(dá)的BRD4 常與其不良預(yù)后存在密切聯(lián)系［4,6,7,18］。已有食管鱗癌相關(guān)數(shù)據(jù)指出, 異常高表達(dá)的BRD4 蛋白可以通過形成復(fù)合體直接結(jié)合到染色體 濃 縮 調(diào) 節(jié) 蛋 白2(chromosome concentration regulatory protein 2, RCC2)的啟動子區(qū)域, 進(jìn)而上調(diào)有絲分裂所必需的分子RCC2 的表達(dá)以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖［19］。然而, 對于食管癌中高表達(dá)的BRD4 是否參與治療拮抗形成, 特別是化療療效是否存在影響尚缺乏相關(guān)探討和論證。

食管癌早期診斷率偏低, 多數(shù)患者初次就診時已處于中晚期, 喪失了手術(shù)干預(yù)的意義, 除此之外超過50%的早期患者會在手術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移, 因此化療成為食管癌綜合治療中的重要手段之一［20,21］。其中, DDP 作為核心成分與其他藥物形成的不同組合是目前中晚期食管癌患者術(shù)后輔助化療標(biāo)準(zhǔn)方案, 但其臨床實(shí)際療效存在顯著個體差異, 且整體預(yù)后水平仍較差［22］。近年來的研究發(fā)現(xiàn), 以GSTP1 為代表的一類藥物代謝酶通過催化谷胱甘肽和親脂性化合物與親電中心之間的反應(yīng), 提高親電子細(xì)胞毒物的水溶性, 促進(jìn)鉑類藥物代謝, 從而影響化療療效［23,24］。本研究基于GEPIA2 數(shù)據(jù)論證發(fā)現(xiàn), 食管癌組織中BRD4 與GSTP1表達(dá)之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。由于BRD4 在眾多類型腫瘤中表現(xiàn)出的基因表達(dá)調(diào)控作用, 本研究首先通過靶向siRNA 干擾處理發(fā)現(xiàn), 在食管癌細(xì)胞中下調(diào)BRD4 處理后觀察到GSTP1 的表達(dá)抑制, 但siRNAGSTP1 處理對BRD4 表達(dá)無顯著影響。進(jìn)一步通過梯度濃度的BRD4 靶向抑制劑處理證實(shí), 食管癌中BRD4蛋白功能穩(wěn)定是維持GSTP1 持續(xù)表達(dá)的重要分子基礎(chǔ)。近來研究證實(shí), 在包括多種血液系統(tǒng)癌癥以及實(shí)體瘤中BRD4 可直接結(jié)合到Bcl-2 基因的啟動子和超增強(qiáng)子區(qū)域, 促進(jìn)凋亡抑制蛋白Bcl-2 的表達(dá)。后續(xù)研究中也初步證實(shí), 低濃度的(+)-JQ1 預(yù)處理即可下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達(dá), 同時后者阻抑蛋白Bax 出現(xiàn)一定程度的上調(diào), 而(+)-JQ1 預(yù)處理可顯著增強(qiáng)DDP 的殺傷作用。CCK-8 的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與上述結(jié)果相一致, 表明BRD4 在食管癌細(xì)胞DDP 敏感性調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

本研究首次在食管癌中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)BRD4 與化療敏感性關(guān)鍵酶GSTP1 表達(dá)之間存在聯(lián)系, 當(dāng)然也存在部分局限性, 例如無法有效回顧性分析BRD4 表達(dá)與食管癌患者預(yù)后的聯(lián)系以及化療方案療效評估的臨床意義。然而, 本研究作為基礎(chǔ)研究, 初步驗(yàn)證了BRD4對GSTP1 表達(dá)的調(diào)控作用, 同時論證了BRD4 靶向抑制對提高食管癌細(xì)胞DDP 敏感性的作用, 對接受以DDP 作為基礎(chǔ)的食管癌化療患者的預(yù)后評估具有潛在的臨床指導(dǎo)意義。