貝萊斯芽胞桿菌ZJ1油懸劑的研制及其田間防病促生效果

鄒曉璐，趙 雨，馬東麗，趙曉軍，殷 輝，任 璐

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，太原 030031）

生物農(nóng)藥因其保護(hù)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境及為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供物質(zhì)基礎(chǔ)和技術(shù)支持而受到廣泛的關(guān)注[1-2]。其中，微生物農(nóng)藥利用活體微生物或其代謝產(chǎn)物有效防治病害從而達(dá)到增產(chǎn)增益效果[1-3]。芽胞桿菌Bacillusspp.因其具有控制植物病害、促進(jìn)植物生長、提高作物產(chǎn)量等優(yōu)勢，是研制生防菌劑的良好材料。大量研究證實，貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis通過產(chǎn)生抗菌肽、抗菌蛋白等次生代謝產(chǎn)物、與病原菌競爭營養(yǎng)、誘導(dǎo)抗性等多種方式表現(xiàn)出良好的抑菌作用[4,5]，作為生防制劑顯示出廣闊的應(yīng)用前景[6]。謝梓語等[7]研究發(fā)現(xiàn)108cfu/mL 枯草芽胞桿菌BacillussubtilisB1409 菌液對番茄早疫病保護(hù)效果為67.82%，治療效果為41.22%，且有明顯促進(jìn)番茄植株生長作用。武君潔等[8]研制的3.2×1010cfu/mL 枯草芽胞桿菌B.subtilisYN2014090 懸浮劑300 倍稀釋施藥11 d 后對番茄白粉病田間防效高達(dá)94.34%。有大量文獻(xiàn)表明，芽胞桿菌及其制劑可以有效防治番茄灰霉病和番茄早疫病，但是，國內(nèi)已登記使用防治蔬菜灰霉病的芽胞桿菌制劑中尚無貝萊斯芽胞桿菌，且懸浮劑僅有一種，其余均為可濕性粉劑；暫未見防治番茄早疫病的芽胞桿菌制劑登記使用[9]。

大多數(shù)生防制劑防治效果穩(wěn)定性較差，其開發(fā)處于試驗探索階段，尚未大規(guī)模應(yīng)用，如何提高生防菌的定殖能力和藥效持久性成為生防制劑應(yīng)用中的主要挑戰(zhàn)[10,11]。通過添加相應(yīng)功效的助劑，將生防菌制劑化，有助于確保生防菌在制劑加工、貯存及實際應(yīng)用中保持活力[11-13]。油懸劑是在助劑作用下，將不溶或難溶于水的原藥分散到油相中形成穩(wěn)定均勻的分散體系，其有利于芽胞桿菌活性成分的穩(wěn)定[14]，且具有成本低、環(huán)境相容性好、持效性好等優(yōu)勢[15]。不同劑型的芽胞桿菌制劑有較好的田間防治效果。許世洋等[16]研制了108cfu/mL 生防菌混合液劑SC7 防治由Fusariumavenaceum、Bipolarissorokiniana引起的青稞根腐病，顯著降低發(fā)病率至3%并提高產(chǎn)量。魏嬌洋等[17]研制的7.4×107cfu/g 解淀粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciensX-278 片劑比其發(fā)酵液在棉花根、莖內(nèi)的定殖能力顯著提高，持效期延長，提高了棉花產(chǎn)量，且對棉花黃萎病有較好的田間防效。

本研究前期篩選到1 株對番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌有良好抑制作用的植物內(nèi)生細(xì)菌ZJ1，經(jīng)鑒定為貝萊斯芽胞桿菌（16S rDNA No:MW856791 和gyrA NCBI No:MW879207）[18]。在此基礎(chǔ)上，通過助劑篩選，研制貝萊斯芽胞桿菌ZJ1 油懸劑，并測定其田間防效和促生作用，以期為該菌株的田間應(yīng)用及市場化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisZJ1、番茄早疫病菌Alternariasolani和番茄灰霉病菌Botrytiscinerea，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物化學(xué)保護(hù)實驗室保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基（去皮馬鈴薯200 g、乳糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水定容至1000 mL、pH 自然），NA 培養(yǎng)基（蛋白胨10 g、NaCl 5 g、牛肉膏3 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水定容至1000 mL、pH 7.4～7.6），YSP 培養(yǎng)基（乳糖30 g、酵母粉12.5 g、牛肉膏5 g、蛋白胨 5 g、蒸餾水1500 mL、pH 7.0）。

1.1.3 試劑 CaCO3、CaCl2、抗壞血酸、糊精、乙醇（北京索萊寶科技有限公司）；K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、羧甲基纖維素鈉、十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、十二烷基磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈣、木質(zhì)素磺酸鈉，吐溫80（TW-80），OP-10，乳化劑1602（上海麥克林生化科技有限公司）；兩性霉素、灰黃霉素、制霉菌素、乙二醇、丙二醇、丙三醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。以上試劑均為分析純。50%腐霉利可濕性粉劑（浙江威爾達(dá)化工有限公司）；1000 億孢子/g 枯草芽孢桿菌（廣西貝嘉爾生物化學(xué)制品有限公司）、花生油、芝麻油（昊?；瘜W(xué)（上海）有限公司）、胡麻油（湖北恒景瑞化工有限公司）、葵花油（上?？评噭┯邢薰荆?。冷凍離心機（金壇區(qū)金城春蘭實驗儀器廠）、冷凍干燥機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、智能恒溫震蕩培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 貝萊斯芽胞桿菌ZJ1 抑菌活性測定

以番茄早疫病和灰霉病為靶標(biāo)，采用平板對峙法測定菌株ZJ1 抑菌活性，挑取直徑為5 mm 的病原菌菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基中央，用接種環(huán)蘸取菌株ZJ1 點接于距平板中央2 cm 處，以不接細(xì)菌的PDA 平板為對照，每處理重復(fù)3 次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，測量菌落直徑，并計算抑菌率。抑制率（%）＝（對照菌落直徑－處理菌落直徑）/（對照菌落直徑－菌餅直徑）×100。

1.3 菌株ZJ1 油懸劑的制備

1.3.1 ZJ1 種子液及發(fā)酵液制備 于固體NA 平板上活化菌株ZJ1，用接種環(huán)挑取菌株ZJ1 放入YSP 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、190 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h 為種子液。將ZJ1 種子液按1%（V/V）的接種量接入YSP 液體培養(yǎng)基中28 ℃、190 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h 為發(fā)酵液（108cfu/mL）。

1.3.2 溶劑篩選 將花生油、胡麻油、葵花油和芝麻油分別取20 mL 放入滅菌錐形瓶中，再分別加入2 mL的菌株ZJ1 發(fā)酵液，密封后室溫下貯存。取1 mL 上述處理液分別加入100 mL 的YSP 培養(yǎng)液中，稀釋涂布平板法測定其芽胞含量，每7 d 測量一次，每處理3 次重復(fù)。

1.3.3 乳化劑及比例篩選 將選出的最佳溶劑取20 mL 分別放入滅菌的錐形瓶中，分別加入2 mL 的吐溫80、OP-10 和乳化劑1602 混勻，再分別添加2 mL 發(fā)酵液，密封后室溫下貯存。測定芽胞含量，選出最適乳化劑。將選出的最適乳化劑分別制成濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%（v/v）的乳化劑水溶液，加入2 mL 的發(fā)酵液。在（25±1）℃下振蕩培養(yǎng)24 h，測定芽胞含量，篩選最佳配比及用量。

1.3.4 抗生素及比例篩選 將已篩選出的溶劑和乳化劑以最佳配比與發(fā)酵液混合制成乳液。將兩性霉素、灰黃霉素、制霉菌素分別按照5、15、25、50 μg/mL 的濃度加入乳液中，以番茄早疫病菌為指示菌接于PDA平板中央，在距離菌餅2 cm 處打四個孔，每孔加入50 μL 上述處理液，每處理3 次重復(fù)，以不加抗生素為對照，在（25±1）℃下恒溫培養(yǎng)3～4 d，計算抑菌率。

1.3.5 防凍劑及比例篩選 將防凍劑氯化鈣、乙醇、乙二醇、丙二醇和丙三醇按10%的比例加入菌株ZJ1發(fā)酵液并充分混合，以不加防凍劑的發(fā)酵液為對照，測定其芽胞含量。將選出的最適防凍劑，按2%、4%、6%、8%和10%分別加入10 mL 發(fā)酵液中，置于（0±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以加蒸餾水為對照，（25±1）℃恒溫培養(yǎng)24 h。每處理3 次重復(fù)。測定其芽胞含量，計算芽胞存活率，篩選出最佳配比。

高溫不僅會使籽粒變小，而且影響籽粒灌漿速率，還會使玉米花絲不能正常授粉而形成稀賴籽和禿頂，直接影響玉米產(chǎn)質(zhì)量。一般來說。25℃是玉米籽粒生長適宜溫度，溫度每超過這個溫度1℃，玉米產(chǎn)量降低3%-4%?；ê蟾邷貢档图?xì)胞分裂速度，縮短玉米主生命周期，影響植株物質(zhì)積累，結(jié)果最終使粒數(shù)減少，籽粒發(fā)育不充分，粒重降低。

1.3.6 潤濕分散劑及比例篩選 將3 種潤濕劑（SDS、十二烷基磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉）、4 種穩(wěn)定劑（CaCO3、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4）、2 種分散劑（木質(zhì)素磺酸鈣、木質(zhì)素磺酸鈉）分別以5%的添加量加入100 mL YSP 培養(yǎng)基，接入5 mL 菌株ZJ1 種子液，190 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，每處理3 次重復(fù)，以不加潤濕分散劑為對照，測定其芽胞含量，計算芽胞存活率，將篩選出的最佳潤濕劑（1%、2%、4%、5%）、穩(wěn)定劑（1%、2%、4%、5%）和分散劑（0.5%、1%、2%、5%）分別按照相應(yīng)的比例添加到100 mL YSP 培養(yǎng)基中，接入5 mL 種子液，190 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以添加5%的量為對照，每處理3 次重復(fù)。測定其芽胞含量，篩選出最佳配比。

1.3.7 保護(hù)劑篩選 將保護(hù)劑糊精、抗壞血酸按5%的添加量分別加到已制備的油懸劑中，以不加保護(hù)劑為陰性對照，在紫外燈下分別照射6、12 和24 h，以不加保護(hù)劑且不照射紫外為空白對照，每處理3 次重復(fù)。測定其芽胞含量，計算抑菌率。

1.3.8 制劑加工工藝 菌株ZJ1 發(fā)酵液置于50 mL 離心管，在4 ℃和10000 r/min 條件下通過冷凍離心機離心10 min，去除上清液得到芽胞沉淀。將芽胞沉淀放入-40 ℃冷凍箱冷凍12 h 后，放入預(yù)冷30 min 的冷凍干燥機中進(jìn)行冷凍干燥8 h 得到菌株母粉，將上述篩選出的有較好生物相容性的固體助劑粉碎后過325目篩，一同溶于最佳溶劑中并加入其余篩選出的液體助劑混合均勻，制成貝萊斯芽胞桿菌ZJ1 油懸劑。

1.4 油懸劑質(zhì)量檢測

觀察剛制備好的5.75×109cfu/mL ZJ1 油懸劑的顏色及分散情況。農(nóng)藥懸浮率按照GB/T 14825-2006[19]測定，pH 值按GB/T 1601-1993[20]測定，水分按GB/T 1600-1979（1989）[21]測定，細(xì)度按GB/T 16150-1995[22]測定，傾倒性按GB/T 31737-2015[23]測定，熱儲穩(wěn)定性按GB/T 19136-2003[24]測定，低溫穩(wěn)定性按GB/T 19137-2003[25]測定，雜菌率和貯藏時間采用稀釋涂布平板法測定。

1.5 田間防效及促生作用測定

1.5.1 田間防效測定 試驗地選擇為山西省晉中市東陽試驗基地番茄大棚，種植番茄品種為毛粉812，定植于2022 年4 月25 日。試驗地為水澆地，壤土，略堿，有機質(zhì)含量中等。2022 年5 月8 日開始試驗，試驗共設(shè)7 個處理：5.75×109cfu/mL ZJ1 油懸劑100 倍（制劑用量420 mL/667 m2）、200 倍（制劑用量210 mL/667 m2）、400 倍（制劑用量105 mL/667 m2）、500 倍（制劑用量84 mL/667 m2）稀釋液、50%腐霉利600 倍稀釋液做陽性對照（制劑用量70 mL/667 m2）、1000 億孢子/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑300 倍（制劑用量60 g/667 m2）稀釋液為做陰性對照，清水為空白對照，每處理4 個小區(qū)，每個小區(qū)10 m2，30 株番茄苗（5 葉期），小區(qū)采用隨機區(qū)組排列。參照荊卓瓊等[26]方法分別制備1×106cfu/mL 的番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的孢子懸浮液。在大棚中選取健康且長勢一致的番茄苗，進(jìn)行如下處理：保護(hù)效果：先分別噴施不同處理藥液于番茄葉片至葉片完全浸潤，保濕培養(yǎng)24 h 后分別噴1×106cfu/mL 的番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的孢子懸浮液；治療效果：先分別噴1×106cfu/mL 的番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌的孢子懸浮液，保濕培養(yǎng)24 h 后分別噴施不同處理液于番茄葉片至葉片完全浸潤，保濕培養(yǎng)7 d 后再次噴施不同處理液進(jìn)行第二次施藥。采用常規(guī)噴霧進(jìn)行，要求噴霧均勻一致，以不滴水為宜，不重噴、漏噴。施藥用新加坡利農(nóng)公司生產(chǎn)的HD-400 利農(nóng)16 升背負(fù)式噴霧器。試驗期間按田間正常管理原則進(jìn)行管理。分別在二次施藥后第7 和14 d 后調(diào)查所有葉片病級，依據(jù)《農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則（一）》中“殺菌劑防治番茄早疫病和晚疫病”（GB/T 17980.31-2000）和“殺菌劑防治蔬菜灰霉病”（GB/T 17980.28-2000）中有關(guān)內(nèi)容[27,28]，每小區(qū)采用5 點取樣，每點調(diào)查2 株，每株調(diào)查全部葉片，以每1 葉片上的病斑面積占整個葉片面積的百分率分級，計算病情指數(shù)和防效。病情指數(shù)＝Σ（病級數(shù)×該病級植株數(shù)）/（最大病級數(shù)×植株總株數(shù)）×100，防治效果（%）＝（對照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100。

番茄早疫病的分級標(biāo)準(zhǔn)（以葉片為單位）如下：0 級：無病斑；1 級：病斑面積占整個葉面積的5%以下；3 級：病斑面積占整個葉面積的 6%～10%；5 級：病斑面積占整個葉面積的11%～20%；7 級：病斑面積占整個葉面積的21%～50%；9 級：病斑面積占整個葉面積的50%以上。

番茄灰霉病的分級標(biāo)準(zhǔn)（以葉片為單位）如下：0 級：單葉片無病斑；1 級：單葉片有病斑1～3 個；3 級：單葉片有病斑4～6 個；5 級：單葉片有病斑7～10 個；7 級：單葉片有病斑11～20 個，部分密集成片；9 級：單葉片病斑面積占葉片總面積的1/4 以上。

1.5.2 促生作用測定 試驗設(shè)計7 個處理：同1.5.1。選取飽滿程度及大小相近的番茄種子，每皿放10 粒番茄種子分別用不同處理液浸濕濾紙片，每處理3 個重復(fù)，放入26 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，每d 統(tǒng)計萌芽率。參照王朔楠等[29]的方法計算出發(fā)芽指數(shù)。發(fā)芽指數(shù)（GI）＝∑不同時間的發(fā)芽數(shù)/發(fā)芽日數(shù)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，以P＜0.05 作為具有顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZJ1 對番茄早疫病和灰霉病的抑制作用

菌株ZJ1 對番茄早疫病的平板對峙抑制率為59.15%，對番灰霉病茄的抑制率為71.62%（表1）。對番茄早疫病和番茄灰霉病均有較好的抑制作用（圖1）。

表1 菌株 ZJ1 對番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌抑菌效果Table 1 The inhibitory effect of strain bacteria ZJ1 against A.solani and B.cinerea

圖1 菌株ZJ1 對番茄早疫病菌和番茄灰霉病菌抑制作用Fig.1 The inhibitory effect of strain ZJ1 against A.solani and B.cinerea

2.2 菌株ZJ1 油懸劑的制備

2.2.1 溶劑篩選 通過相容性測定，菌株ZJ1 芽胞含量在花生油中21 d 后顯著高于（P＜0.05）其他3 種溶劑。經(jīng)4 個月定期檢測，菌株ZJ1 在花生油中芽胞含量仍有0.68×109cfu/mL，比其他3 種溶劑更穩(wěn)定，故選取花生油作為菌株ZJ1 油懸劑的溶劑（圖2）。

圖2 不同溶劑油對菌株ZJ1 芽胞含量的影響Fig.2 Effect of different solvent oils on spores content of strain ZJ1

2.2.2 乳化劑篩選 菌株ZJ1 在吐溫80 中的芽胞含量顯著高（P＜0.05）于在其他兩種乳化劑中的芽胞含量，且經(jīng)4 個月儲存后在吐溫80 中保持穩(wěn)定（圖3A）；經(jīng)乳化劑添加比例篩選，發(fā)現(xiàn)菌株ZJ1 在7%吐溫80 中芽胞含量為2.73×109cfu/mL，相容性及穩(wěn)定性較好（圖3B），故選取7%吐溫80 作為菌株ZJ1油懸劑的乳化劑。

圖3 乳化劑的篩選Fig.3 Results of the screening test for emulsifiers

2.2.3 抗生素篩選 當(dāng)抗生素濃度為5～25 μg/mL 時，添加兩性霉素對雜菌的抑制率最高，當(dāng)抗生素濃度為50 μg/mL 時，添加兩性霉素的抑菌率雖略低于加制霉菌素的抑菌率，但二者之間無顯著差異（P＞0.05）（圖4）。故選取50 μg/mL 的兩性霉素作為菌株ZJ1 油懸劑的抗生素。

圖4 不同濃度抗生素對ZJ1 抑菌效果的影響Fig.4 The effect of different antibiotics on the antibacterial effect of ZJ1 strain

2.2.4 防凍劑篩選 對防凍劑添加量進(jìn)行篩選結(jié)果表明，菌株ZJ1 與CaCl2生物相容性顯著高于與其他防凍劑的相容性（圖5A）。2% CaCl2在0 ℃時，芽胞存活率顯著高于其他4 種濃度的芽胞存活率，故選取2% CaCl2作為菌株ZJ1 油懸劑的防凍劑（圖5B）。

圖5 防凍劑的篩選Fig.5 Results of the screening test for antifreeze

2.2.5 潤濕分散劑篩選 菌株ZJ1 和十二烷基硫酸鈉、CaCO3和木質(zhì)素磺酸鈣的生物相容性最好且芽胞存活率顯著高于（P＜0.05）其他潤濕分散劑（圖6A）；對添加比例進(jìn)行篩選得出，1%十二烷基硫酸鈉、1% CaCO3和0.5%木質(zhì)素磺酸鈣對菌株ZJ1 的芽胞含量影響最小，均顯著高于（P＜0.05）其他比例（圖6B）。故選取1%十二烷基硫酸鈉、1% CaCO3和0.5%木質(zhì)素磺酸鈣分別作為菌株ZJ1 油懸劑的潤濕劑、穩(wěn)定劑和分散劑。

2.2.6 保護(hù)劑篩選 加糊精的ZJ1 油懸劑在紫外環(huán)境下抑菌活性顯著高于加抗壞血酸的油懸劑（P＜0.05）；紫外照射0、6、12 h 時，加糊精的抑菌活性均顯著高于空白對照（P＜0.05）；照射24 h 時，加糊精的抑菌活性與空白對照無顯著差異（P＞0.05）；加糊精在紫外照射6、12、24 h 時，抑菌活性與陰性對照均無顯著差異（P＞0.05）（圖7A）。與沒有紫外處理的陰性對照相比，加糊精的油懸劑活芽胞數(shù)在紫外處理24 h 中保持平穩(wěn)，且均顯著高于加抗壞血酸的活芽胞數(shù)（P＜0.05）；在紫外處理6 h 后也顯著高于對照（P＜0.05）（圖7B）。故選取糊精作為菌株ZJ1 油懸劑的保護(hù)劑。

圖7 保護(hù)劑的的篩選Fig.7 Results of the screening test for protective agent

2.3 菌株ZJ1 油懸劑加工工藝

通過冷凍干燥法及生物相容性測定確定了ZJ1 油懸劑的最佳配方為：10%菌粉（6.0×1010cfu/g）、7%吐溫80、50 μg/mL 兩性霉素、2% CaCl2、1% SDS、1% CaCO3、0.5%木質(zhì)素磺酸鈣、5%糊精，余量用花生油補足，最終，制成貝萊斯芽胞桿菌ZJ1 油懸劑的芽胞含量為5.75×109cfu/mL。

2.4 菌株ZJ1 油懸劑質(zhì)量檢測結(jié)果

菌株ZJ1 油懸劑的顏色呈乳黃色，且顏色均勻，無結(jié)塊現(xiàn)象。菌株ZJ1 油懸劑（54±2）℃貯存14 d，外觀無明顯變化，芽胞存活率降為83.25%，（0±2）℃貯存7 d，芽胞存活率降為96.12%。菌株ZJ1 油懸劑經(jīng)室溫保存，芽胞存活率呈緩慢下降趨勢，儲存60 d 后，活芽胞數(shù)保持在3.86×108cfu/mL。表明ZJ1油懸劑在常溫或低溫下穩(wěn)定性較好，但不宜長時間在高溫環(huán)境下存放，各項指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)（表2）。

表2 菌株ZJ1 油懸劑質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Quality of ZJ1 Oil Suspension Concentrate

2.5 ZJ1 油懸劑的田間防效及促生作用

2.5.1 田間防效 末次施藥7 d 后菌株ZJ1 油懸劑100 倍稀釋液對番早疫病茄的防治效果最好，保護(hù)效果和治療效果均高達(dá)95%以上；其次為400 倍稀釋液和50%腐霉利600 倍稀釋液，這2 個處理的保護(hù)效果均高達(dá)89%以上，且大于1000 億孢子/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑300 倍稀釋液防治效果；但末次施藥14 d后，200 倍稀釋液的保護(hù)效果和治療效果分別為92.83%和90.22%，保護(hù)效果與400 倍稀釋液、1000 億孢子/g 枯草芽胞桿菌可濕性粉劑300 倍稀釋液相當(dāng)，且顯著高于50% 腐霉利600 倍稀釋液（P＜0.05）；但治療效果與50%腐霉利600 倍稀釋液無顯著差異（P＞0.05）（表3）。2 次施藥7 d 后，200 倍稀釋液對番茄灰霉病的保護(hù)效果和治療效果均為93%以上，顯著高于2 種對照藥劑的保護(hù)效果（P＜0.05）；末次施藥14 d 后，200 倍稀釋液的保護(hù)效果和治療效果分別為93.95%和86.97%，保護(hù)效果顯著高于其他處理，治療效果高于50%腐霉利600 倍稀釋液（P＜0.05）（表4）。

表3 ZJ1 油懸浮劑對番茄早疫病防治效果Table 3 Effect of ZJ1 oil suspension on A.solani

表4 ZJ1 油懸浮劑對番茄灰霉病防治效果Table 4 Effect of ZJ1 Oil Suspension on B.cinerea

2.5.2 菌株ZJ1 油懸劑促生作用 菌株ZJ1 油懸劑500 倍稀釋液的發(fā)芽指數(shù)為8.69，略高于1000 億孢子/克枯草芽胞桿菌可濕性粉劑300 倍稀釋液，2 者均低于清水對照，但無顯著差異（P＞0.05）；100 倍稀釋液的發(fā)芽指數(shù)最低僅為5.35，隨著菌株ZJ1 油懸劑稀釋倍數(shù)的增加，發(fā)芽指數(shù)逐步提高，說明高濃度的菌株ZJ1 油懸劑會抑制番茄種子萌發(fā)（圖8A）。第7 d 時菌株ZJ1 油懸劑400 倍稀釋液對株高有明顯促生作用，僅次于50%腐霉利600 倍稀釋液但無顯著差異（P＞0.05）；第14、21 d 時，50%腐霉利600 倍稀釋液顯著高于其他處理（P＜0.05），總體上ZJ1 油懸劑較高濃度會降低株高增長率。菌株ZJ1 油懸劑200倍稀釋液處理莖粗增長率均顯著高于（P＜0.05）其他處理，7、14、21 d 的莖粗增長率分別為117.73%、125.36%、145.05%，菌株ZJ1 油懸劑100 倍稀釋液莖粗增長率低于其他處理（圖8B）。

圖8 菌株ZJ1 油懸劑促生作用Fig.8 Growth promoting effect of ZJ1 oil suspension

3 討論

目前，國內(nèi)登記的芽孢桿菌制劑多為可濕性粉劑、懸浮劑、水劑等劑型[9]，可濕性粉劑雖然有效成分含量高但易結(jié)塊有殘留，為使菌株ZJ1 保持更穩(wěn)定的抑菌活性并應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，本研究選取藥效更顯著且持久、性價比更高的油懸浮劑，制成貝萊斯芽胞桿菌ZJ1 油懸劑的芽胞含量為5.75×109cfu/mL。各項指標(biāo)檢測均符合國家標(biāo)準(zhǔn)。Trivedi 等[30]和Melin 等[31]報道了生防活菌懸浮劑在干燥的固態(tài)制劑中存活時間久，水分會打破菌的休眠且會引起雜菌污染或生防菌的二次生長，所以，本研究使用冷凍干燥粉碎后的菌體進(jìn)行油懸劑的制劑化，降低懸浮劑中的水分含量，且芽胞桿菌在油中較穩(wěn)定，延長制劑的保質(zhì)期，后續(xù)可通過篩選其他助劑并進(jìn)行正交試驗對其制劑配方進(jìn)一步優(yōu)化，可采用更精細(xì)化的工藝技術(shù)和工業(yè)化的設(shè)備優(yōu)化制劑性能提高芽胞存活力，為生產(chǎn)實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

本研究對菌株ZJ1 油懸劑的使用方法及推薦劑量做了初步探索，綜合其保護(hù)效果和治療效果證明5.75×109cfu/mL 貝萊斯芽胞桿菌ZJ1 油懸劑200 倍稀釋液對番茄早疫病和灰霉病的防治效果最好，且有明顯促生作用，可使莖粗增長率明顯升高，但會使株高增長率降低，可能是由于低稀釋倍數(shù)處理有壯苗作用，減慢株高生長使番茄植株更為粗壯從而提高植株抗病能力，這一現(xiàn)象還有待驗證。此外，研究發(fā)現(xiàn)隨著ZJ1油懸劑稀釋倍數(shù)的增加，發(fā)芽指數(shù)逐步提高，說明高濃度ZJ1 油懸劑會抑制番茄種子萌發(fā)，表明ZJ1 油懸劑不適合作種子處理，但適合葉面噴霧防治番茄早疫病和灰霉病。據(jù)報道，芽胞桿菌制劑具有良好的田間防病促生效果。鹿秀云等[32]以2.5×109cfu/mL 萎縮芽胞桿菌BacillusatrophaeusHMB22922 懸浮劑在接種Phytophthoraboehmeriae引起的棉鈴疫病5 d 后田間防治效果為86.33%，防效優(yōu)于化學(xué)藥劑。生防菌劑除具有殺菌作用外，還可通過改變土壤性質(zhì)及促進(jìn)植株生長來提高植株抗病性，表明生防菌劑經(jīng)有效開發(fā)利用后，可運用于田間生產(chǎn)，對化學(xué)藥劑減量化具有重要意義。本研究研制的芽胞桿菌制劑部分濃度預(yù)防效果超過90%，可能與試驗過程中對照組病害發(fā)病充分有關(guān)，且配方中使用的助劑對生防菌影響較小[8]，有效的保持了該菌劑的穩(wěn)定性，提高了防效，使其施藥過程中能均勻分散在植物表面，充分發(fā)揮作用。本試驗對ZJ1 油懸劑防效及促生作用測定目前只進(jìn)行了一年一地，今后將進(jìn)一步在不同年份，不同試驗地繼續(xù)進(jìn)行田間防效試驗。