人參皂苷Rg1 對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用

石洪洋，董 慧，劉 嘉，崔笑天，郭 毅，洪 蘭*

1. 延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 食品與生物科學(xué)系，吉林 延吉 133002

2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林 延吉 133002

3. 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長春 130000

人參為五加科植物人參PanaxginsengC. A.Mey.的干燥根和根莖，具有提高免疫力[1]、改善心血管功能[2]、緩解疲勞和抗氧化[3]等多種功效。人參皂苷Rg1是人參主要活性成分之一，具有顯著的抗氧化、抗腫瘤等作用[4-6]。氧化應(yīng)激是急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）發(fā)生心室重構(gòu)的關(guān)鍵因素，最終導(dǎo)致線粒體功能損傷和細(xì)胞凋亡[7]。但人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激是否起保護(hù)作用尚不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）是由20～25個核苷酸組成的非編碼RNA，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)等功能。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷通過調(diào)節(jié)miRNA 的表達(dá)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用，miR-499 是一類與抑制氧化應(yīng)激損傷有關(guān)的RNA[8]，已被證明在心血管疾病的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮作用[9]，包括心肌肥大[10]、缺血性心臟病[11]等。miR-499 已被確定為AMI 和心力衰竭的潛在生物標(biāo)志物[12-13]。miR-499c 是和miR-499 同源的一種特殊RNA，由德克薩斯A&M 大學(xué)發(fā)現(xiàn)，可以將多種干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞[14]，但miR-499c 是否具有對心肌細(xì)胞的保護(hù)作用尚不清楚，并且其是否參與人參皂苷Rg1的抗氧化機(jī)制更不甚清楚。故本研究旨在探究人參皂苷Rg1對心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用，并通過體外構(gòu)建H9c2 細(xì)胞的miR-499c 轉(zhuǎn)染模型，探討人參皂苷Rg1通過miR-499c 參與氧化應(yīng)激的抑制作用，以評估其在心腦血管疾病治療中的潛在價值。

1 材料

1.1 細(xì)胞

H9c2 細(xì)胞（批號CL-0089）購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

人參皂苷Rg1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號SG8330）購自北京索萊寶科技有限公司；30% H2O2（批號C04045101）購自南京化學(xué)試劑股份有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測試劑盒（批號C0016）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號S0131S）、總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測試劑盒（批號S0101S）、線粒體膜電位檢測試劑盒（批號C2006）均購自上海碧云天生物科技有限公司；CCK-8 試劑（批號C0037）購自美國Invigentech 公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體（批號EPR17509）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號E63）、剪切型半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cleaved cysteinasparate protease-3，cleaved Caspase-3）抗體（批號EPR21032）均購自英國 Abcam 公司；cleaved Caspase-9 抗體（批號9507S）、β-actin 抗體（批號12620）、山羊抗兔IgG 二抗（批號7074）均購自美國CST 公司；Lipofiter 3.0 轉(zhuǎn)染試劑（批號HB-LF3-1000）、miR-499c 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（目的基因序列3’-ACAGACTTGCTGTGANGTTCACGTGGAGAGGAGTTAAACATCACTGCAAGTCTTAACAGCCGCCCGCCCAAGGCACAGGGGACAGGGCCCCTATAGTGAGTCNTATTAAAA-5’）購自上海漢恒生物科技有限公司；DMEM 液體培養(yǎng)基（批號C3103-0500）、特級胎牛血清（批號C04001-050）、胰蛋白酶-EDTA（批號C3530-0100）、青鏈雙抗（批號C3420-0100）均購自上海逍鵬生物科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）試劑盒（批號C3890）購自美國APE×BIO 公司；心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP，批號D04B）購自北京北方生物技術(shù)研究所有限公司。

1.3 儀器

Forma?型直熱式CO2培養(yǎng)箱、Heraguard?ECO型超凈工作臺、MicroCL 17 型微量離心機(jī)、EVOS M700 型熒光倒置顯微鏡、Varioskan LUX 型多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇H9c2 細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時傳代。用胰蛋白酶消化細(xì)胞，1∶3 進(jìn)行傳代接種。繼續(xù)培養(yǎng)，調(diào)整傳代后的細(xì)胞密度為5×104個/mL，用于后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8 法測定細(xì)胞存活率

2.2.1 氧化應(yīng)激模型條件 將H9c2 細(xì)胞鋪于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h 后，分別給予0、75、150、300、600、1200 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞20 min[15]。每孔加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測定吸光度（A）值，計算細(xì)胞存活率。

2.2.2 人參皂苷Rg1對H9c2 細(xì)胞存活率的影響 將H9c2 細(xì)胞鋪于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，分別加入0、10、20、40、80 μmol/L 的人參皂苷Rg1處理細(xì)胞24 h。每孔加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測定A值，計算細(xì)胞存活率。

2.2.3 人參皂苷Rg1對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞存活率的影響 將H9c2 細(xì)胞鋪于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。設(shè)置對照組、模型組、人參皂苷Rg1（10、20、40、80 μmol/L）組和ANP（1 nmol/L）組，人參皂苷Rg1組加入不同濃度的藥物處理24 h，ANP組加入藥物處理20 min；模型組和各給藥再加入600 μmol/L 的H2O2處理20 min 制備氧化應(yīng)激模型，對照組加入不含藥物不含H2O2的培養(yǎng)基。每孔加入10 μL CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，測定A值，計算細(xì)胞存活率。

2.3 人參皂苷Rg1 對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞LDH 漏出率的影響

將H9c2 細(xì)胞鋪于6 孔板內(nèi)，每孔1500 μL，設(shè)置對照組、模型組和人參皂苷Rg1（10、20、40、80 μmol/L）組，按“2.2.3”項下方法給藥后，取培養(yǎng)液上清，2500 r/min 離心5 min，取上清液25 μL，按照試劑盒說明書檢測LDH 活性。

2.4 人參皂苷Rg1 對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞SOD 活性和MDA 水平的影響

將H9c2 細(xì)胞鋪于6 孔板內(nèi)，每孔1500 μL，按“2.3”項下方法分組和給藥后，按照試劑盒說明書檢測SOD 活性和MDA 水平。

2.5 人參皂苷Rg1 對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞ROS 水平的影響

將H9c2 細(xì)胞鋪于6 孔板內(nèi)，每孔1500 μL，按“2.2.3”項下方法分組和給藥后，用稀釋后的DCFHDA 重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×106個/mL。孵育20～30 min，每隔3～5 min 顛倒混勻1 次，使探針和細(xì)胞充分接觸。選擇488 nm 激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波長，用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)弱。

2.6 人參皂苷Rg1 對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞線粒體膜電位的影響

將H9c2 細(xì)胞鋪于6 孔板內(nèi)，每孔1500 μL，按“2.2.3”項下方法分組和給藥后，各孔加入培養(yǎng)液和JC-1 染色工作液各1 mL，充分混勻，避光孵育20 min，加入JC-1 染色緩沖液洗滌2 次后，通過熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

2.7 人參皂苷Rg1 對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將H9c2 細(xì)胞鋪于6 孔板內(nèi)，每孔1500 μL，按“2.3”項下方法分組和給藥后，收集細(xì)胞，BCA 法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶中封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗孵育1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光，將PVDF 膜放入曝光盒中，在UVP 凝膠成像系統(tǒng)上觀察條帶并拍照。

2.8 PCR 檢測miR-499c 表達(dá)

將H9c2 細(xì)胞鋪于6 孔板內(nèi)，每孔1500 μL，設(shè)置對照組和人參皂苷Rg1（40 μmol/L）組，給予藥物干預(yù)24 h 后，使用無酶的EP 管收集細(xì)胞，于通風(fēng)櫥內(nèi)加入1 mL Trizol，顛倒混勻。加入氯仿，混勻，室溫靜置。4 ℃、12 000 r/min 離心15 min。取出EP 管置于冰上，用無酶槍頭將上清液小心吸取至新的EPA 管中。加入同體積異丙醇，混勻，室溫靜置。4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，棄上清。加入75%乙醇，顛倒使RNA 浮起。4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清，無菌風(fēng)吹干。加入10～20 μL DEPC 水，靜置5 min，吹打混勻，測量RNA 濃度。

2.9 miR-499c 轉(zhuǎn)染

將4 μL miR-499c 質(zhì)粒稀釋到250 μL DMEM 培養(yǎng)基中，輕輕吹打混勻。取另一離心管，加入250 μL 無血清 DMEM 培養(yǎng)基，再加入 10 μL Lipofiter3.0，輕輕吹打混勻，室溫放置5 min。將以上2 只離心管溶液混合，吹打混勻，室溫孵育20 min。將500 μL 混合溶液均勻加入到6 孔板中，“8”字搖晃均勻。培養(yǎng)6 h 后，更換含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)置模型組、人參皂苷Rg1＋H2O2組、miR-499c＋H2O2組、人參皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2組，模型組加入600 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞20 min 制備氧化應(yīng)激模型；人參皂苷Rg1＋H2O2組加入40 μmol/L 人參皂苷Rg1處理24 h，再制備氧化應(yīng)激模型；miR-499c＋H2O2組將miR-499c 轉(zhuǎn)染到H9c2 細(xì)胞72 h，再制備氧化應(yīng)激模型；人參皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2組將miR-499c 轉(zhuǎn)染到H9c2 細(xì)胞72 h，再加入40 μmol/L 人參皂苷Rg1處理24 h，最后制備氧化應(yīng)激模型。按“2.5”“2.6”項下方法檢測細(xì)胞ROS、線粒體膜電位水平。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以±s表示。

3 結(jié)果

3.1 H9c2 氧化應(yīng)激模型制備

如圖1 所示，75～1200 μmol/L 的H2O2處理H9c2 細(xì)胞20 min，細(xì)胞存活率降低，并呈劑量相關(guān)性。600 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞20 min 后，細(xì)胞存活率顯著降低至（60.39±2.87）%（P＜0.001）。因此，選用600 μmol/L 的H2O2作為制備氧化應(yīng)激模型條件。

3.2 人參皂苷Rg1 對H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用

3.2.1 人參皂苷Rg1對氧化應(yīng)激模型細(xì)胞存活率的影響 如圖2-A 所示，不同濃度的人參皂苷Rg1處理H9c2 細(xì)胞24 h 后，細(xì)胞存活率無明顯影響，表明人參皂苷Rg1對H9c2 細(xì)胞無毒性作用。如圖2-B 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.001）；與模型組比較，人參皂苷Rg1（40、80 μmol/L）組細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。本團(tuán)隊前期研究工作中發(fā)現(xiàn)ANP 可以抑制H9c2 細(xì)胞氧應(yīng)激化損傷且具有心肌保護(hù)作用，因此利用ANP 作為陽性對照發(fā)現(xiàn)，ANP 對氧化應(yīng)激模型H9c2 細(xì)胞存活率作用與40 μmol/L 人參皂苷Rg1的作用相近[16]。

圖2 人參皂苷Rg1 對H9c2 細(xì)胞 (A)、H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞 (B) 存活率的影響 (±s, n = 3)Fig. 2 Effect of ginsenoside Rg1 on cell viability of H9c2 cells (A) and H2O2-induced H9c2 cells (B) (±s, n = 3)

3.2.2 人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞LDH漏出率的影響 如圖3 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞LDH 漏出率顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組LDH 漏出率均明顯降低（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖3 人參皂苷Rg1對H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞LDH 漏出率的影響 (±s, n = 3)Fig. 3 Effect of ginsenoside Rg1 on leakage rate of LDH in H2O2-induced H9c2 cells (±s, n = 3)

3.2.3 人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞MDA水平和SOD 活性的影響 如圖4 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞MDA 水平顯著升高（P＜0.001），SOD 活性顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組MDA 水平顯著降低（P＜0.01、0.001），人參皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）組SOD 活性顯著升高（P＜0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖4 人參皂苷Rg1 對H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞MDA 水平和SOD 活性的影響 (, n = 3)Fig. 4 Effect of ginsenoside Rg1 on MDA level and SOD activity in H2O2-induced H9c2 cells (±s, n = 3)

3.2.4 人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞ROS水平的影響 如圖5 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞ROS 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，人參皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）組和ANP組ROS 水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關(guān)性。

圖5 人參皂苷Rg1 對H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞ROS 水平的影響 (±s, n = 3)Fig. 5 Effect of ginsenoside Rg1 on ROS level in H2O2-induced H9c2 cells (±s, n = 3)

3.2.5 人參皂苷Rg1對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 氧化應(yīng)激可以引起細(xì)胞線粒體膜電位的改變，導(dǎo)致線粒體損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡及壞死。如圖6 所示，與對照組比較，模型組細(xì)胞綠/紅色熒光比值升高（P＜0.001），表明H9c2 細(xì)胞線粒體膜電位降低；與模型組比較，各給藥組綠/紅色熒光比值顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），表明人參皂苷Rg1和ANP 均可以使H2O2引起的H9c2細(xì)胞線粒體膜電位恢復(fù)。

圖6 人參皂苷Rg1 對H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞線粒體膜電位的影響 (±s, n = 3)Fig. 6 Effect of ginsenoside Rg1 on mitochondrial membrane potential in H2O2-induced H9c2 cells (±s, n = 3)

3.3 人參皂苷Rg1 對H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖7 所示，與對照組比較，模型組cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9 和Bax 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.001），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，各給藥組cleaved Caspase-9 和Bax 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01、0.001），Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）；人參皂苷Rg1（20、40、80 μmol/L）組cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01、0.001）。提示人參皂苷Rg1可以減少H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡。

圖7 人參皂苷Rg1 對H2O2 誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig. 7 Effect of ginsenoside Rg1 on apoptosis-related protein expressions in H2O2-induced H9c2 cells (±s, n = 3)

3.4 人參皂苷Rg1 對H9c2 細(xì)胞miR-499c 表達(dá)的影響

為探討人參皂苷Rg1對H9c2 細(xì)胞抗氧化的作用機(jī)制，首先觀察人參皂苷Rg1對H9c2 細(xì)胞內(nèi)miR-499c表達(dá)的影響。如圖8 所示，與對照組比較，人參皂苷Rg1組miR-499c表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。

圖8 人參皂苷Rg1 對H9c2 細(xì)胞miR-499c 表達(dá)的影響(±s, n = 3)Fig. 8 Effect of ginsenoside Rg1 on miR-499c expression in H9c2 cells (±s, n = 3)

3.5 miR-499c 在人參皂苷Rg1 抑制H2O2 誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用

3.5.1 miR-499c 在人參皂苷Rg1抑制H2O2誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激時對ROS 生成的影響 如圖9所示，與模型組比較，人參皂苷Rg1＋H2O2組、miR-499c＋H2O2組細(xì)胞中ROS 熒光強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05、0.01），表明miR-499c 和人參皂苷Rg1均可以抑制ROS 的生成。人參皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2組ROS 熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，提示miR-499c 可能參與人參皂苷Rg1抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

3.5.2 miR-499c在人參皂苷Rg1抑制H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞MMP 降低的影響 如圖10 所示，與模型組比較，人參皂苷Rg1＋H2O2組、miR-499c＋H2O2組綠/紅色熒光比值顯著降低（P＜0.05、0.01），表明人參皂苷Rg1和miR-499c 均可以使H2O2引起的H9c2 細(xì)胞線粒體膜電位恢復(fù)；人參皂苷Rg1＋miR-499c＋H2O2組綠/紅色熒光比值進(jìn)一步降低，提示miR-499c可能參與人參皂苷Rg1抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

4 討論

在心血管疾病中，氧化應(yīng)激是AMI 的重要促發(fā)因素之一。一些抗氧化劑藥物已被證實可以預(yù)防和治療AMI[17]，但尚未達(dá)到滿意的效果。人參皂苷Rg1是人參中的重要生物活性成分，在體內(nèi)外具有抗衰老、神經(jīng)保護(hù)[18]等多種生物活性。本研究重點探討了人參皂苷Rg1對H9c2 細(xì)胞的抗氧化作用及其機(jī)制。采用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激模型是最常見的氧化應(yīng)激模型制備方法，本研究發(fā)現(xiàn)，600 μmol/L 的H2O2誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞20 min，能達(dá)到最佳氧化應(yīng)激模型，與先前的研究結(jié)果一致[19]。

正常狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化處于一種動態(tài)平衡，但在患病或衰老等狀態(tài)時會出現(xiàn)因自由基水平升高而導(dǎo)致的病理現(xiàn)象[20]。人體內(nèi)有抗氧化防御系統(tǒng)，包括內(nèi)源性抗氧化劑SOD?？係OD 活性可以反映機(jī)體對氧化應(yīng)激的抗氧化能力，研究表明，氧化應(yīng)激會引起SOD 的活性增加，但當(dāng)氧化應(yīng)激過度時，SOD 活性會下降[21]。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激時，引起細(xì)胞膜損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)，MDA 迅速積累[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1增加了H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞中SOD 活性，同時減少MDA 水平。表明人參皂苷Rg1作為外源性抗氧化劑，通過增加內(nèi)源性抗氧化劑的活性起到抗氧化作用。

ROS 是機(jī)體內(nèi)最常見的自由基[23]，ROS 產(chǎn)生過量時能引起線粒體功能障礙，表現(xiàn)為線粒體的形態(tài)變化和功能喪失。線粒體膜電位的破壞是線粒體功能障礙的主要標(biāo)志。線粒體膜電位的丟失導(dǎo)致線粒體電子傳遞鏈缺陷、代謝耗氧量減少，從而抑制細(xì)胞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等的正常功能[24]。結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)H9c2 細(xì)胞ROS 的生成和線粒體膜電位丟失，而人參皂苷Rg1降低了ROS 生成，同時抑制線粒體膜電位丟失，表明人參皂苷Rg1通過抑制自由基的生成和線粒體膜電位的丟失，從而起到抑制氧化應(yīng)激損傷的作用。

Bcl-2 和Bax 是Bcl-2 家族蛋白的典型代表，它們在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[25]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax 高表達(dá)時，細(xì)胞對死亡信號敏感，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2 高表達(dá)時，Bcl-2 與Bax 形成異源二聚體，抑制細(xì)胞凋亡[26]。所以細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2 的比例對決定細(xì)胞凋亡的敏感性起到重要作用。在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體被認(rèn)為是處于凋亡調(diào)控的中心位置。在線粒體通路中，如Bax 被激活后發(fā)生寡聚化，并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，釋放線粒體內(nèi)促凋亡因子，如細(xì)胞色素 C（cytochrome C，Cyt C）等。當(dāng)Cyt C 釋放到胞內(nèi)后，形成凋亡復(fù)合體，凋亡復(fù)合體通過招募并激活Pro-Caspase-9，形成Caspase-9 全酶。Caspase-9 全酶進(jìn)一步激活效應(yīng)Caspase-3 和Caspase-7，啟動Caspase級聯(lián)反應(yīng)，切割細(xì)胞中α-tubulin、Actin 等超過100種的底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27]。Caspase 家族是細(xì)胞凋亡的重要執(zhí)行者，其主要功能是促進(jìn)凋亡信號的放大和傳遞[28]。在本研究中，人參皂苷Rg1下調(diào)Bax 和上調(diào)Bcl-2 表達(dá)，呈劑量相關(guān)性地降低Bax/Bcl-2 的比例，同時人參皂苷Rg1減少cleaved Caspase-3 和cleaved Caspase-9 蛋白表達(dá)。提示人參皂苷Rg1可能通過抑制Caspases，進(jìn)而調(diào)控Bax 與Bcl-2 蛋白家族，從而抑制細(xì)胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 可以調(diào)節(jié)多種基本細(xì)胞功能包括細(xì)胞凋亡和壞死，這是AMI 中的2 個關(guān)鍵細(xì)胞事件[29-30]。其中miRNA-499 可以保護(hù)心肌細(xì)胞免受AMI 誘導(dǎo)的凋亡作用[31]。其他研究也證實，miR-499通過靶向程序性細(xì)胞死亡因子4（programmed cell death 4，PDCD4）、鈣凋磷酸酶和動力蛋白來保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[32]。血漿miR-499 被證明通過靶向PDCD4 促進(jìn)內(nèi)皮炎癥，PDCD14 抑制下游核因子-κB（nuclear factor-κB，NFκB）/腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNFα）信號通路[33]。提示miR-499 可能作為治療AMI血管炎癥的潛在靶標(biāo)[34]。miRNA-499c 是在前期工作中發(fā)現(xiàn)的一種具有將非心肌細(xì)胞誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞功能的miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理人參皂苷Rg1可以增加H9c2 細(xì)胞miR-499c 的表達(dá)。同時轉(zhuǎn)染miRNA-499c 后再預(yù)處理人參皂苷Rg1后發(fā)現(xiàn)，與單純轉(zhuǎn)染miR-499c 或單純預(yù)處理人參皂苷Rg1相比，ROS 顯著降低和線粒體膜電位恢復(fù)明顯。提示人參皂苷Rg1可能通過miRNA-499c 對H2O2誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞氧化應(yīng)激起抑制作用。

綜上，人參皂苷Rg1通過抑制H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞ROS 的生成，從而減少線粒體膜電位的丟失和線粒體氧化應(yīng)激，最終抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，此作用可能與miRNA-499c 有關(guān)。本研究為人參有效成分開發(fā)新的心腦血管疾病藥物提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突