不同干燥方式對人參果漿中稀有皂苷生成的影響

莫秀麗，任紅紅，高晴晴，閆永濤，程天宇，李曉敏*，趙余慶*

1. 延邊大學(xué) 長白山天然藥物研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002

2. 完美（廣東）日用品有限公司，廣東 中山 528402

3. 沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016

人參PanaxginsengC. A. Mey.的成熟果實(shí)的形狀小而圓，屬于漿果類型，果實(shí)的內(nèi)部含有2 粒圓形的種子，其成熟前的生長過程中呈深度不一的綠色，七、八月時種子成熟時果實(shí)呈鮮紅色，成熟后脫去漿果干燥后的皮殼，就是人參種子。具有“益氣、強(qiáng)身、延緩衰老”的作用，是我國特有的種質(zhì)資源之一。人參果實(shí)在我國的主要產(chǎn)地為吉林省，每年人參果實(shí)產(chǎn)量可達(dá)到800 余噸，其原料價格較人參性價比高。

近年來，多種化學(xué)成分從人參果肉中被分離出來，包括人參皂苷類[1-4]、多糖類[5]、氨基酸類[6-7]、無機(jī)元素[8-9]等，與人參根具有相似性[10-12]，使人參果也具有多種藥理作用，包括提高免疫力[13-14]、保護(hù)心肌[15]、治療糖尿病[16-17]、抑制癌細(xì)胞增殖[18-19]、減輕腦損傷[20]、抗疲勞[21]等。

文獻(xiàn)報道人參果中富含人參皂苷，原型人參皂苷含量高[22]，其中總皂苷含量約為人參根的4 倍，人參皂苷Re 為人參果中含量最高的皂苷單體，約為人參根的30 倍；人參果與人參根部共同含有的人參皂苷有人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Rc、人參皂苷Rd、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1等，這些人參皂苷主要為原型人參皂苷。本課題組前期從人參果中分離得到多種稀有人參皂苷，如人參皂苷Rg3、人參皂苷Rg2、三醇組稀有皂苷元原人參三醇（protopanaxatriol，PPT），以及具有顯著抗腫瘤活性的新稀有皂苷元R 型AD-1、25-OCH3-PPT、20-OCH3-AD-2、20,25-2OCH3-PPD 等[23-26]。

干燥處理[27]是鮮人參制成藥材的關(guān)鍵步驟，使其易于保存和藥用。現(xiàn)代研究證明，人參加熱后原生皂苷發(fā)生降解[28-31]，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的稀有人參皂苷[32]。研究表明，人參果漿含有與人參根類似的皂苷類成分和生物活性，然而人參果漿易腐敗，不易保存，導(dǎo)致化學(xué)成分發(fā)生變化，擬通過干燥處理以延長人參果漿的儲存期。目前，未見有人參果漿干燥處理的文獻(xiàn)報道，本研究通過研究不同干燥方式對人參果漿中原型皂苷降解和稀有皂苷生成的影響，優(yōu)選人參果漿的干燥處理方法，為人參果漿收集、存儲和資源的合理利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

BSA124S 型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），UV-2800 型紫外可見分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司），WB-2000 型水浴鍋（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），202-2AB 型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），F(xiàn)D-1B-50型真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司），DTA-27J 型超聲波清洗器（濟(jì)寧科源超聲波設(shè)備有限公司），L-2200 型高效液相色譜儀（株式會社日立制作所）。

人 參 皂 苷 Re （ PRF20092701 ）、 Rg1（ PRF22040803 ）、 F1（ PRF20070943 ）、 Rh1（ PRF21072101 ）、 Rb1（ PRF22030402 ）、 Rc（ PRF10021945 ）、 Rb2（ PRF21091822 ）、 Rb3（ PRF21042043 ）、 Rg3（ PRF21040801 ）、 Rk1（PRF20061501）、Rh2（PRF21032601）質(zhì)量分?jǐn)?shù)均＞98%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，乙腈、甲醇（色譜純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司），其他溶劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。

人參果漿于2022 年8 月購買于中國吉林集安市清河鎮(zhèn)參果加工廠（批號20220816）。

2 方法與結(jié)果

2.1 人參果漿的干燥處理方法

將人參果漿樣品搖晃均勻，稱取適量的人參果漿樣品，分為冷凍干燥人參果漿組（FGF）、電熱干燥人參果漿組（EGF）、汽熱干燥人參果漿組（SGF），每組分別稱取3 份，具體干燥流程如下。

（1）FGF：置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)?70 ℃冷凍干燥24 h。

（2）EGF：置于蒸發(fā)皿中于恒溫電熱干燥箱內(nèi)，加熱溫度為100 ℃，干燥時間為3 h。

（3）SGF：置于蒸發(fā)皿中，置于水浴鍋上，加熱溫度為100 ℃，干燥時間為3 h。測定結(jié)果表明，3 種干燥方式的人參果漿失水率分別為94.2%、94.5%、94.5%。

2.2 不同干燥樣品中人參皂苷成分測定

2.2.1 不同干燥方式供試品溶液的制備 精密稱量人參果漿3 g、FGF 組為0.165 3 g、EGF 組為0.165 0 g、SGF 組為0.174 5 g（由失水率計(jì)算，3 組約為人參果漿3 g），分別用20 倍量75%乙醇超聲提取2次，每次30 min，靜置，濾過，合并2 次濾液，減壓回收溶劑，干燥后樣品用色譜甲醇溶解，定容至10 mL 量瓶，過0.45 μm 有機(jī)系濾頭，待測。

2.2.2 對照品溶液的制備 精確稱取人參皂苷對照品于1 mL 量瓶中，用色譜甲醇溶解，定容至刻度線，搖勻，用0.45 μm 有機(jī)系濾頭濾過，得到含28.220 mg/mL 人參皂苷Re、10.000 mg/mL 人參皂苷Rg1、0.105 mg/mL 人參皂苷F1、0.950 mg/mL 人參皂苷Rh1、0.500 mg/mL 人參皂苷Rb1、0.500 mg/mL 人參皂苷Rc、0.500 mg/mL 人參皂苷Rb2、2.700 mg/mL 人參皂苷Rb3、0.515 mg/mL 人參皂苷Rg3、0.575 mg/mL 人參皂苷Rk1、0.500 mg/mL 人參皂苷Rh2的混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件 高效液相色譜配備UV 檢測器；色譜柱為Agela Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫：0～10 min，22～27% A；10～15 min，27% A～30% A；15～35 min，30～32% A；35～40 min，32%～35% A；40～43 min，35～40% A；43～48 min，40～46.9% A；48～50 min，46.9～47.6% A；50～65 min，47.6～48.5% A；65～68 min，48.5～53% A；68～73 min，53～65% A；73～78 min，65%～85% A；78～83 min，85% A；83～85 min，85～22% A；85～95 min，22% A。

2.2.4 線性關(guān)系考察 將混合對照品溶液，逐級稀釋到6 個不同質(zhì)量濃度，按色譜條件進(jìn)樣分析，以各對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），與之對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制各人參皂苷對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸計(jì)算，得到線性回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)（r），詳見表1。

表1 11 種人參皂苷的線性方程Table 1 Linear equation of 11 kinds of ginsenosides

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定11 種皂苷色譜峰的峰面積。人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rg3、Rh2、Rk1、Re、Rg1、F1、Rh1峰面積的RSD 值分別為1.53%，1.55%，1.42%，0.96%，1.54%，1.68%，1.09%，1.22%，1.79%，1.01%，0.97%。各人參皂苷的RSD 值均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一份電熱干燥的人參果漿樣品供試品溶液，分別在配制好后0、2、4、8、16、24 h 進(jìn)樣測定，計(jì)算供試品溶液中11 種人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rg3、Rh2、Rk1、Re、Rg1、F1、Rh1峰面積的RSD 值，分別為2.21%，2.34%，2.95%，2.46%，2.67%，1.83%，2.35%，2.56%，2.38%，2.49%，2.61%。各人參皂苷的RSD 值均小于3%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6 份電熱干燥人參果漿樣品供試品溶液，按色譜條件，進(jìn)樣檢測分析，計(jì)算供試品溶液中11 種人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rg3、Rh2、Rk1、Re、Rg1、F1、Rh1峰面積的RSD 值，分別為2.21%，2.34%，2.95%，2.46%，2.67%，1.83%，2.35%，2.56%，2.38%，2.49%，2.61%。各人參皂苷的RSD 值均小于3%，表明供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 稱取人參果漿電熱干燥樣品0.165 g，共6 份。分別加入與樣品中11 種人參皂苷含量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤?，按照供試品制備方法制備成加樣供試品溶液。測定11 種人參皂苷的含量，計(jì)算加樣回收率。人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rg3、Rh2、Rk1、Re、Rg1、F1、Rh1的加樣回收率分別為99.13%、98.23%、100.48%、102.18%、101.32%、99.05%、98.69%、97.32%、100.65%、99.78%、101.35%，RSD值分別為1.26%、1.03%、1.12%、1.35%、0.89%、0.91%、1.32%、0.98%、0.86%、1.16%、1.48%。

2.2.9 人參皂苷含量測定 按“2.2.3”項(xiàng)色譜條件測定“2.2.1”項(xiàng)下制備的供試品溶液中11 種皂苷的含量。每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3 次，取平均峰面積根據(jù)線性方程計(jì)算不同干燥處理方式人參果漿樣品中的11 種人參皂苷的含量。

2.3 人參皂苷含量測定結(jié)果

人參皂苷對照品混合溶液、GF、FGF、EGF 及SGF 的HPLC 色譜圖見圖1，11 種人參皂苷的含量見表2。

圖1 人參皂苷混合對照品和GF、FGF、EGF、SGF 樣品HPLC 色譜圖Fig. 1 HPLC Chromatogram of 11 kinds of ginsenosides,GF, FGF, EGF, SGF

表2 混合對照品和GF、FGF、EGF 和SGF 樣品中的11 種人參皂苷含量Table 2 Content of 11 kinds of ginsenosides in GF, FGF, EGF and SGF

如表2 所示，在加熱條件下，原型皂苷可以轉(zhuǎn)化為稀有皂苷，人參果漿經(jīng)過處理后，原型皂苷人參皂苷Re 變化最為明顯，其次是人參皂苷Rg1，除人參皂苷Rh2外，EGF、SGF 的稀有皂苷含量都明顯高于FGF。如圖2 所示，F(xiàn)GF 與GF 中11 種人參皂苷的含量變化較小；EGF 中11 種人參皂苷的總含量最低，降解程度較高。

圖2 GF、FGF、EGF 和SGF 中11 種人參皂苷總含量Fig. 2 Total content of 11 kinds of ginsenosides in GF, FGF,EGF and SGF

如圖3 所示，4 組人參果漿樣品中稀有人參皂苷F1、Rh1、Rg3、Rk1和Rh2的含量由高到低分別為SGF＞EGF＞FGF＞GF；5 種稀有皂苷中人參皂苷Rh1和人參皂苷Rh2的含量較高。

圖3 GF、FGF、EGF 和SGF 中5 種稀有人參皂苷總含量Fig. 3 Total content of five rare ginsenosides in GF, FGF,EGF and SGF

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別采用冷凍干燥、電熱干燥、汽熱干燥等3 種干燥方法對人參果漿進(jìn)行處理，采用高效液相色譜法對新鮮果漿以及處理后的樣品中的11種人參皂苷Re、Rg1、F1、Rh1、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rg3、Rk1、Rh2進(jìn)行定性和定量分析。3 種干燥處理的人參果漿樣品（FGF、EGF 及SGF）與GF 的原型人參皂苷和稀有人參皂苷含量對比分析的結(jié)果顯示，F(xiàn)GF 與GF 中原型人參皂苷總含量接近。EGF及SGF 樣品在高溫加熱條件下，原型人參皂苷發(fā)生降解，稀有皂苷生成量不同程度的增加。人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3和Rc 可在高溫加熱條件下發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生人參皂苷Rd。人參皂苷Rd 的C-20 位葡萄糖基的進(jìn)一步降解產(chǎn)生人參皂苷Rg3，人參皂苷Rg3在C-20 位的脫水產(chǎn)生人參皂苷Rk1，在C-20處為失去一個葡萄糖成為人參皂苷Rh2[34-35]。同理，Re 可以通過脫去葡萄糖和鼠李糖轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh1，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg2，Rg1也可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rh1。另一方面，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg2可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為人參皂苷F1，而最終人參皂苷F1和人參皂苷Rh1可轉(zhuǎn)化為PPT[35]。與未經(jīng)過處理的人參果漿相比，經(jīng)過3 種干燥方式后，11 種人參皂苷含量都有下降趨勢，人參皂苷Re含量的變化量最大，相比較于其它干燥方式，冷凍干燥對其影響最小，電熱干燥處理后11 種人參皂苷含量最低，降解程度較大。經(jīng)過汽熱干燥后，5 種稀有皂苷含量較高，其中人參皂苷Rh1、人參皂苷Rk2占比最高。

冷凍干燥可減少高溫對人參果漿中人參皂苷的降解，但干燥成本較高；汽熱干燥和電熱干燥操作簡便，設(shè)備成本低，得到的人參果漿干燥品中含有生物活性較強(qiáng)的稀有人參皂苷，適用于產(chǎn)地及生產(chǎn)企業(yè)大量加工處理，可為人參果漿的保存及開發(fā)應(yīng)用提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突