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    花旗松素磷脂復合物白蛋白納米粒的構建及其腸吸收研究

    2023-12-25 13:19:38張佳慧孫敬蒙張詩雨張煒煜
    中草藥 2023年24期
    關鍵詞:腸段凍干粉花旗

    張佳慧,孫敬蒙,張 鑫,張詩雨,張 欣,張煒煜*

    1. 長春中醫(yī)藥大學藥學院,吉林 長春 130117

    2. 吉林大學第一醫(yī)院 臨床藥學部,吉林 長春 130061

    花旗松素又名二氫槲皮素、紫杉葉素,是一種二氫黃酮醇類化合物,為國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的2021 年第5 號文件批準的新食品原料;廣泛存在于水飛薊、落葉松、土茯苓和黃杞葉等50 多種植物體內(nèi)[1]?;ㄆ焖伤鼐邆涠喾N生物學活性,如抗氧化[2]、抗病毒[3]、抗炎[4]、抗腫瘤[5]等,具備很好的醫(yī)藥開發(fā)潛能,美國、俄羅斯、日本等國家以花旗松素為原料開發(fā)出多種藥用、食用產(chǎn)品。但該成分水溶性低[6]、脂溶性差[7],腸道通透性差,導致口服吸收受限,從而影響臨床療效,限制其開發(fā)應用。現(xiàn)代研究開發(fā)了多種新型給藥制劑,用于增強花旗松素的溶解度,包括脂質體[8]、納米粒[9]、包合物[10]等。然而,僅提高其溶解度沒有改善其滲透性,仍不能滿足其功效發(fā)揮。因此,構建新型給藥系統(tǒng),協(xié)同改善其溶解性和膜滲透性,提高花旗松素體外溶出及體內(nèi)吸收程度是當前口服給藥途徑研究的關鍵問題。

    磷脂復合物白蛋白納米粒是一種新型二元給藥系統(tǒng),能夠提高藥物的水溶性、脂溶性及體外溶出和體內(nèi)吸收情況,而且磷脂和白蛋白均屬于食品級輔料,因此將花旗松素制備成磷脂復合物白蛋白納米粒,能提高花旗松素的功效。磷脂作為人體細胞膜的重要組成成分,能夠提高藥物與機體內(nèi)胃腸道黏膜的生物相容性與親和力,增加滲透性和滯留效應[11]。特別是天然磷脂,能夠直接從大豆或蛋黃中提取,生物安全性良好[12]。白蛋白屬于高度水溶性蛋白質,空間上具有網(wǎng)狀結構和疏水區(qū)域,且攜帶多種藥物結合位點,便于包載疏水性藥物,具備提高藥物溶解度的獨特優(yōu)勢[13]。通常自牛血清、人血清或重組技術中獲得,其中牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)憑借其豐富性、低成本、易純化等特性被制藥行業(yè)廣泛接受。本研究首次將花旗松素載入磷脂復合物白蛋白納米粒中,并采用Box-Behnken 設計(Box-Behnken design,BBD)-響應面法(response surface method,RSM)優(yōu)化花旗松素磷脂復合物白蛋白納米粒(taxifolin phospholipid complex albumin nanoparticles,Tax-PC/BSA NPs)的制備工藝,并對其進行質量評價;同時,通過大鼠在體單向腸灌流模型來評價Tax-PC/BSA NPs 的腸道吸收特性,為花旗松素制劑的進一步研發(fā)和應用提供參考。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    Agilent 1200 型高效液相色譜儀,安捷倫科技有限公司;TGL-18C 型高速臺式離心機,上海安亭科學儀器廠;Scientz-II D 型超聲波細胞粉碎機,寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA 型旋轉蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;Epsilon 2-4 LSC plus 型冷凍干燥機,德國Christ 公司;Infinite M200 Pro 型酶標儀,瑞士Tecan 公司;DSC3 型差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)儀,瑞士Mettler Toledo 公司;FTIR-8400S 型傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,F(xiàn)T-IR)儀,日本島津公司;XRD-7000 X 型射線衍射儀,日本Shimadzu 公司;H-7650 型透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM),Hitachi 公司;Zetasizer Nano ZS 型動態(tài)光散射儀,英國Malvern 公司;BS100-1A 型基本型蠕動泵,保定思諾流體科技有限公司;DKZ-2 型電熱恒溫振蕩水槽,上海精宏實驗設備有限公司。

    1.2 藥品與試劑

    花旗松素對照品,批號111816-201102,HPLC測定質量分數(shù)≥98%,購自中國食品藥品檢定研究院;花旗松素原料藥,批號20191208,質量分數(shù)≥90%,購自吉林健維天然生物科技有限公司;大豆卵磷脂(批號S30870,質量分數(shù)≥90%)、BSA(批號S12012,生物試劑,質量分數(shù)98%)、胃蛋白酶(批號S10027)、胰蛋白酶(批號S23119)、磷酸二氫鉀(批號S24278,分析純,質量分數(shù)99%)、磷酸氫二鉀(批號S24279,分析純,質量分數(shù)99%)均購自上海源葉生物科技有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純,無水乙醇、二氯甲烷、正辛醇均為分析純,水為純化水。

    1.3 實驗動物

    本研究所用實驗動物為SPF 級雄性SD 大鼠,體質量為180~200 g,購自遼寧長生生物技術股份有限公司,動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(遼)2020-0001,動物實驗經(jīng)長春中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準,批準文號2023191。

    2 方法與結果

    2.1 花旗松素磷脂復合物(taxifolin phospholipid complex,Tax-PC)的制備

    采用溶劑揮發(fā)法制備Tax-PC。取適量花旗松素和大豆卵磷脂溶于有機溶劑,恒溫磁力攪拌一段時間后,旋轉蒸發(fā)除去有機溶劑,加入適量二氯甲烷復溶,抽濾,減壓干燥,即得Tax-PC。

    2.2 Tax-PC/BSA NPs 及其凍干粉的制備

    經(jīng)過前期實驗篩選,采用新型白蛋白納米粒制備技術(NabTM技術)制備Tax-PC/BSA NPs。取Tax-PC 以二氯甲烷溶解,得油相;取處方量的BSA 加入純水溶解,得水相;將油、水兩相混合,采用超聲波細胞粉碎儀超聲一定時間,旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑,即得Tax-PC/BSA NPs。同樣方法制備不含藥物的空白PC/BSA NPs。將Tax-PC/BSA NPs 置于?80 ℃冰箱中預凍24 h,放入冷凍干燥機(溫度<?40 ℃,真空度<20 Pa)36 h 后取出,稱定質量,即得Tax-PC/BSA NPs 凍干粉。同樣方法制備不含藥物的空白PC/BSA NPs 凍干粉。

    2.3 花旗松素含量測定

    2.3.1 色譜條件 以Agilent Zorbox SB-C18柱為色譜柱;乙腈-水(22∶78)為流動相;檢測波長290 nm;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;體積流量1.0 mL/min。

    2.3.2 對照品溶液的制備 取花旗松素對照品2.5 mg 置于25 mL 量瓶內(nèi),甲醇溶解并定容,搖勻,0.22 μm 微孔濾膜濾過,即得含花旗松素0.1 mg/mL的對照品溶液。

    2.3.3 供試品溶液的制備 取Tax-PC/BSA NPs 混懸液5 mL,置于25 mL 量瓶內(nèi),加甲醇溶解并定容,搖勻,0.22 μm 微孔濾膜濾過,得供試品溶液。同法制備空白溶液。

    2.3.4 專屬性考察 取適量對照品溶液、供試品溶液及空白溶液,按“2.3.1”項下方法進行分析,記錄色譜圖,結果見圖1。結果花旗松素色譜峰峰形良好,且測定不受輔料和溶劑的干擾,專屬性良好。

    圖1 花旗松素對照品溶液 (A)、供試品溶液 (B) 和空白溶液 (C) 的HPLC 圖Fig. 1 HPLC of taxifolin reference substance (A), test solution (B) and blank solution (C)

    2.3.5 線性關系考察 精密吸取“2.3.2”項下對照品溶液適量,分別加甲醇稀釋至質量濃度梯度為100、50、25、12.5、6.3、3.1 μg/mL,按“2.3.1”項下方法測定各質量濃度下樣品含量,以對照品質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得花旗松素的線性回歸方程為Y=47.899X-0.035 1,R2=0.999 9,提示花旗松素在3.1~100.0 μg/mL 線性關系良好。

    2.3.6 精密度試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液適量,分別加甲醇稀釋至質量濃度梯度為75、50、25 μg/mL,在“2.3.1”項色譜條件下1 d 內(nèi)測定5 次,日內(nèi)精密度RSD 分別為1.75%、1.25%、1.42%,表明日內(nèi)精密度良好;連續(xù)測定5 d,日間精密度RSD分別為1.42%、1.11%、0.85%,表明日間精密度良好。

    2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液適量,分別在室溫下放置0、2、4、6、12、24 h,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定,結果花旗松素峰面積的RSD 為1.25%,表明穩(wěn)定性良好。

    2.3.8 重復性試驗 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液6 份,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定,結果花旗松素質量分數(shù)的RSD 為1.06%,表明重復性良好。

    2.3.9 加樣回收率試驗 取“2.3.3”項下供試品溶液適量,分別加入低、中、高不同質量濃度的花旗松素對照品溶液,得到含藥質量濃度梯度為80、100、120 μg/mL 的回收率樣品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定,計算加樣回收率,結果花旗松素的回收率在97%~101%,平均加樣回收率為99.22%,RSD 為0.82%,表明該方法符合檢測要求。

    2.4 復合率的測定

    取Tax-PC 加甲醇超聲溶解,稀釋適當倍數(shù),進樣測定,記錄峰面積,按公式計算復合率。

    m1為測定的花旗松素含量,m0為投藥量

    2.5 藥脂比的篩選

    根據(jù)Tax-PC 的復合率,對不同藥脂比2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 進行篩選。結果如表1 所示,隨磷脂占比增高復合率逐漸增大,當藥脂比達1∶3 后,復合率增長減緩。觀察各比例下的TAXPC,磷脂用量增大,復合物干燥效率降低,且易出現(xiàn)黏結現(xiàn)象。綜合考慮確定1∶3 為最佳藥脂比。

    表1 藥脂比的篩選結果 (±s, n = 3)Table 1 Screening results of drug-phosphorus ratio (±s,n = 3)

    表1 藥脂比的篩選結果 (±s, n = 3)Table 1 Screening results of drug-phosphorus ratio (±s,n = 3)

    與藥脂比1∶3 組比較:**P<0.01**P < 0.01 vs drug to lipid ratio 1:3 group

    藥脂比 復合率/% 藥脂比 復合率/%2∶1 60.72±0.28** 1∶3 89.12±0.69 1∶1 70.83±0.60** 1∶4 89.69±0.69 1∶2 84.60±0.18**

    2.6 包封率、載藥量和滲漏率的測定

    經(jīng)前期實驗考察,采用高速離心法,設定條件離心轉速14 000 r/min,離心時間20 min 進行Tax-PC/BSA NPs 的包封率、載藥量和滲漏率測定,在該條件下納米粒和游離藥物得到了有效分離,同時不影響納米粒結構穩(wěn)定性。取Tax-PC/BSA NPs 1 mL于超濾離心管,甲醇破乳并定容,搖勻,0.22 μm 微孔濾膜濾過,測定包封與未包封的花旗松素總藥量(m);取Tax-PC/BSA NPs 1 mL,置EP 管中,14 000 r/min 離心20 min,取上清液200 μL 于2 mL 量瓶,甲醇定容,測定游離藥量(m游),進樣測定含量,按公式計算包封率和載藥量。

    m納為Tax-PC/BSA NPs 凍干粉質量

    分別取新鮮制備的及置于4 ℃冰箱內(nèi)儲存48 h 后的Tax-PC/BSA NPs 混懸液,在14 000 r/min 條件下離心20 min,按公式計算納米粒滲漏率。

    m48為經(jīng)48 h 沉降后的Tax-PC/BSA NPs 混懸液藥物含量,m游為游離藥量,m為投藥量

    2.7 BBD-RSM 優(yōu)化Tax-PC/BSA NPs 的處方工藝

    2.7.1 BBD 實驗設計與結果 以總評歸一值(OD)作為工藝優(yōu)化的評價指標。采用數(shù)學轉換計算歸一值(d),其中滲漏率取值小為優(yōu),包封率和載藥量取值大為優(yōu)。公式分別如下。

    d1、d2、d3分別為Tax-PC/BSA NPs 的包封率、載藥量及滲漏率的歸一值,Y1為實測值,Ymax、Ymin分別是包封率、載藥量及滲漏率的實測最大值和最小值

    將各指標的d值按下列公式計算,得OD 值。

    在單因素實驗的基礎上,選擇藥/BSA 比(X1)、油水比(X2)、超聲時間(X3)進行3 因素3 水平的分析實驗。BBD 實驗設計的因素與水平、安排與結果見表2。

    表2 BBD 實驗設計的安排與結果Table 2 Arrangements and results of BBD experimental design

    2.7.2 BBD 實驗設計數(shù)據(jù)分析 對表2 數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,通過擬合得二元多項回歸方程為OD=0.768 0+0.206 2X1+0.058 8X2-0.062 5X3-0.002 5X1X2+0.040 0X1X3-0.225 0X2X3-0.132 8X12-0.242 8X22-0.300 3X32,R2=0.990 2。對回歸方程進行方差分析,結果如表3 所示,所建立的回歸模型具有顯著性(P<0.01),表明該模型具有統(tǒng)計學意義。失擬項無顯著性(P>0.05),說明模型擬合度良好,可用于分析和預測最優(yōu)工藝。采用軟件繪制等高線圖和三維響應面圖,結果見圖2。最終通過軟件分析優(yōu)化得到最優(yōu)處方為藥/BSA 比1∶9.39,油水比1∶11.51,超聲時間7.76 min。

    表3 BBD 實驗設計的方差分析結果Table 3 ANOVA results of BBD experimental design

    圖2 各因素間影響OD 值的響應曲面及等高線圖Fig. 2 Response surface and contour map of various factors affecting OD value

    2.8 Tax-PC/BSA NPs 最優(yōu)處方工藝的驗證

    根據(jù)響應面實驗結果,按照最優(yōu)工藝平行制備3 批Tax-PC/BSA NPs 混懸液,結果如表4 所示,3批Tax-PC/BSA NPs 混懸液平均OD 值為0.82,與預測OD 值0.85 相對偏差較小,預測性良好,綜上表明Tax-PC/BSA NPs 最優(yōu)制備工藝穩(wěn)定可靠。

    表4 驗證試驗考察結果Table 4 Results of validation test investigations

    2.9 Tax-PC/BSA NPs 的表征

    2.9.1 TEM 觀察 分別取空白PC/BSA NPs 與Tax-PC/BSA NPs 溶液,滴加于覆蓋碳膜銅網(wǎng)上,以2%磷鎢酸染色3 min,干燥后于TEM 下觀察,可見空白PC/BSA NPs 和載藥納米粒(Tax-PC/ BSA NPs)均為形態(tài)規(guī)整的類球形,且無黏連聚集現(xiàn)象(圖3)。

    圖3 空白納米粒 (A) 和載藥納米粒 (B) 的TEM 圖Fig. 3 TEM of blank nanoparticles (A) and drug-loaded nanoparticles (B)

    2.9.2 粒徑、PDI 與ζ 電位測定 取Tax-PC/BSA NPs 及空白納米粒溶液適量,置于動態(tài)光散射儀樣品池中,測定其粒徑、ζ 電位以及PDI。結果顯示,空白PC/BSA NPs 的平均粒徑為(158.00±1.55)nm、PDI 為0.190±0.010 及ζ 電位為(?32.60±0.35)mV,Tax-PC/BSA NPs 的平均粒徑為(184.90±0.98)nm、PDI 為0.275±0.010 及ζ 電位為(?36.60±0.53)mV,見圖4。

    圖4 空白PC/BSA NPs (A) 和Tax-PC/BSA NPs (B) 的粒徑分布 (I) 和ζ 電位 (II)Fig. 4 Particle size distribution (I) and ζ potential (II) of blank PC/BSA NPs (A) and Tax-PC/BSA NPs (B)

    2.9.3 DSC 取花旗松素、大豆卵磷脂、BSA、物理混合物、TAX-PC、空白PC/BSA NPs 凍干粉、Tax-PC/BSA NPs 凍干粉各5.0 mg 置鋁坩堝中,以空白坩堝為參比,載氣為N2,體積流量50.0 mL/min,升溫速度10 ℃/min,溫程30~250 ℃,進行DSC分析。如圖5 所示,大豆卵磷脂在129.17 ℃和180.17 ℃各存在2 個低強度、寬吸熱峰,表明磷脂極性區(qū)域的熔化。TAX-PC 中花旗松素的熔點峰明顯消失,而在174.50 ℃和253.83 ℃存在2 處低強度吸熱峰,顯示了藥物的非晶化。說明花旗松素與大豆卵磷脂之間存在諸如氫鍵作用或范德華力等弱分子間相互作用,使兩者結合形成磷脂復合物。BSA的熔點峰分別為94.31、220.50 ℃,花旗松素在231.25 ℃處有1 個強吸熱峰,溫度升高熔融了物理混合物,形成部分原位混合物,與原始峰相比,峰強度降低,表明物理混合物具有相加特性,該結果與Telange 等[14]報道一致。而Tax-PC/BSA NPs 凍干粉的DSC 曲線中,花旗松素的熔點峰被掩蓋,且出現(xiàn)1 處新的大寬峰,峰值為78.83 ℃,表明了Tax-PC/BSA NPs 的形成。

    圖5 花旗松素、大豆卵磷脂、BSA、物理混合物、空白PC/BSA NPs、Tax-PC/BSA NPs 的DSC 譜圖Fig. 5 DSC spectrum of taxifolin, soybean lecithin, BSA,physical mixture, blank PC/BSA NPs, and Tax-PC/BSA NPs

    2.9.4 FT-IR 分析 采用KBr 壓片法,將花旗松素、大豆卵磷脂、BSA、物理混合物、Tax-PC、空白PC/BSA NPs 凍干粉、Tax-PC/BSA NPs 凍干粉分別與KBr 以1∶100 比例研勻,壓片進行測定。觀察圖6發(fā)現(xiàn),物理混合物展現(xiàn)了物質的單純加和性;花旗松素中,3 549.02、3 402.43 cm?1屬于-OH 吸收特征峰;大豆卵磷脂中,2 924.08、2 852.71 cm?1為脂肪酸酯-CH2-的不對稱振動吸收峰,1 230.58、1 058.91 cm?1為大豆卵磷脂的P=O 基團的伸縮振動峰。Tax-PC 的-OH 峰明顯消失,并在3 404.36 cm?1處顯示1大寬峰,可能是大豆卵磷脂的P=O 基團與花旗松素的-OH 結合,致使-OH 峰變?nèi)?,并與大豆卵磷脂的3 396.64 cm?1附近的寬峰相重疊。因此,推測花旗松素與磷脂分子間可能通過氫鍵作用形成了Tax-PC。載藥后的Tax-PC/BSA NPs 中花旗松素的羥基酚吸收峰(3 549.02、3 402.43 cm?1)、苯環(huán)骨架峰(1 585.48 cm?1)被掩蓋,藥物吸收特征峰消失,表明花旗松素被包裹在納米粒中。

    圖6 花旗松素、大豆卵磷脂、BSA、物理混合物、Tax-PC、空白PC/BSA NPs、Tax-PC/BSA NPs 的FT-IR 譜圖Fig. 6 FTIR spectrum of taxifolin, soybean lecithin, BSA,physical mixture, Tax-PC, blank PC/BSA NPs, and Tax-PC/BSA NPs

    2.9.5 XRD 分析 采用管流/管壓(20 mA/40 kV),衍射范圍3°<2θ<45°,掃描速度8°/min 的檢測條件對花旗松素、大豆卵磷脂、BSA、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 凍干粉進行XRD 分析。如圖7 所示,花旗松素存在明顯的晶體衍射峰,表明花旗松素是以結晶型存在的物質。而Tax-PC 中,花旗松素已由結晶型轉為無定型,表明花旗松素與大豆卵磷脂結合形成了磷脂復合物。隨著白蛋白納米粒的進一步包封,物質依然顯示無定型態(tài),此形態(tài)有利于改善花旗松素的溶解度和釋放速率。

    圖7 花旗松素、大豆卵磷脂、BSA、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 的XRD 譜圖Fig. 7 XRD spectrum of taxifolin, soybean lecithin, BSA,Tax-PC and Tax-PC/BSA NPs

    2.10 理化性質測定

    參考文獻報道[15],采用搖瓶法測量溶解度和表觀油水分配系數(shù)(lgP)。取過量花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 分別加入到純化水、pH 1.2 鹽酸溶液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中,渦旋混合10 min,置37 ℃恒溫振蕩器中,100 r/min 連續(xù)振蕩72 h,在3600 r/min 條件下離心10 min,取上清液加甲醇稀釋適當倍數(shù),濾過,進樣測定,計算花旗松素平衡溶解度。另取適量花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 分別加入上述溶液的飽和正辛醇中,超聲溶解、濾過(0.45 μm 微孔濾膜)得花旗松素正辛醇溶液。精密移取該溶液5 mL,與同體積正辛醇飽和純化水及不同pH 值緩沖溶液混合,于37 ℃恒溫水浴振蕩24 h,靜置,分別取上下層,進樣測定,計算lgP。表5 結果顯示,Tax-PC/BSA NPs在Tax-PC 的基礎上,進一步提高了花旗松素的平衡溶解度,在水、pH 1.2 鹽酸溶液、pH 6.8 PBS 中分別提高了38.48、32.72、48.31 倍。經(jīng)白蛋白納米粒進一步包封后的花旗松素,與磷脂復合物相比lgP值大于1 且基本持平,適宜于藥物吸收,親脂性仍得到保留。

    表5 花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 的理化性質測定結果 (±s, n = 3)Table 5 Physical and chemical properties of taxifolin, Tax-PC and Tax-PC/BSA NPs (±s, n = 3)

    表5 花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 的理化性質測定結果 (±s, n = 3)Table 5 Physical and chemical properties of taxifolin, Tax-PC and Tax-PC/BSA NPs (±s, n = 3)

    樣品 介質 溶解度/(mg?mL?1) lgP花旗松素 水 0.888±0.009 0.79 pH 1.2 鹽酸溶液 0.785±0.052 0.56 pH 6.8 PBS 1.433±0.005 0.75 TAX-PC 水 1.936±0.018 1.41 pH 1.2 鹽酸溶液 1.743±0.002 1.12 pH 6.8 PBS 2.823±0.035 1.30 Tax-PC/BSA NPs 水 34.167±0.037 1.39 pH 1.2 鹽酸溶液 25.684±0.003 1.15 pH 6.8 PBS 69.230±0.009 1.32

    2.11 穩(wěn)定性考察

    2.11.1 儲存穩(wěn)定性 取Tax-PC/BSA NPs 凍干粉密封于西林瓶中,分別于4 ℃和室溫放置3 個月,觀察放置前后的外觀,并測定放置前后滲漏率、粒徑、PDI 和ζ 電位,以驗證納米粒穩(wěn)定性。根據(jù)表6 可知,Tax-PC/BSA NPs 經(jīng)4 ℃和室溫條件下分別儲存3 個月后各項指標變化程度均在可控范圍,損傷較小,表明納米粒凍干粉的儲存穩(wěn)定性良好,同時各指標結果均提示,納米粒在4 ℃條件下儲存優(yōu)于室溫,提示Tax-PC/BSA NPs 凍干粉應在4 ℃進行儲存。

    表6 納米粒儲存穩(wěn)定性 (±s, n = 3)Table 6 Storage stability of nanoparticles (±s, n = 3)

    表6 納米粒儲存穩(wěn)定性 (±s, n = 3)Table 6 Storage stability of nanoparticles (±s, n = 3)

    樣品 粒徑/nm ζ 電位/mV PDI 滲漏率/%儲存前 184.90±0.98 ?36.60±0.53 0.275±0.010 0.46±0.10 4 ℃儲存3 個月 185.70±0.33 ?36.00±0.24 0.280±0.020 0.49±0.08室溫儲存3 個月 188.10±0.08 ?35.20±0.20 0.298±0.040 0.61±0.29

    2.11.2 氧化指數(shù) 取Tax-PC/BSA NPs 溶于無水乙醇成澄明溶液,分別測定其在波長233 nm 及215 nm 的吸光度,計算氧化指數(shù),3 批Tax-PC/BSA NPs的氧化指數(shù)值分別為0.179、0.179、0.181,均在0.2以下,符合脂質微粒制劑氧化程度。

    2.12 體外模擬消化釋放

    參考文獻報道[16],進行體外模擬消化釋放。模擬消化液組成和消化條件如表7 所示,預先取3 mL花旗松素、Tax-PC 和Tax-PC/BSA NPs 樣品溶液(均含花旗松素5 mg)分別與3 mL 模擬胃液(SGF)充分混合,調(diào)pH 至1.2,裝入透析袋(MWCO3500),并置于存有150 mL 釋放介質(乙醇與不含胃蛋白酶的SGF 按1∶1 等體積混合)的錐形瓶內(nèi),恒溫振蕩消化2 h 后完成。另取6 mL 模擬腸液(SIF)繼續(xù)添加至含有上述混合物的透析袋中,調(diào)節(jié)pH 值至7.0,置于存有150 mL 釋放介質(乙醇與不含胰蛋白酶的SIF 按1∶1 等體積混合)的錐形瓶內(nèi),恒溫振蕩消化4 h;全過程分別在10、30 min 及1、2、3、4、5、6 h 取適量釋放介質,并補充同溫度同量的新鮮介質,取樣在4 ℃下保存。圖8 結果顯示,經(jīng)2 h 胃部消化,花旗松素、Tax-PC/BSANPs 累積釋放率分別為(20.56±0.35)%、(18.89±0.37)%、(11.21±0.65)%,胃部消化率均在25%以下,藥物在胃部的吸收強度較低。轉移至腸道消化環(huán)境模擬消化時(共4 h),花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSANPs的腸道消化釋放明顯增強,花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSANPs 最終累積釋放率可達(48.26±0.71)%、(71.86±1.83)%、(82.73±0.62)%。

    圖8 花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSANPs 在模擬胃-小腸消化液中的釋放情況 (±s, n = 3)Fig. 8 Release of taxifolin, Tax-PC, Tax-PC/BSANPs in simulated stomach-small intestine digestive fluid (±s, n = 3)

    2.13 大鼠在體腸吸收實驗

    2.13.1 供試品溶液的制備 Krebs-Ringer’s(K-R)試液:取氯化鈣0.37 g、氯化鈉7.8 g、氯化鉀0.35 g、氯化鎂0.02 g、葡萄糖1.4 g、碳酸氫鈉1.37 g、磷酸二氫鈉0.32 g,純化水定容至1 L,搖勻,即得。

    2.13.2 對照品溶液的制備 精密稱取花旗松素對照品5 mg,置于50 mL 量瓶中,加適量K-R 試液溶解并定容,搖勻,0.22 μm 微孔濾膜濾過,即得花旗松素對照品溶液。

    2.13.3 含藥腸灌流供試液的制備 稱取適量花旗松素、Tax-PC 及Tax-PC/BSA NPs 凍干粉,加入KR 試液配制成含花旗松素相同質量濃度的花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 腸灌流供試液。

    2.13.4 空白腸灌流液 取37 ℃預熱K-R 試液,進行在體腸灌流實驗,循環(huán)2 h,收集灌流液,4 ℃冷藏備用。

    2.13.5 專屬性考察 取適量對照品溶液、含藥腸灌流供試液及空白腸灌流液、按“2.3.1”項下色譜條件進行分析,記錄色譜圖,結果見圖9。結果花旗松素色譜峰峰形良好,灌流液中的內(nèi)源性物質對花旗松素無干擾,專屬性良好。

    圖9 花旗松素對照品溶液 (A)、含藥腸灌流供試液 (B) 和空白腸灌流液 (C) 的HPLC 圖Fig. 9 HPLC of taxifolin reference substance (A), drugcontaining intestinal perfusion test solution (B) and blank intestinal perfusion solution (C)

    2.13.6 線性關系考察 精密吸取一定量“2.13.2”項下對照品溶液,加入K-R 試液稀釋成115、52、25、14、7、1.4 μg/mL,質量濃度的系列對照品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件測定各質量濃度下樣品含量,以對照品質量濃度為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y),繪制標準曲線,得回歸方程Y=30 446X-23 658,R2=0.999 5,結果表明花旗松素在1.4~117.0 μg/mL 線性關系良好。

    2.13.7 精密度試驗 取“2.13.3”項下含藥腸灌流供試液適量,分別加K-R 試液稀釋至質量濃度梯度為75、50、25 μg/mL,按“2.3.1”項下色譜條件1 d 內(nèi)測定5 次,日內(nèi)精密度RSD 分別為0.87%、0.09%、0.07%,表明日內(nèi)精密度良好;連續(xù)測定5 d,日間精密度RSD 分別為為0.22%、0.10%、0.06%,表明日間精密度良好。

    2.13.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.13.3”項下含藥腸灌流供試液適量,分別在室溫下放置0、2、4、6、12、24 h,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定,RSD 為1.25%表明穩(wěn)定性良好。

    2.13.9 重復性試驗 取“2.13.3”項下含藥腸灌流供試液適量6 份,按“2.3.1”項下色譜條件進樣分析,結果花旗松素質量濃度的RSD 為0.97%,表明該試驗重復性良好。

    2.13.10 加樣回收率試驗 取“2.13.3”項下含藥腸灌流供試液適量,分別加入低、中、高不同質量濃度的花旗松素對照品溶液,得到含藥質量濃度梯度為60、50、40 μg/mL 的回收率樣品溶液,按“2.3.1”項下色譜條件進樣測定,計算加樣回收率,花旗松素的加樣回收率在98%~102%,平均加樣回收率為100.11%,RSD 為1.50%,結果表明該方法符合檢測要求。

    2.13.11 大鼠在體單向腸灌流實驗 選取健康雄性SD 大鼠60 只,隨機分配各20 只至花旗松素組、Tax-PC 組、Tax-PC/BSA NPs 組,每組根據(jù)腸段再次隨機分至十二指腸、空腸、回腸、結腸各5 只。實驗前12 h 大鼠禁食不禁水,采用20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠(注射劑量7 mL/kg),置于37 ℃恒溫加熱墊上固定。沿腹中線在腹腔中下部剪開3 cm的切口,分離目標腸段(十二指腸、空腸、回腸、結腸),在腸段的上下兩端分別切開一個足以插入0.3 cm 直徑玻璃管的小口,并使用滅菌手術線結扎固定。通過導管注入生理鹽水(37 ℃預熱)以清理腸段內(nèi)容物,直至流出液無肉眼可見異物(圖10)。將浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋在切斷傷口處,保持腸道濕潤、避免腹膜中液體及熱量損失。腸段上端導管連接恒流泵,為平衡腸段,以0.2 mL/min 恒速灌流K-R 試液15 min,隨后更換為花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 腸灌流液持續(xù)灌流腸段1 h,收集流出液。采用重量法對流出液體積進行校正。實驗結束后,剪取經(jīng)灌流的腸段,測量其長度與內(nèi)徑[17]。

    圖10 大鼠在體單向腸灌流模型Fig. 10 In vivo unilateral intestinal perfusion model of rats

    2.13.12 含藥腸灌流液穩(wěn)定性 取“2.13.3”項下含藥腸灌流液,在37 ℃水浴條件下孵育0、30、60、90、120 min,各時間點取樣1 mL,進樣測定,將0 min 時藥物質量濃度視為100%,計算孵育后花旗松素藥物剩余率(即孵育前后供試溶液中花旗松素含量百分比)。結果,花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 灌流液剩余藥量分別為(99.79±1.96)%、(100.48±1.42)%、(98.41±1.50)%,RSD 分別為0.97%、0.46%、1.05%,表明含藥灌流液在K-R 試液中穩(wěn)定性良好。

    2.13.13 含藥腸灌流液腸壁物理吸附 剪取腸段10 cm,生理鹽水灌流沖洗,將黏膜層翻出,置于花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 含藥腸灌流液中,在(37.0±0.5)℃水浴中恒溫孵育,分別在0、2 h取樣,進樣測定,計算剩余率。結果表明,2 h 內(nèi)花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 灌流液的剩余藥量分別為(100.90±0.60)%、(101.24±0.75)%、(99.85±0.98)%,RSD 分別為0.43%、0.33%、0.62%,表明腸壁對灌流液中藥物基本無吸附作用,對吸收測定無影響。

    2.13.14 各腸段吸收情況 分別取花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 含藥腸灌流液按照“2.13.6”項下方法操作,考察花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 在十二指腸、空腸、回腸和結腸段的吸收狀況。按公式計算藥物吸收速率常數(shù)(Ka)和藥物表觀吸收系數(shù)(Papp)。結果顯示,花旗松素、Tax-PC、Tax-PC/BSANPs 在整個腸段均有吸收,且在十二指腸吸收最好,空腸次之,表明花旗松素主要吸收部位為腸道上部。形成Tax-PC、Tax-PC/BSA NPs 后花旗松素在各腸段的吸收均得到顯著增強(P<0.05、0.01)。結果見表8。

    表8 花旗松素及其不同制劑在不同腸段的Ka 和Papp (±s, n = 5)Table 8 Absorption rate constants of taxifolin and its different preparations in different intestinal segments Ka and Papp (±s,n = 5)

    表8 花旗松素及其不同制劑在不同腸段的Ka 和Papp (±s, n = 5)Table 8 Absorption rate constants of taxifolin and its different preparations in different intestinal segments Ka and Papp (±s,n = 5)

    與花旗松素組比較:*P<0.05**P<0.01;與Tax-PC 組比較:#P<0.05##P<0.01*P < 0.05**P < 0.01 vs taxifolin group;#P < 0.05##P < 0.01 vs Tax-PC group

    腸段 Ka/(×10?3 min) Papp/(×10?3 cm?min?1)花旗松素 Tax-PC Tax-PC/BSANPs 花旗松素 Tax-PC Tax-PC/BSANPs十二指腸 68.1±4.5 120.9±7.5** 137.6±2.2**## 8.9±0.8 23.0±3.4** 31.9±1.7**##空腸 60.2±4.5 114.8±8.5** 135.8±2.1**## 7.6±0.7 20.6±3.0** 30.6±1.4**##回腸 55.8±2.1 90.2±3.5** 131.3±3.1**## 6.9±0.3 13.3±0.8** 27.9±1.7**##結腸 28.1±7.2 37.6±2.0* 50.9±4.5**# 4.2±1.2 5.9±0.4* 8.9±1.2**#

    Cin、Cout為進、出灌流液的質量濃度,Vin、Vout為進、出灌流液的體積,Q為灌流體積流量,r和L分別為腸段的半徑及長度

    3 討論

    課題組前期考察了多種制備方法將Tax-PC 載入白蛋白納米粒中,包括去溶劑化法、納米沉淀法、熱凝膠法、噴霧干燥法、自組裝法、NabTM技術等。綜合多種制備方法,NabTM技術展現(xiàn)出較為突出的優(yōu)勢,制備得到的納米粒粒徑小、無表面活性劑參與,同時規(guī)避高溫對脂質類制劑的氧化影響、保護蛋白性質等。NabTM技術利用了白蛋白的結構特點,在高剪切力下產(chǎn)生了氣穴空化效應-超氧化物離子,通過氧化巰基殘基或斷裂二硫鍵,圍繞花旗松素交聯(lián)搭建新的二硫鍵,形成聚合物殼體[18]。目前,NabTM技術在白蛋白納米粒的制備當中已獲得廣泛認可。

    口服給藥是最常用的臨床給藥方式,藥物經(jīng)口服后通常在小腸部位吸收,透過腸壁參與血液循環(huán),進而發(fā)揮藥物療效。磷脂與藥物結合,能夠提高藥物通過富含脂質的生物膜的能力,Tax-PC 明顯提高了花旗松素的油水分配情況,而經(jīng)過白蛋白納米粒進一步包封后,其lgP值與磷脂復合物基本持平,仍適宜于藥物吸收(lgP>1),側面證明磷脂的兩親性在Tax-PC/BSA NPs 形成后得到保留,白蛋白納米粒包封磷脂復合物,磷脂的2 條長脂肪鏈不參與該過程,仍然能夠自由轉動,形成親脂外觀。Tax-PC/BSA NPs 在Tax-PC 的基礎上,進一步提高了花旗松素的平衡溶解度,改善藥物口服吸收。

    體外模擬消化釋放過程中,Tax-PC/BSA NPs 的胃部累積釋放率明顯低于花旗松素,造成這種差異的原因可能是花旗松素經(jīng)磷脂、牛血清白蛋白雙層載體包封,在一定程度上維持了納米粒結構的穩(wěn)定性,經(jīng)胃蛋白酶的消化作用后,部分BSA 需逐步分解,花旗松素才能緩慢釋放。因此在胃部消化階段,Tax-PC/BSA NPs 能夠減緩花旗松素的釋放,利于腸道對藥物的吸收和利用。而在腸道消化環(huán)境模擬消化時,Tax-PC/BSA NPs 吸收狀況明顯優(yōu)于花旗松素、Tax-PC,BSA 需經(jīng)胰蛋白酶水解,膽鹽輔助氧化分解,使納米粒的結構破壞,藥物快速釋放,而磷脂等脂類物質的存在,也能夠加速腸道消化。因此認為Tax-PC/BSA NPs 在一定程度上減少了藥物在胃部吸收并增強了藥物腸道定位釋放,有效提高花旗松素的吸收狀況。

    基于此,本研究采用大鼠在體單向腸灌流模型,以更好地模擬體內(nèi)腸道環(huán)境,比較不同劑型對花旗松素腸道吸收的改善狀況,闡明其在各腸段吸收特征。結果表明,花旗松素在大鼠各腸段均有吸收,制備成磷脂復合物白蛋白納米粒后,藥物在各腸段的吸收均有顯著提高(P<0.05、0.01),Tax-PC/BSA NPs 相較花旗松素,Ka在十二指腸、空腸、回腸、結腸分別提高2.02、2.26、2.35、1.81 倍,Papp分別提高3.58、4.03、4.04、2.12 倍,說明Tax-PC/BSA NPs 能夠改善藥物在體腸吸收狀況,可為花旗松素新劑型的研發(fā)和臨床合理應用提供新的選擇。

    此外,本課題組在后續(xù)研究中會進一步考察大鼠ig Tax-PC/BSA NPs 后的生物利用度,以驗證制劑的合理性。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

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