血見愁中1 個(gè)新的倍半萜類化合物

王建斌，高 純，陳 昊，付宏征

1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院（轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)院），江蘇 揚(yáng)州 225009

2. 江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009

3. 北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191

唇形科（Labiatae）香科科屬TeucriumL.植物在全球約有300 余種，遍布世界各地，尤其是在地中海地區(qū)。我國有18 種、10 變種，全國各地均有分布，多數(shù)種主要集中在西南地區(qū)[1-3]。香科科屬植物作為藥用植物已有2000 多年的歷史，具有清熱解毒、發(fā)表散寒、健脾利濕等功效，民間主要用以治療風(fēng)寒感冒、消化不良、痢疾、無名腫痛、跌打損傷等癥[4]，化學(xué)成分及現(xiàn)代藥理研究表明香科科屬植物的主要化學(xué)成分為單萜、倍半萜、二萜、甾醇、皂苷、環(huán)烯醚萜、黃酮、多酚、生物堿及揮發(fā)油，主要藥理活性有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌及降血糖的作用[5-15]。

血見愁TeucriumviscidumBl.，又名山藿香、肺形草、布地錦等，產(chǎn)于江蘇南部、浙江、福建、臺(tái)灣、江西、湖南、廣東、廣西、云南、四川西南部及西藏東南部。全草入藥，各地廣泛用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打損傷、肺膿瘍、急性胃腸炎、消化不良、凍瘡腫痛、翠丸陘腫、吐血、衄血、外傷出血、毒蛇咬傷、療瘡癤腫等癥[1]。據(jù)《嶺南采藥錄》載：“涼血解毒，去瘀生新，理跌打，敷瘡毒，治蛇傷，消腸風(fēng)下血”。但是關(guān)于其化學(xué)成分及藥理作用的研究等方面報(bào)道較少[6,11-15]。為了進(jìn)一步豐富血見愁的化學(xué)成分庫，本研究對(duì)其全草乙醇提取物進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，得到1 個(gè)倍半萜類化合物和6 個(gè)苯丙素類化合物（圖1），分別鑒定為9-羥基-6,7-去環(huán)氧-莖點(diǎn)霉甜菜烯酮（9-hydroxy-6,7-deepoxyphomenone，1）、迷迭香酸（rosmarinic acid，2）、迷迭香酸甲酯（methyl rosmarinate，3）、迷迭香酸乙酯（ethyl rosmarinate，4）、反式咖啡酸（trans-caffeic acid，5 ）、反式咖啡酸乙酯（trans-caffeic acid ethyl ester，6）、反式咖啡酸乙烯酯（trans-caffeic acid，7）。其中，化合物1 為新化合物，命名為血見愁酮A，化合物2～4 為血見愁植物中首次分離得到。同時(shí)對(duì)所得化合物進(jìn)行了超氧陰離子清除活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有抗氧化活性的化合物，為血見愁的后續(xù)開發(fā)研究提供基礎(chǔ)。

圖1 化合物1～7 的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of compounds 1?7

1 儀器與材料

Bruker-400/Avance DRX-400 核磁共振光譜儀（德國Bruker 公司），Nicolet Nexus 470 紅外光譜儀（美國Thermo 公司），XEVO-G2QTOF# YCA166 質(zhì)譜儀（美國Waters 公司），PL341/343 型旋光儀（美國Perkin-Elmer 公司），BP1224S 萬分之一電子秤（北京賽多利斯天平有限公司），LabAlliance 分析型高效液相（天津蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司），Waters 2487 型半制備型高效液相（美國Waters 公司），Rotavapor R-210 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）。

分析純甲醇、乙腈、醋酸乙酯、氯仿、石油醚、丙酮、正丁醇（分析純，北京化工廠），柱色譜用硅膠（200～300、60～80 目，安徽良臣硅源材料有限公司），Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠），薄層色譜硅膠H（青島海洋化工廠），YMC*GEL ODS-A 反相硅膠（日本YMC 公司）YMC-pack C18column 半制備型色譜柱（日本YMC 公司）。

血見愁于2012 年3 月采購自廣東清遠(yuǎn)藥材市場(chǎng)，由廣東中醫(yī)藥大學(xué)關(guān)世俠教授鑒定為T.viscidumBl.。植物樣品（201210XJC）保存在北京大學(xué)天然藥物及仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

10 kg 干燥血見愁全草用10 倍量95%乙醇提取3 次，每次4 h。得到浸膏3.1 kg。將其溶解于熱水中，醋酸乙酯萃取3 次，得到醋酸乙酯層181.4 g。將其溶解于甲醇溶液中，用石油醚萃取，共得到石油醚層25.4 g（暫存），余下甲醇部分156.0 g。

將甲醇部分經(jīng)硅膠柱分離，氯仿-甲醇系統(tǒng)（100∶0→0∶1）梯度洗脫，得到10 個(gè)組分（Fr. 1～10），組分Fr. 3（7.3 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，石油醚-醋酸乙酯系統(tǒng)（5∶1→1∶2）梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr. 3.1～3.9，F(xiàn)r. 3.5（236.5 mg）經(jīng)Sephadex LH-20 分離（甲醇洗脫），制備液相色譜純化（48%甲醇-水洗脫，體積流量1.5 mL/min），得到化合物1（8.9 mg，tR＝58.5 min）。組分Fr. 3.3（1.25 g）Sephadex LH-20 分離（甲醇系統(tǒng)洗脫），制備液相純化（45%甲醇-水洗脫，體積流量1.5 mL/min），得到化合物6（13.1 mg，tR＝59.2 min）和7（8.3 mg，tR＝63.5 min）。組分Fr. 7（33.6 g）經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-醋酸乙酯（3∶1→1∶3）梯度洗脫，重結(jié)晶得到化合物5（25.5 mg）。組分Fr. 8（16.1 g）經(jīng)硅膠柱分離，石油醚-醋酸乙酯（3∶1→1∶3）梯度洗脫，得到8 個(gè)組分Fr. 8.1～8.8，F(xiàn)r. 8.8（133.4 mg）經(jīng)Sephadex LH-20 分離（甲醇洗脫），制備液相色譜純化（42%甲醇-水洗脫，體積流量1.5 mL/min），得到化合物2（20.1 mg，tR＝22.6 min）、3（32.3 mg，tR＝39.7 min）和4（3.8 mg，tR＝42.2 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

13C-NMR 譜結(jié)合DEPT 譜共給出1 個(gè)共軛酮羰基 (δC180.7)、6 個(gè)烯碳 (δC155.3, 135.1, 143.8,138.1, 148.4, 114.1)、1 個(gè)sp3雜化的季碳 (δC43.4)、2 個(gè)sp3雜化的次甲基碳 (δC70.6, 44.9)、3 個(gè)sp3雜化的亞甲基碳 (δC64.6, 36.0, 19.1) 和2 個(gè)甲基碳(δC20.9, 13.9)。1H-NMR 給出3 個(gè)次甲基氫δH7.36(s, H-6), 3.97 (d,J= 2.4 Hz, H-3), 1.44 (td,J= 7.1,2.4 Hz, H-4)；1 對(duì)末端烯氫δH5.81 (d,J= 1.5 Hz,H-12α), 5.63 (s, H-12β)；3 對(duì)亞甲基氫δH4.89 (s, 2H,H-13), 3.40 (brd,J= 2.8 Hz, H-1α), 2.77 (td,J= 13.4,4.2 Hz, H-1β) 和δH2.22 (brd,J= 13.4 Hz, H-2α),1.64 (tt,J= 13.4, 2.8 Hz, H-2β)；2 個(gè)甲基信號(hào)δH1.35(d,J= 7.1 Hz, CH3-14), 1.56 (s, CH3-15)。二維核磁信號(hào)的詳細(xì)解析（圖2）表明該化合物與已知化合物(＋)-6-dehydropetasol[16]非常相似，不同之處在于低場(chǎng)區(qū)比其少了1 個(gè)9 位烯氫，且9 位烯碳的化學(xué)位移符合連氧烯碳的特征，表明化合物1 中9 位上的烯氫被羥基取代；另外高場(chǎng)區(qū)少了1 個(gè)13 位甲基信號(hào)，而在化學(xué)位移64.6 處多了1 對(duì)連氧次甲基信號(hào)δH4.89 (2H, s, H-13) 表明化合物1 的13 位由甲基變成羥甲基。在HMBC 譜中（圖2），H-13 (δH4.89)與C-11 (δC148.4)、C-7 (δC135.1)、C-12 (δC114.1) 有相關(guān)，H-1 (δH2.77) 與C-9 (δC143.8) 有相關(guān)，證明了以上結(jié)論。

圖2 化合物1 的主要HMB 和COSY 相關(guān)Fig. 2 Key HMBC and COSY correlations of compound1

NOESY 譜中（圖3），H-3 (δH3.97) 與H-1α(δH2.77) 及H3-15 (δH1.35) 有相關(guān)，H-1β (δH2.77)與H3-15 (δH1.59) 有相關(guān)，提示他們位于分子同側(cè)；H-2α (δH2.22) 與H-4 (δH1.44) 的相關(guān)峰提示其空間位置接近。提示1 的相對(duì)構(gòu)型如圖所示。綜上確定化合物1的結(jié)構(gòu)為9-羥基-6,7-去環(huán)氧-莖點(diǎn)霉甜菜烯酮，為1 個(gè)新化合物，命名為血見愁酮A。

圖3 化合物的主要NOESY 相關(guān)Fig. 3 Key NOESY correlations of compound 1

化合物2：淡黃色油狀物，1%茴香醛-硫酸顯紫紅色，ESI-MSm/z359.08 [M－H]?，分子式C18H16O8，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.45(1H, d,J= 15.8 Hz, H-7)，7.05 (1H, s, H-2), 7.00 (1H,d,J= 7.9 Hz, H-5), 6.77 (1H, d,J= 7.9 Hz, H-6), 6.67(1H, s, H-2′), 6.63 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-5′), 6.52 (1H,d,J= 7.8 Hz, H-6′), 6.23 (1H, d,J= 15.8 Hz, H-8),5.02 (1H, brs, H-8′), 3.00～2.86 (2H, m, H-7′)；13CNMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 170.9 (C-9′), 165.9(C-9), 148.6 (C-4), 145.8 (C-7), 145.5 (C-3), 144.9(C-3′), 144.0 (C-4′), 127.5 (C-1′), 125.3 (C-1), 121.5(C-6), 120.0 (C-6′), 116.7 (C-2′), 115.8 (C-5), 115.4(C-5'), 114.9 (C-2), 113.4 (C-8), 73.0 (C-8′), 36.2 (C-7′)。物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[17-18]，故鑒定該化合物為迷迭香酸。

化合物3：淡黃色油狀物，1%茴香醛-硫酸顯紫紅色，ESI-MSm/z: 373.09 [M－H]?，分子式C19H18O8，1H-NMR (400 MHz, Pyridine-d5)δ: 7.99(1H, d,J= 15.8 Hz, H-7)，7.52 (1H, s, H-2), 7.35 (1H,s, H-2′), 7.21 (1H, overlapped, H-5′), 7.18 (1H,overlapped, H-5), 7.08 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6), 6.91(1H, d,J= 8.0 Hz, H-6′), 6.60 (1H, d,J= 15.8 Hz,H-8), 5.70 (1H, t,J= 6.4 Hz, H-8′), 3.63 (1H, s, H-10′), 3.32 (2H, m, H-7′)；13C-NMR (100 MHz,Pyridine-d5)δ: 170.8 (C-9′), 166.9 (C-9), 150.6 (C-4),147.2 (C-7), 147.1 (C-3), 147.5 (C-3′), 146.2 (C-4′),127.9 (C-1′), 126.5 (C-1), 122.2 (C-6), 120.9 (C-6′),117.8 (C-2′), 116.6 (C-5), 116.4 (C-5′), 115.8 (C-2),113.9 (C-8), 73.8 (C-8′), 51.9 (C-10′), 37.3 (C-7′)。物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[17-18]，故鑒定該化合物為迷迭香酸甲酯。

化合物4：淡黃色油狀物，1%茴香醛-硫酸顯紫紅色，ESI-MSm/z387.12 [M－H]?，分子式C20H20O8，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 7.49(1H, d,J= 16.0 Hz, H-7), 7.07 (1H, s, H-2), 7.03 (1H,d,J= 7.6 Hz, H-5), 6.78 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-5'),6.66 (1H, s, H-2'), 6.65 (1H, d,J= 8.0 Hz, H-6'), 6.51(1H, d,J= 7.6 Hz, H-6), 6.23 (1H, d,J= 16.0 Hz,H-8), 5.09 (1H, t,J= 6.2 Hz, H-8'), 4.09 (2H, q,J=7.0 Hz, H-10'), 2.96 (2H, d,J= 6.2 Hz, H-7'), 1.15(3H, t,J= 7.0 Hz, C-11')；13C-NMR (100 MHz,DMSO-d6)δ: 169.9 (C-9'), 166.3 (C-9), 149.2 (C-4),146.7 (C-7), 146.1 (C-3), 145.4 (C-3'), 144.6 (C-4'),127.1 (C-1'), 125.6 (C-1), 122.1 (C-6), 120.6 (C-6'),117.2 (C-2'), 116.2 (C-5), 115.9 (C-5'), 115.5 (C-2),113.4 (C-8), 73.3 (C-8'), 61.2 (C-10'), 36.8 (C-7'),14.4 (C-11')。物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[17]，故鑒定該化合物為迷迭香酸乙酯。

化合物5：黃色無定形粉末，1%茴香醛-硫酸顯黃色，ESI-MSm/z179.04 [M－H]?，分子式C9H8O4，1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ: 12.12 (1H, s, H-9),9.53 (1H, s, H-3), 9.14 (1H, s, H-4), 7.42 (1H, d,J=15.8 Hz, H-7), 7.03 (1H, brs, H-2), 6.96 (1H, brd,J=8.1 Hz, H-6), 6.76 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5), 6.18 (1H,d,J= 15.8 Hz, H-8)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ: 168.4 (C-9), 148.6 (C-3), 146.0 (C-4), 145.1 (C-7),126.2 (C-1), 121.6 (C-6), 116.2 (C-5), 115.6 (C-2),115.1 (C-8)。物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[19]，故鑒定該化合物為反式咖啡酸。

化合物6：黃色固體，1%茴香醛-硫酸顯黃色，ESI-MSm/z: 207.07 [M－H]?，分子式C11H12O4，1H-NMR (400 MHz, Pyridine-d5)δ: 7.97 (1H, d,J=15.9 Hz, H-7), 7.62 (1H, s, H-2), 7.21 (2H,overlapped, H-5, 6), 6.60 (1H, d,J= 15.9 Hz, H-8),4.24 (2H, q,J= 7.1 Hz, H-10), 1.19 (1H, t,J= 7.1 Hz,H-11)；13C-NMR (100 MHz, Pyridine-d5)δ: 167.3(C-9), 150.4 (C-4), 147.7 (C-3), 145.7 (C-7), 126.9(C-1), 122.0 (C-6), 116.7 (C-5), 115.7 (C-2), 115.1(C-8), 60.1 (C-10), 14.4 (C-11)。物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[17]，故鑒定該化合物為反式咖啡酸乙酯。

化合物7：黃色固體，1%茴香醛-硫酸顯黃色，ESI-MSm/z: 205.04 [M－H]?，分子式C11H10O4，1HNMR (400 MHz, Acetone-d6)δ: 7.67 (1H, dd,J=15.8, 3.3 Hz, H-7), 7.39 (1H, m, H-10), 7.23 (1H, brs,H-2), 7.07 (1H, brs, H-5), 6.91 (1H, m, H-6), 6.32(1H, dd,J= 15.8, 3.3 Hz, H-8), 4.92 (1H, m, H-11a),4.61 (1H, m, H-11b)；13C-NMR (100 MHz, Acetone-d6)δ: 163.8 (C-9), 148.7 (C-4), 147.2 (C-3), 145.7 (C-7),141.4 (C-10), 126.3 (C-1), 122.1 (C-6)，115.6 (C-5),114.6 (C-2), 112.7 (C-8), 96.5 (C-11)。物理性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致[20]，故鑒定該化合物為反式咖啡酸乙烯酯。

4 活性測(cè)定

香科科屬植物提取物具有明確的抗氧化活性[21-22]。采用酶標(biāo)法測(cè)定化合物1～7 的抗氧化活性（超氧陰離子清除率），化合物2、3、5～7 均表現(xiàn)出了一定的抗氧化活性，半數(shù)效應(yīng)濃度（median effect concentration, EC50）結(jié)果見表2。

表2 化合物2、3、5～7 體外超氧陰離子清除活性結(jié)果Table 2 Superoxide anion scavenging activities of compounds 2, 3, 5-7

5 討論

香科科屬植物種類豐富，分布廣泛，藥理作用多樣，具有一定的開發(fā)價(jià)值。目前，對(duì)該屬植物的化學(xué)成分、藥理作用及作用機(jī)制的研究相對(duì)較少，藥用價(jià)值開發(fā)不夠充分，尤其是藥用植物血見愁。本研究從血見愁中分離得到7 個(gè)化合物，化合物1為1 個(gè)新的倍半萜類化合物。藥理活性篩選發(fā)現(xiàn)，化合物2、3、5～7 表現(xiàn)出了一定的體外抗氧化活性，為血見愁開發(fā)和利用提供了化學(xué)成分以及藥理活性方面的依據(jù)?；诋?dāng)前的文獻(xiàn)報(bào)道，該屬植物萜類成分豐富，可能是發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也具有發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的化學(xué)成分的潛力，因此，從血見愁中發(fā)現(xiàn)更多的萜類成分并根據(jù)血見愁的傳統(tǒng)功效，開展藥理活性研究，闡明其物質(zhì)基礎(chǔ)，是其藥用價(jià)值開發(fā)的前提，也是后續(xù)需要關(guān)注的問題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突