KASP技術(shù)在動物資源鑒定及標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用

符宏高，楊理程，吳銳瓊，黃 鎮(zhèn)

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/福建省發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點實驗室,福建 福州 350117)

動物遺傳育種是改善動物經(jīng)濟(jì)性狀和環(huán)境適應(yīng)性的過程，而傳統(tǒng)的人工育種方式受到遺傳多樣性的影響而效率低下。單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotide polymorphisms，SNP)是指DNA序列中的單個堿基的插入、缺失、轉(zhuǎn)換及顛換，其在動植物基因組中廣泛分布[1]。SNP作為第三代分子標(biāo)記的代表，具有分析成本低、基因組豐度高、位點特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，使其受到廣大育種學(xué)家的青睞[2-3]。隨著高通量測序技術(shù)(NGS)的發(fā)展，包括Golden GateTM、Taq ManTM、SNP streamTM、SNP WaveTM、KASPTM等在內(nèi)的眾多SNP基因分型平臺不斷被研發(fā)與應(yīng)用[4]。

競爭性等位基因特異性PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP)是一種基于熒光的同質(zhì)基因分型技術(shù)，該技術(shù)利用獨特的競爭性等位基因特異性PCR與新型、同質(zhì)、基于熒光的報告系統(tǒng)相結(jié)合，用于識別和測量發(fā)生在核苷酸水平的遺傳變異，以檢測SNP或插入和缺失(Insertion and Deletion，InDels)[5-7]。KASP技術(shù)在農(nóng)作物中具有廣泛的應(yīng)用，包括種質(zhì)資源鑒定、分子標(biāo)記輔助育種、基因定位和種子純度鑒定等，但對于其在動物中的應(yīng)用缺少系統(tǒng)性的探究和指南[7]。通過闡述KASP技術(shù)在動物領(lǐng)域的研究與應(yīng)用，有助于深入了解該技術(shù)在動物遺傳育種中的潛在優(yōu)勢和限制，指導(dǎo)動物育種者在實際應(yīng)用中的技術(shù)選擇和實施，對于推動動物遺傳育種的發(fā)展和應(yīng)用具有重要意義。

1 KASP技術(shù)原理與優(yōu)勢

1.1 KASP體系組成與反應(yīng)原理

KASP技術(shù)檢測體系主要由以下部分組成：樣品DNA模板、KASP master mix(包含5′端含F(xiàn)AM和HEX基團(tuán)的熒光探針、兩個淬滅探針)、KASP assay mix(兩條正向引物和一條反向引物，每個正向引物的5′端包含一個標(biāo)簽序列，3′端末尾包含SNP位點特異性堿基)、反應(yīng)酶等[5]。KASP的反應(yīng)流程大致可以分為三輪PCR反應(yīng)(圖1)：第一輪反應(yīng)，兩個正向引物通過3′端特異性等位基因堿基與模板DNA相對應(yīng)堿基位點結(jié)合，并進(jìn)行延伸復(fù)制；反向引物與另一條模板鏈結(jié)合并延伸。第二輪反應(yīng)，經(jīng)過第一輪反應(yīng)得到的產(chǎn)物為包含有標(biāo)簽序列的DNA模板，反向引物與該條鏈結(jié)合并進(jìn)行延伸，合成標(biāo)簽序列模板SNP位點下游序列的互補(bǔ)序列，將SNP位點引入相對應(yīng)的PCR產(chǎn)物中。第三輪，帶有FAM/HEX熒光基團(tuán)的寡聚核苷酸與帶有猝滅基團(tuán)的寡聚核苷酸分離，隨后帶有FAM/HEX熒光基團(tuán)的探針與第二輪反向引物延伸合成子鏈的SNP位點下游的尾部序列互補(bǔ)結(jié)合，熒光基團(tuán)不再被淬滅，通過熒光檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，并轉(zhuǎn)化成信號輸出。隨著這一步反應(yīng)呈指數(shù)式增長，越來越多的熒光信號被檢測到，信號逐漸增強(qiáng)，從而根據(jù)熒光信號的構(gòu)成對基因類型進(jìn)行判斷。

圖1 KASP技術(shù)反應(yīng)原理

1.2 KASP技術(shù)相對于傳統(tǒng)SNP檢測技術(shù)的優(yōu)勢

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，SNP的檢測方法也從原始的基于PCR的檢測，到現(xiàn)在的高通量測序檢測。縱觀SNP檢測方法的發(fā)展歷史，通量由低到高、分析步驟復(fù)雜到便捷、耗時長到短是其主旋律。表1系統(tǒng)性地列舉出幾種具有代表性的SNP檢測方法的優(yōu)缺點及適用范圍。

表1 幾種具有代表性的SNP檢測方法的優(yōu)缺點與適用范圍

1.2.1精確靈活、背景噪點低 通過將KASP技術(shù)與基于芯片的IlluminaGolden Gate平臺進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)：(1)在KASP檢測結(jié)果中，陰性對照始終聚集在一起，且?guī)缀醪粫a(chǎn)生超過等位基因調(diào)用閾值信號。因此其背景噪點對基因分型結(jié)果影響較小，而Golden Gate則與此相反。(2)在陽性對照DNA樣品中，KASP技術(shù)的平均基因分型誤差為0.7%～1.6%，低于使用GoldenGate平臺觀察到的誤差(2.0%～2.4%)。(3)相比于主流的基于芯片的基因分型技術(shù)(如Affymetrix公司的Gene ChipTM微陣列技術(shù)和Illumina公司的BeadArrayTM技術(shù)等[21])，KASP技術(shù)在需要少量到中等數(shù)量SNP標(biāo)記的應(yīng)用中提供了經(jīng)濟(jì)高效和靈活的選擇；如質(zhì)量控制分析、雙親群體中的數(shù)量性狀位點(Quantitative Trait Locus，QTL)作圖、標(biāo)記輔助選擇(Marker Assisted Selection，MAS)、標(biāo)記輔助回交(Marker Assisted Backcrossing，MABC)等[4，22]。

1.2.2通量高、成本低、分析時間短 KASP技術(shù)的另一大優(yōu)勢是通量高、成本效益低和綜合分析耗時短。KASP反應(yīng)體系適用于96、384、1536孔板，每個反應(yīng)孔每次可檢測單個SNP位點信息。Broccanello等[23]通過rhAmp-based、Taqman、KASP這3種基因分型技術(shù)對12個甜菜近交群體中的33個SNP進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，KASP技術(shù)能夠在每個反應(yīng)低至0.9 ng DNA情況下成功對SNP進(jìn)行基因分型。該反應(yīng)基于384孔板進(jìn)行，每次反應(yīng)體系為5 μL，KASP每樣本約0.85元，而Taqman檢測花費(fèi)每樣本2.24元。此外，從384板反應(yīng)體系制備到數(shù)據(jù)分析完成僅需115 min，略低于Taqman的125 min。與此同時，通過KASP技術(shù)進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇時，其成本比BeadXPress和Golden Gate平臺低7.9%～46.1%[4]。在小規(guī)?；蚍中蜋z測領(lǐng)域，基于凝膠電泳對SNP區(qū)域進(jìn)行分型昂貴且耗時；而KASP基因分型技術(shù)并不依賴于凝膠檢測，使用常規(guī)的q-PCR儀器即可進(jìn)行檢測分析，獨具優(yōu)勢[24]。

2 KASP技術(shù)在動物領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

2.1 遺傳多樣性鑒定

遺傳多樣性(Genetic Diversity)是指種內(nèi)不同種群之間或一個種群內(nèi)不同的個體的遺傳變異總和。遺傳多樣性越高或遺傳變異(Genetic Variation)越豐富，生物對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，而KASP技術(shù)可以檢測DNA水平上(SNP)的遺傳多樣性情況。由于KASP技術(shù)的便捷與高效性，近些年越來越多的研究利用其開展遺傳多樣性鑒定與應(yīng)用分析，如煙粉虱群體鑒定、西花薊馬抗性突變鑒定、荷斯坦牛群遺傳缺陷鑒定。

在昆蟲中，Munguti等[25]使用KASP基因分型技術(shù)，針對線粒體DNA細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(Mitochondrially Encoded Cytochrome C OxidaseI，MT-CO1)的SNP序列，將肯尼亞煙粉虱(Bemisiatabaci)單倍型代表性樣本分為兩個單倍群，并研究了不同群體與該地區(qū)木薯病毒病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度之間的相關(guān)性[26]。此外，Wosula等[27]也利用KASP技術(shù)設(shè)計了7組引物，用來區(qū)分非洲木薯上的6種煙粉虱單倍型群體。其檢測結(jié)果與NextRAD測序結(jié)果一致，表明KASP技術(shù)可以用來快速診斷或監(jiān)測木薯粉虱，這也是KASP技術(shù)首次用于昆蟲鑒定。Sun等[28]根據(jù)西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)的煙堿型乙酰膽堿受體α6亞單位G275E的突變情況，設(shè)計了易感野生型和抗性突變型引物，通過KASP技術(shù)對過去收集的62個野外種群進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)其中有44個攜帶G275E突變。G275E的突變賦予了中國西花薊馬種群對化藥殺傷的抗性，因此對突變種群的抗性分子診斷有利于管理生物入侵和精準(zhǔn)防治。

在奶牛中，Khan等[29]使用KASP基因分型技術(shù)對中國6個荷斯坦牛群中9種遺傳缺陷的攜帶者頻率進(jìn)行評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1633頭奶牛中，HH1、HH3、CVM、HH5、HCD、BS、HH6和BLAD的遺傳缺陷攜帶者頻率分別為6.92%、5.76%、4.46%、4.30%、3.62%、2.94%、1.86%和0.37%，未發(fā)現(xiàn)HH4攜帶者。類似地，呂小青等[30]與和玉偉等[31]也通過該方法對北京地區(qū)奶牛養(yǎng)殖群體的HH1和HH6遺傳缺陷進(jìn)行鑒定，其中HH1遺傳缺陷的攜帶率為12.66%，而HH6遺傳缺陷僅在母牛群體中檢測到，攜帶率為1.93%，未在公牛中檢測到。這些遺傳缺陷的存在提示奶牛育種工作者需要對奶牛種群及個體進(jìn)行常規(guī)分子檢測，并采取有效措施管理遺傳缺陷，避免生產(chǎn)畜群中的高頻率攜帶者互相交配。通過標(biāo)記輔助選擇等措施，可以消除或降低遺傳缺陷等位基因的頻率。

2.2 功能基因分析

功能基因是指在生物體中具有特定功能的DNA分子序列，其通過轉(zhuǎn)錄和翻譯過程將DNA信息轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)，從而發(fā)揮特定的生物學(xué)功能。功能基因的遺傳變異程度將影響生物體的遺傳穩(wěn)定性與發(fā)育方向。而SNP廣泛分布于基因組中，對基因的時空表達(dá)具有重要影響?；贙ASP技術(shù)在成本和通量方面的優(yōu)勢，其適用于功能基因的SNP變異檢測與分析。KASP技術(shù)被廣泛應(yīng)用于鳥類和部分偶蹄類動物中基因多態(tài)性的篩選和分析，為動物的育種計劃、功能基因研究和繁殖力的改良提供了重要的研究方法。

在鳥類中，樂雅磬[32]為探究位于基因RAD51AP2的單倍型在固始雞中的突變情況，選取候選單倍型中的標(biāo)簽SNP Chr3：100032105 A>C進(jìn)行KASP基因分型。結(jié)果顯示，在檢測的106個固始雞個體中，除3個沒有檢測到的信號外，基因型AA、AC、CC的個體數(shù)分別為95、6、2個。隨后對已有KASP分型結(jié)果的樣品進(jìn)行酶切驗證，發(fā)現(xiàn)KASP檢測為CC基因型的個體，酶切結(jié)果均為AC基因型，其余結(jié)果一致，表明該突變CC純合型同樣為致死基因型，檢測準(zhǔn)確率為98.06%。Chang等[33]采用KASP技術(shù)和專門設(shè)計的引物分析了先前報道的賽鴿優(yōu)良遺傳特性有關(guān)的基因(LDHA、DRD4、MTYCB)并進(jìn)行鑒定，在測定的107個賽鴿樣本中，與傳統(tǒng)的PCR-RFLP方法結(jié)果100%吻合。表明KASP技術(shù)作為一種可替代的快速、可靠、經(jīng)濟(jì)有效的方法來檢測賽鴿優(yōu)良基因的多態(tài)性，能大大地減少時間與成本。劉繼強(qiáng)等[34]通過對雞的性連鎖矮小基因(dw基因)和非性連鎖矮小基因的核苷酸序列比對后設(shè)計了1對KASP引物，通過KASP基因分型技術(shù)對雞群體進(jìn)行檢測，成功檢測出性連鎖矮小基因純合子的位點。由于矮小雞具有基礎(chǔ)代謝率低、耗料少、飼養(yǎng)密度大、適應(yīng)性和抗應(yīng)激強(qiáng)等優(yōu)勢，通過該方法在地方雞種中引入矮小基因，進(jìn)行矮小型配套系的選育和開發(fā)具有重要的生產(chǎn)和研究意義。張儷萍[35]利用KASP技術(shù)對吉林黃雞和北京油雞雜交子代F1代雞LEPR基因和A-FABP基因的多態(tài)性與屠宰性能進(jìn)行分析，結(jié)果表明LEPR內(nèi)含子8的G/A與C/T突變和A-FABP外顯子1和內(nèi)含子2的C/T突變均為影響屠宰性狀的潛在位點，該兩個位點可以作為雞IMF篩選分子標(biāo)志。該研究為利用北京油雞和吉林黃雞雜交后代培育優(yōu)質(zhì)雞配套系提供部分科學(xué)的理論依據(jù)。

在羊類中，Ilie等[36]利用KASP技術(shù)對150只山羊中10個基因(PTX3、IL6、CLEC4E、IL8、IL1RN、IL15RA、TNFSF13、SOCS3、TNF、TLR3)進(jìn)行SNP篩選，共獲得16個多態(tài)性SNP。這些SNP分布于不同的染色體上，與山羊的抗寄生蟲和乳腺感染相關(guān)，以及與生產(chǎn)性狀有關(guān)，或?qū)χ匾拇x狀況有潛在貢獻(xiàn)。這些多態(tài)性SNP可用于未來基于基因組的山羊育種計劃。Zhang等[37]在綿羊IL-18基因內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了3個新的變異位點，且3個SNP處于強(qiáng)連鎖狀態(tài)，對其中的一個SNP位點利用KASP技術(shù)進(jìn)行基因分型，并結(jié)合統(tǒng)計軟件分析不同基因型和血液學(xué)指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果表明多態(tài)性g.24991651 A>G與RBC、MCV、MCHC、RDW_CV(P<0.05)等血氣指標(biāo)顯著相關(guān)，且AA基因型羊群RBC、MCHC、RDW_CV的所有表型測量值均明顯高于具有GA和GG基因型(P<0.05)的試驗羊群，而GA和GG基因型個體的MCV表型值差異不顯著。這些結(jié)果提供了綿羊血液學(xué)參數(shù)的參考信息，并確定了綿羊IL18基因作為改善綿羊育種計劃免疫性狀的候選基因的潛力。Zhao等[38]對341只湖羊和391只藏羊的HIF-1α基因的3個外顯子測序得到了3個SNP位點，并通過KASP技術(shù)對這3個SNP位點進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單倍型組合H2H3和H1H3在藏羊群體中更為常見，H2H3通過增加紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白濃度來增加攜氧能力；H1H3通過降低氧分壓和氧飽和度使O2更容易從氧合血紅蛋白離解。這些結(jié)果表明，HIF-1α基因的變異提高了藏羊的氧利用能力，這可能是藏羊在青藏高原生存和繁殖的基礎(chǔ)。王瓊等[39]基于前期挖掘到的3個與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的SNP位點，利用KASP技術(shù)對由不同產(chǎn)羔數(shù)組成的2個綿羊群體阿勒泰羊、吐魯番黑羊進(jìn)行檢測，并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，GUCY11A1基因g.43266624C>T位點與綿羊產(chǎn)羔數(shù)密切相關(guān)，可望作為顯著影響阿勒泰羊、吐魯番黑羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)的有效分子標(biāo)記。儲明星等[40]對山羊的RBP4基因5′調(diào)控區(qū)的36491960位點堿基G/C多態(tài)性進(jìn)行KASP分型檢測，將具有高產(chǎn)羔數(shù)性狀的CC基因型和較高產(chǎn)羔數(shù)的GC基因型個體選留下來，淘汰產(chǎn)羔數(shù)較低的GG基因型個體，從而提高山羊的繁殖力。此外，羊中的FSHR基因、FecB基因相關(guān)SNP位點也被研究者者通過KASP技術(shù)進(jìn)行相似研究與應(yīng)用[41-42]。Kusza等[43]使用KASP技術(shù)對羅馬尼亞飼養(yǎng)的法國阿爾卑斯山和薩南山羊的40個基因的48個SNP進(jìn)行了初步研究，還分析了13個多態(tài)性遺傳變異與羊奶產(chǎn)量和成分的關(guān)聯(lián)情況。該研究為山羊產(chǎn)業(yè)中SNP標(biāo)記輔助選擇育種的發(fā)展提供了新的見解，并證實了使用GHRHR、IL1RN、SOCS3和IL15RA基因的SNP位點作為分子育種標(biāo)記的潛力。

He等[44]對新疆驢4個關(guān)鍵性基因(LGALS2、NUMB、ADCY8和CA8)的15個SNP利用KASP技術(shù)進(jìn)行基因分型，并將成功分類的14個SNP與新疆驢產(chǎn)奶量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，NUMBg.46709914T>G與新疆驢早、中、后期日產(chǎn)奶量顯著相關(guān)，而ADCY8g.48366302T>C、CA8g.89567442T>G和CA8g.89598328T>A與后期泌乳顯著相關(guān)。因此，NUMBg.46709914T>G可以作為驢泌乳性狀候選基因的標(biāo)記，而ADCY8和CA8的SNP可作為后期泌乳候選基因標(biāo)記。該結(jié)果不僅有助于確認(rèn)驢產(chǎn)奶性狀的關(guān)鍵基因，而且為未來驢基因組的選擇提供了依據(jù)。

Schrimpf等[45]篩選了11匹馬的下一代全基因組測序數(shù)據(jù)，以期尋找與雄性生育有關(guān)的馬遺傳變異。對篩選得到的17個SNP，使用KASP技術(shù)對19個品種的337匹可育種馬進(jìn)行基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NOTCH(g.37455302G>A)變體鑒定為高影響SNP，對漢諾威種馬生育力有顯著影響。該種NOTCH突變體僅在許多不同品種的可育種馬中罕見地存在。因此，早期鑒定未經(jīng)選擇的年輕種馬的攜帶者，以提高種馬的繁殖力，對于優(yōu)質(zhì)種馬選育具有重要意義。Liu等[46]采用KASP技術(shù)對哈薩克斯坦馬中的NUMB、ADCY8、CA8、LGALS2、SLC25A30等5個基因中的13個SNP進(jìn)行遺傳多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)其中6個SNP位點具有多態(tài)性；只有2個SNP位點與哈薩克斯坦馬的產(chǎn)奶量顯著相關(guān)，該研究為選育日高產(chǎn)奶量的哈薩克斯坦馬提供了新的分子標(biāo)記。

2.3 標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種

傳統(tǒng)的育種方式通常是將群體中具有優(yōu)良性狀或目標(biāo)性狀的個體篩選出來，通過不斷繁育與再篩選最終培育出目標(biāo)品種。傳統(tǒng)育種不僅耗時、過程煩瑣，且效率低下?；贙ASP技術(shù)的靈活與高通量的優(yōu)勢，其被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)性狀種群選育、性別鑒定等標(biāo)記輔助選擇育種工作中，為育種工作提供了新的思路和方法，促進(jìn)了育種效果的提高和優(yōu)質(zhì)品種的培育。

在昆蟲中，孫成等[47]對野生地熊蜂(Bombusterrestris)和來自荷蘭科伯特公司的商業(yè)化地熊蜂進(jìn)行基因組重測序，利用生物信息學(xué)的方法，檢測到地熊峰參考基因組序列連鎖群LG B04(GenkBank編號：NC_015765.1)上的第2379545位堿基位點為SNP位點，在商業(yè)化地熊蜂中的基因型為TT，野生型地熊蜂的基因型為CC，利用KASP基因分型技術(shù)可以快速鑒別地熊蜂個體是野生型還是商業(yè)化型。該發(fā)現(xiàn)對于篩選易于室內(nèi)飼養(yǎng)、授粉能力強(qiáng)的育種材料以及進(jìn)行優(yōu)良雄峰品種的選育具有一定意義。

在水產(chǎn)中，丁君等[48]以刺參(Stichopusjaponicus)全基因組序列為參考，分別對母本中國遼寧莊河刺參和父本俄羅斯海參崴刺參進(jìn)行個體重測序，通過與對應(yīng)刺參參考基因組比對，獲得中、俄刺參群體SNP標(biāo)記位點。針對該刺參群體SNP標(biāo)記位點進(jìn)行KASP引物設(shè)計和基因分型。利用獲得的10個高質(zhì)量SNP標(biāo)記，通過KASP技術(shù)對不同批次中俄雜交刺參進(jìn)行檢測，該標(biāo)記在群體中檢出率和品種鑒別率均為100%，為雜交子代刺參或不同批次中俄雜交刺參的育種及鑒定提供了新的分子標(biāo)記。尹紹武等[49]利用KASP技術(shù)檢測瓦氏黃顙魚12連鎖群141cM位置基因68bp處的SNP位點基因型(GG/GA/AA)，而目前已有研究發(fā)現(xiàn)待測3種基因型的瓦氏黃顙魚低溶氧耐受性能力為GA>GG>AA，肥滿度大小為AA>GG>GA。為此，根據(jù)基因分型結(jié)果確定其低溶氧耐受性和肥滿度大小，可有效應(yīng)用于瓦氏黃顙魚的親本選育和分子標(biāo)記輔助育種。SONG等[50]在候選中華舌鰨生長相關(guān)基因中，對隨機(jī)選擇的9個極顯著SNP位點利用KASP技術(shù)對測序樣本進(jìn)行基因分型，其中8個位點的分型結(jié)果與測序結(jié)果一致，驗證了重測序結(jié)果的可靠性。郭金強(qiáng)[51]基于KASP技術(shù)對25對白梭吻鱸父母本與混養(yǎng)子代(共598尾)進(jìn)行基因分型，成功鑒定出25個家系的538個個體，鑒定率高達(dá)89.97%。通過建立家系，對家系后代的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行有目的的選擇和比較分析，并且分步篩選出生長快速家系和慢速家系，將有利于白梭吻鱸育種工作的進(jìn)一步進(jìn)行。丁君等[52]對刺參進(jìn)行基因組重測序，進(jìn)行篩選過濾與統(tǒng)計學(xué)分析，在50個分子標(biāo)記中，剔除掉多棘性狀基因型為雜合的標(biāo)記，篩選出檢出率最多的5個標(biāo)記。隨后將5個標(biāo)記在60只原批次刺參群體進(jìn)行檢測與驗證，結(jié)果顯示多棘刺參標(biāo)記覆蓋率為100%，多棘刺參每個樣品品種平均標(biāo)記為3.5個。按照上述方法，選擇攜帶至少3個多棘標(biāo)記(且不攜帶少棘標(biāo)記)的種參，進(jìn)行后續(xù)繁殖、育種，可快速培育多棘刺參新品種。呂建建等[53]經(jīng)過對三疣梭子蟹原始測序數(shù)據(jù)分析后，獲得了一種三疣梭子蟹耐副溶血弧菌的分子標(biāo)記C104，其特征在于C104第301位堿基為G/A，其中AA基因型為副溶血弧菌耐受型。據(jù)此利用KASP基因分型技術(shù)對三疣梭子蟹進(jìn)行篩選可以加快其耐副溶血弧菌優(yōu)良性狀選育的速度，促進(jìn)三疣梭子蟹良種培育進(jìn)程。該檢測方法不受生長階段的限制，有利于三疣梭子蟹的健康養(yǎng)殖及可持續(xù)發(fā)展，對于預(yù)防食物中毒也有重要意義。陸俊鍇等[54]提供了一種三疣梭子蟹性別鑒定標(biāo)記的SNP位點(PtS2)，分布在scaffold片段上的第878位的性別連鎖SNP位點，其堿基為T>C。該標(biāo)記在雄性個體中呈現(xiàn)等位基因雜合型，而在雌性個體中均呈現(xiàn)等位基因純合型。通過KASP技術(shù)對92只野生三疣梭子蟹基因分型，成功擴(kuò)增個體中分型正確率為100%，為三疣梭子蟹全雌苗種的繁育提供重要工具，具有重大的經(jīng)濟(jì)價值。

在牛當(dāng)中，顏澤等[55]利用KASP技術(shù)，對39頭牛樣本中3種不同類型無角基因的SNP位點同時進(jìn)行檢測。通過對采自國內(nèi)外不同牛品種的樣本檢測，并與PCR擴(kuò)增測序和凝膠電泳等傳統(tǒng)檢測方法的結(jié)果相對比，證明該KASP檢測方法可以對3種無角基因準(zhǔn)確分型，適于規(guī)模化檢測應(yīng)用。龐春英等[56]基于KASP技術(shù)針對河流型水牛的牛β酪蛋白(β-Casien)基因80位點和55位點堿基類型的不同，設(shè)計了6種KASP引物，分別對應(yīng)于SNP1和SNP4中的一種未突變基因型、兩種突變基因型；經(jīng)過PCR擴(kuò)增后檢測DNA樣品的熒光強(qiáng)度從而進(jìn)行基因分型。β-Casien常見AA、AB、BB 3種亞型，其在乳蛋白含量、乳脂肪含量、消化性能、抗氧化性能等方面各有優(yōu)劣。通過KASP分型方法可以快速篩選培育優(yōu)質(zhì)河流型水牛種牛，為發(fā)掘奶牛特色種質(zhì)資源和提升牛奶品質(zhì)提供便捷。研究發(fā)現(xiàn)，具有15枚胸椎和5枚腰椎(T15L5)性狀的金川多肋牦牛(Bosgrunniens)個體相較于正常個體(T14L5)其產(chǎn)奶量、產(chǎn)肉量、繁殖率，抗逆性均高于正常個體，且比一般牦牛提前一年投產(chǎn)，具有很高的生產(chǎn)效益[57-59]。趙睿驍[60]利用KASP技術(shù)將重測序篩選出的7個SNP分子標(biāo)記用于金川多肋牦牛進(jìn)行基因分型，其中6個SNP分子標(biāo)記檢測結(jié)果與基因測序結(jié)果100%一致，準(zhǔn)確度較高。該方法為金川多肋牦牛的優(yōu)質(zhì)育種與繁育提供了分子選擇依據(jù)。

在雞當(dāng)中，聶慶華等[61]發(fā)現(xiàn)雞基因組7號染色體第21948753位點發(fā)生G向T的的點突變，并對該SNP位點設(shè)計KASP引物，通過KASP基因分型技術(shù)，可以快速篩選絲羽烏骨雞中的雜合玫瑰冠基因型，高效剔除具有單冠等位基因的雜合子，保證其玫瑰冠穩(wěn)定遺傳。劉繼強(qiáng)[62]通過對固始雞、絲羽烏骨雞與海賽克斯A系雞青脛基因和黃(白)脛基因的核苷酸序列(Id基因)比對后設(shè)計引物，利用KASP技術(shù)對163只雞進(jìn)行基因分型，檢測到青脛基因純合子、青脛基因雜合子[表型為青黃(白)脛]、黃(白)脛基因純合子數(shù)量分別為77、65、21，與表型一致率達(dá)100%。目前已知的幾種基于PCR的方法可用于雞和其他鳥類的性別鑒定，但大多數(shù)仍成本高且耗時[63]。Dierks等[64]在雞CHD1基因中觀察到一個性別特異性等位基因[Z，NC_052572.1：g.51980364；W，NC_052571.1：g.5554096(反向)]，該等位基因似乎在鳥類中高度保守。在Z染色體的序列中檢測為G，在該位置的W染色體的相應(yīng)序列中檢測為A?；诖?，設(shè)計了合適的KASP體系引物，將KASP基因分析技術(shù)用于鳥類性別分析，且非常適合于雞、鴨、鵝、鵪鶉和火雞的大規(guī)模性別鑒定應(yīng)用。類似的，Bourgeois等[65]根據(jù)大象糞便中大腸桿菌的ZFX和ZFY基因序列的SNP位點差異，將KASP技術(shù)用于非洲草原象和森林象、亞洲象的性別鑒定。

3 展望

KASP技術(shù)作為一種高通量、高靈敏度、高效和低成本的分子標(biāo)記分型技術(shù)，在動物遺傳育種領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。然而，目前KASP技術(shù)還存在一些限制，如受到SNP位點前后堿基序列的限制，以及對KASPmastermix供應(yīng)的壟斷問題。未來的研究可以針對這些限制進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。

首先，可以進(jìn)一步改進(jìn)KASP技術(shù)的引物設(shè)計方法，以提高SNP位點的設(shè)計成功率。這可以通過引入更精確的算法和分析工具，結(jié)合更全面的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行引物設(shè)計。此外，可以利用高通量測序技術(shù)獲取更多的基因組數(shù)據(jù)，以便更準(zhǔn)確地預(yù)測SNP位點的存在和分布情況。其次，可以拓寬其研究領(lǐng)域，探索KASP技術(shù)在不同動物種群中的應(yīng)用潛力。雖然KASP技術(shù)應(yīng)用于動物領(lǐng)域中開始逐漸盛行，但大部分研究還是集中在植物方面。因此，可以進(jìn)一步延伸到更多的動物種類中，如家畜、家禽、野生動物、水產(chǎn)動物和昆蟲等。這將有助于豐富KASP技術(shù)在動物遺傳育種中的應(yīng)用領(lǐng)域，并為不同物種的育種工作提供更多的分子標(biāo)記輔助選擇手段。同時，應(yīng)繼續(xù)改進(jìn)KASP技術(shù)分型的操作流程和試驗條件，以提高其在實際應(yīng)用中的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。這包括優(yōu)化反應(yīng)體系的組成和反應(yīng)條件的控制，以確保分型結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。此外，可以探索更多的技術(shù)改進(jìn)和創(chuàng)新，以提高KASP技術(shù)的自動化程度和高通量性能，以滿足大規(guī)模育種項目的需求。最后，可以進(jìn)一步研究KASP技術(shù)與其他分子標(biāo)記分型技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用。不同的分子標(biāo)記技術(shù)各有優(yōu)勢，結(jié)合使用可以進(jìn)一步提高育種效果和準(zhǔn)確性。例如，可以結(jié)合KASP技術(shù)與全基因組測序、SNP芯片等技術(shù)，開展更深入的遺傳變異分析和基因組選擇研究。

總之，KASP技術(shù)在動物領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。通過改進(jìn)引物設(shè)計方法、拓展應(yīng)用物種范圍、優(yōu)化試驗流程和結(jié)合其他分子標(biāo)記技術(shù)，可以進(jìn)一步提高KASP技術(shù)的準(zhǔn)確性和高通量性能，為動物育種工作提供更多的選擇和支持。