基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動物實驗探究穿心蓮內(nèi)酯對5-Fu所致大鼠化療性腸黏膜炎的預(yù)防作用

邱雨馨，鄺杰輝，朱俊錦，林曼靜，邵艷華

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州市花都區(qū)天貴社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，廣東 廣州 510800）

目前，化療仍是治療實體腫瘤的首選手段，隨著腫瘤發(fā)病率不斷升高，化療的效果和副作用備受關(guān)注?；熜阅c黏膜炎（chemotherapeutic intestinal mucositis，CIM）是化療過程中頻發(fā)的副作用之一，是在腫瘤化療過程中導(dǎo)致的腸道炎性病變或者潰瘍性病變，表現(xiàn)為惡心、嘔吐、食欲減退、體重減輕和腹瀉等臨床癥狀[1]，不僅限制抗腫瘤藥物的應(yīng)用，而且影響化療進程。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）是化療最常用的藥物，5-Fu 化療引起的腸道黏膜炎發(fā)病率高達50%~80%[2]，其引起的腸黏膜炎可通過IL-6/STAT3 信號通道調(diào)控介導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化干預(yù)組織細(xì)胞的修復(fù)，其中IL-6 促炎癥細(xì)胞因子在IL-6/STAT3 信號通道中起著重要作用[3]，促炎細(xì)胞因子TNF-α能夠通過一些信號通路而誘導(dǎo)IL-6和IL-1 等因子的表達增加從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)[4]。穿心蓮內(nèi)酯是來源于中藥穿心蓮的二萜內(nèi)酯類化合物，具有良好的抗炎作用[5]，以穿心蓮內(nèi)酯制成的穿琥寧注射劑在臨床上廣泛用于治療腹瀉，有助于減輕炎癥反應(yīng)[6]。穿心蓮內(nèi)酯可減輕小鼠結(jié)腸炎或腹瀉引起的腸道損傷[7]，顯著緩解腫瘤小鼠結(jié)腸炎而不會降低其腫瘤抑制作用[8]，可調(diào)節(jié)p38 MAPK 通路進而抑制5-Fu導(dǎo)致的腸道細(xì)胞凋亡[9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強調(diào)從系統(tǒng)層次和生物網(wǎng)絡(luò)的整體角度出發(fā)，解析藥物及治療對象之間的分子關(guān)聯(lián)規(guī)律，被廣泛應(yīng)用于藥物和中藥活性化合物發(fā)現(xiàn)、整體作用機制闡釋等方面，為中藥復(fù)雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的科技支撐。本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討穿心蓮內(nèi)酯治療化療性腸黏膜炎的可能作用機制，同時通過構(gòu)建5-Fu 誘導(dǎo)大鼠腸黏膜炎模型，研究穿心蓮內(nèi)酯預(yù)防給藥對化療性腸黏膜炎模型鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)、腸組織病變以及血清炎癥因子水平的影響，明確穿心蓮內(nèi)酯對化療性腸炎的預(yù)防作用，為穿心蓮內(nèi)酯預(yù)防化療性腸黏膜炎的作用機制及臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)材料與方法

1.1 穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點的獲取

通過Pubchem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得穿心蓮內(nèi)酯的結(jié)構(gòu)信息，并從Swiss Target Prediction（http：//www. swisstarget prediction.ch/）、SuperPred（http：//prediction. charite.de/）、SEA（https：//sea.bkslab.org/）、STITCH（https：//ngdc.cncb.ac.cn/databasecommons/database/id/208）、Pharmmapper（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html）、HERB（http：//herb.ac.cn/）、HIT-2（http：//www.badd-cao.net：2345/）數(shù)據(jù)庫檢索獲得穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點。在UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將所得靶點名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 穿心蓮內(nèi)酯治療CIM潛在作用靶點的獲取

通過檢索Genecards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//www. omim.org/）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）、TTD（http：//www.db.idrblab.net/ttd/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）和DrugBank（https：//www.drugbank.ca/）6 個數(shù)據(jù)庫收集與CIM 相關(guān)的基因，在UniProt 數(shù)據(jù)庫將所得靶點名稱進行標(biāo)準(zhǔn)化。通過R語言編程軟件加載Venn程序包，將得到的CIM基因與穿心蓮內(nèi)酯的靶基因取交集，繪制Venn 圖，得到穿心蓮內(nèi)酯治療CIM的潛在靶點。

1.3 靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）的構(gòu)建和核心基因的獲取

使用STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//www.string-db.org/）和Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。將“1.2”項下獲取的潛在靶點輸入到STRING 數(shù)據(jù)庫中限定物種為人類，置信度為高置信度0.9，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape 3.9.1 軟件中的CytoNCA 插件，過濾條件設(shè)置中間中心性（betweenness centrality,BC）、度中心性（degree centrality, DC）、接近中心性（closeness centrality, CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality, EC）、局部連通性（local average connectivity-based method,LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality,NC）都大于中位值，篩選得到核心靶點，再將得到的核心靶點文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件，繪制核心靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 關(guān)鍵靶點的基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

將穿心蓮內(nèi)酯治療CIM 的潛在靶點通過R 語言編程軟件加載colorspace、stringi、ggplot2、org.Hs.eg.db 等程序包，設(shè)置P<0.05，進行GO 富集分析和KEGG通路分析。

1.5 分子對接

從RCSbPDB（http：// www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫獲得核心靶點的三維結(jié)構(gòu)，并用PyMOL 軟件去除蛋白質(zhì)中的配體小分子和水分子。用Chem3D軟件把穿心蓮內(nèi)酯轉(zhuǎn)換為三維結(jié)構(gòu)，并優(yōu)化空間構(gòu)象為最小值。通過AutoDock Tools 軟件將受體加氫，設(shè)置活性口袋，調(diào)整參數(shù)，使活性口袋包含受體。使用Vina 軟件進行對接，結(jié)合能≤-5 kcal/mol 表明結(jié)合活性較好。最后使用Discovery Studio 軟件對結(jié)果進行可視化處理。

2 動物實驗

2.1 儀器與試藥

BX60 熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；FA2104 電子天平（上海市安亭電子儀器廠）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；5-Fu（天津金耀藥業(yè)有限公司，批號2109081）；穿心蓮內(nèi)酯（成都埃法生物科技有限公司，批號AF20121551）；金雙歧三聯(lián)活菌片（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)有限公司，批號202109291）；大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA Kit［艾爾吉（廣州）生物科技有限公司，批號20220909］；大鼠白細(xì)胞介素（IL-6）ELISA Kit［艾爾吉（廣州）生物科技有限公司，批號20220909］；0.9% 生理鹽水（海博生物，批號HBPP008）。

2.2 實驗動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量190~210 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（遼）2020-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（24±2）℃，濕度（60±5）%，12 h 明暗周期輪替，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂食，自由進食和飲水。動物均飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)實驗動物中心，所有程序依據(jù)《實驗動物管理條例》實施，由廣東藥科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：gdpulac2020263）。

3 實驗方法

3.1 動物造模和給藥

將35 只健康雄性SD 大鼠隨機分成5 組，分別為空白組（Control）、模型組（MG）、陽性對照組（CG）、穿心蓮內(nèi)酯低劑量組（APL）、穿心蓮內(nèi)酯高劑量組（APH）5 個組別，每組7 只。從第1 天起，早上9：00分別給各組大鼠灌胃相應(yīng)的藥物，陽性對照組大鼠灌胃給予700 mg/kg 的金雙歧三聯(lián)活菌片溶液，穿心蓮內(nèi)酯低劑量組大鼠給予30 mg/kg 的穿心蓮內(nèi)酯，高劑量組大鼠給予100 mg/kg 的穿心蓮內(nèi)酯，空白組和模型對照組灌胃給予相應(yīng)體積的0.9%生理鹽水，在造模前給藥5 d，造模期間繼續(xù)給藥，連續(xù)給藥10 d。第6 天起，給藥1 h 后，除空白組外，分別給各組大鼠腹腔注射35 mg/kg 5-Fu 造模，空白組大鼠腹腔注射相應(yīng)體積的0.9%生理鹽水，連續(xù)5 d。

3.2 一般狀態(tài)和體質(zhì)量觀察

每天觀察各組大鼠的毛發(fā)光澤度、清潔度、顏色、活動情況、精神狀態(tài)及死亡等一般狀態(tài)；記錄大鼠體質(zhì)量，實驗結(jié)束后計算造模期間大鼠體質(zhì)量下降率。

體質(zhì)量下降率=（原體質(zhì)量-下降后的體質(zhì)量）/原體質(zhì)量×100%

3.3 腹瀉情況觀察

首次造模24 h 后，觀察大鼠腹瀉情況，以后每天定時觀察至實驗結(jié)束，最后一天藥物灌胃1 h 后觀察，腹瀉情況以腹瀉評分表示，評分越高表明腹瀉越嚴(yán)重。評分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[11]報道方法，對大便的狀態(tài)進行0~3分4級打分（表1）。

表1 大鼠的腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of diarrhea in rats

3.4 臟器指數(shù)

末次給藥后，對各組大鼠進行禁食不禁水12 h，眼眶采血，脫頸處死后剖開腹腔，取出肝臟、脾臟，用濾紙吸干液體，稱定質(zhì)量，計算肝臟和脾臟指數(shù)：

肝臟（脾臟）指數(shù)=100×肝臟（脾臟）質(zhì)量/體質(zhì)量。

3.5 腸道組織HE染色和病理形態(tài)學(xué)觀察

取距回腸末端2~3 cm 腸段，經(jīng)生理鹽水清洗后用濾紙去除水分后，放入4%多聚甲醛固定液中，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、組織水化、HE 染色等步驟后進行圖像采集及分析，對正常組織或有明顯病變的組織均采用數(shù)碼成像系統(tǒng)拍照記錄。

3.6 炎癥因子水平檢測

眼眶取血3 mL左右，以3 000 r/min離心10 min，收集血清，在-4 ℃下保存。采用ELISA法檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α水平。

3.7 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件分析，GraphPad Prism 9 軟件統(tǒng)計作圖，實驗數(shù)據(jù)用表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 穿心蓮內(nèi)酯靶點篩選及其治療CIM的交集靶點

通過Unipot 數(shù)據(jù)庫進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，取并集、去重后，得到521 個穿心蓮內(nèi)酯潛在作用靶點。利用Genecards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫分別收集CIM相關(guān)的疾病靶點，經(jīng)合并去重后獲得相關(guān)的疾病靶點3 104 個。與穿心蓮內(nèi)酯對應(yīng)的靶點基因取交集，獲得190 個共同基因靶點，為穿心蓮內(nèi)酯治療CIM 的關(guān)鍵靶點。利用R語言編程軟件繪制Venn圖，見圖1。

4.2 穿心蓮內(nèi)酯治療CIM的核心靶點分析

將190 個共同靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，去除孤立的節(jié)點，導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)（圖2）。利用Cytoscape 3.9.1 軟件分析PPI 網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)，根據(jù)靶點的degree 值正相關(guān)設(shè)置節(jié)點顏色（degree 值由小到大對應(yīng)節(jié)點顏色由淺粉色到深紅色）。degree 值大即表示該靶點處于網(wǎng)絡(luò)的核心地位。通過加載插件CytoNCA，計算每個節(jié)點的打分，然后利用R語言編程軟件對打分進行篩選，根據(jù)DC≥5.0、EC≥0.024、LAC≥1.6、BC≥23.76、CC≥0.051和NC≥2.067（中位數(shù)）等拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)條件初步篩選出48個節(jié)點，最后將得到打分高于中位數(shù)的節(jié)點重新導(dǎo)入Cytoscape 再篩選1 次，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)核心，篩選出20 個穿心蓮內(nèi)酯治療CIM 的核心靶點（圖2）。以圖表形式顯示20個核心靶點的拓?fù)鋵W(xué)分析參數(shù)，見表2，包括有STAT3、TNF和IL6等與炎癥相關(guān)的靶點，這表明穿心蓮內(nèi)酯可能通過作用于這些靶點治療CIM。

圖2 穿心蓮內(nèi)酯治療CIM的核心靶點分析Figure 2 Analysis of core target of andrographolide in the treatment of CIM

表2 核心靶點的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)分析Table 2 Topological parameter analysis of core target

4.3 GO功能富集分析與KEGG通路分析

GO 富集分析得到生物學(xué)過程（BP）相關(guān)條目2 315 條、分子功能（MF）相關(guān)條目184 條及細(xì)胞組分（CC）相關(guān)條目101 條（P<0.05）。從結(jié)果可看出（圖3），穿心蓮內(nèi)酯治療CIM 的BP主要富集在對氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）、MAPK 級聯(lián)的正調(diào)控（positive regulation of MAPK cascade）和細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）等方面，MF 主要富集在膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）和轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物、轉(zhuǎn)移含磷基團（transferase complex，transferring phosphorus-containing groups）等方面，CC 主要富集在蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）和蛋白絲氨酸激酶活性（protein serine kinase activity）等方面。通過KEGG 信號通路分析，共富集得到177 條相關(guān)信號通路（P<0.05）。其中相關(guān)度較高的前30條通路，主要包括HIF-1、TNF、Toll 樣受體和T 細(xì)胞受體等與炎癥密切相關(guān)的信號通路，提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過作用以上多條通路來發(fā)揮治療CIM的作用。

圖3 穿心蓮內(nèi)酯治療CIM的基因富集分析Figure 3 Gene enrichment analysis of andrographolide in the treatment of CIM

4.4 穿心蓮內(nèi)酯–核心靶點分子對接

選取和炎癥相關(guān)的核心靶點IL-6、TNF 和STAT3，與穿心蓮內(nèi)酯進行分子對接獲得三維圖（圖4），穿心蓮內(nèi)酯與IL-6、TNF 和STAT3 對接的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol（表3），說明穿心蓮內(nèi)酯與靶點之間具有良好對接活性，氫鍵是相互作用的主要形式。其中，穿心蓮內(nèi)酯與IL-6 的氨基酸殘基THR139、ASN145、GLN103、GLN117 和GLU96 分別形成了2.64 ?、2.22 ?、2.49 ?、2.78 ?、2.26 ? 和2.26 ? 的氫鍵相互作用；與TNF 的氨基酸殘基GLU104 形成2.30 ? 的氫鍵相互作用；與STAT3 的氨基酸殘基PRO256 形成2.25 ? 的氫鍵相互作用（圖5）。綜上，穿心蓮內(nèi)酯和IL6、TNF 和STAT3 的相互作用以氫鍵為主，且主要通過氫鍵作用鎖定結(jié)合取向。

圖4 穿心蓮內(nèi)酯與IL-6、TNF和STAT3對接三維圖Figure 4 Three-dimensional diagram of andrographolide docking with IL-6，TNF and STAT3

圖5 穿心蓮內(nèi)酯與IL6、TNF和STAT3對接二維圖Figure 5 Two-dimensional diagram of andrographolide docking with IL6，TNF and STAT3

表3 穿心蓮內(nèi)酯-核心靶點分子對接結(jié)合能Table 3 Docking binding energy of andrographolide-core target molecule

4.5 穿心蓮內(nèi)酯對大鼠一般狀態(tài)和體質(zhì)量的影響

在實驗期間，空白組大鼠反應(yīng)靈敏，毛發(fā)有光澤，飲食和活動都正常。腹腔注射5-Fu 后，模型組大鼠呈現(xiàn)腹瀉、進食減少、體質(zhì)量下降、毛發(fā)無華、動作遲鈍及精神頹靡等狀態(tài)。穿心蓮內(nèi)酯低劑量組大鼠和模型組狀態(tài)相近，高劑量組和陽性對照組均有不同程度的改善，給藥過程無動物死亡。

體質(zhì)量是評價大鼠健康情況的重要指標(biāo)。本研究中空白組大鼠的體質(zhì)量呈現(xiàn)不斷上升狀態(tài)，其他各組大鼠體質(zhì)量在給予5-Fu 后均有不同程度下降（圖6），模型組大鼠體質(zhì)量下降率為（11.37±1.53）%，陽性對照組體質(zhì)量下降率為（8.10±0.92）%（P<0.05），穿心蓮內(nèi)酯低劑量組體質(zhì)量下降率為（9.68±1.49）%，穿心蓮內(nèi)酯高劑量組體質(zhì)量下降率為（7.20±1.73）%（P<0.01），結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯高劑量組的大鼠體質(zhì)量下降情況得到明顯緩解。

圖6 穿心蓮內(nèi)酯對各組大鼠體質(zhì)量的影響Figure 6 Effect of andrographolide on rat body mass in each group(,n=7)

4.6 穿心蓮內(nèi)酯對大鼠腹瀉情況的影響

腹腔注射5-Fu 后第1 天到第6 天的腹瀉情況如圖7所示，空白組大鼠整個過程都無腹瀉發(fā)生，模型組大鼠從造模24 h 后開始出現(xiàn)腹瀉情況，大便狀態(tài)從干便變成濕便，第6天時，個別大鼠出現(xiàn)水樣便和明顯的肛周著色，腹瀉情況顯著（P<0.05）。相較于模型組，穿心蓮內(nèi)酯給藥組展現(xiàn)出不同程度的腹瀉癥狀改善，陽性對照組和穿心蓮內(nèi)酯高劑量組在第6天腹瀉癥狀減輕，腹瀉評分明顯下降（P<0.05），此外，在解剖時觀察到陽性對照組和穿心蓮內(nèi)酯高劑量組大鼠腸道中仍有明顯成型的糞便，說明穿心蓮內(nèi)酯能改善化療所致的腹瀉癥狀，起到預(yù)防保護作用。

圖7 穿心蓮內(nèi)酯對大鼠腹瀉情況的影響Figure 7 Effect of andrographolide on diarrhea in rats（，n=7）

4.7 穿心蓮內(nèi)酯對大鼠免疫能力的影響

結(jié)果如表4 所示，模型組大鼠的肝臟指數(shù)較空白組明顯下降，脾臟指數(shù)亦明顯下降。給予穿心蓮內(nèi)酯服用后，其肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)均有好轉(zhuǎn)，高劑量穿心蓮內(nèi)酯組大鼠的肝臟指數(shù)為39.24±4.45，與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯對化療所致腸黏膜炎的大鼠肝臟和脾臟損害具有一定緩解作用。

表4 各組大鼠的臟器指數(shù)Table 4 Organ index of rats in each group（，n=7）

表4 各組大鼠的臟器指數(shù)Table 4 Organ index of rats in each group（，n=7）

與空白組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。

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4.8 穿心蓮內(nèi)酯對大鼠回腸組織的影響

各組大鼠小腸組織病理形態(tài)變化如圖8 所示，空白組大鼠小腸組織結(jié)構(gòu)正常，腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，腸腺清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，隱窩結(jié)構(gòu)保持完整且排列規(guī)則；與空白組相比，模型組大鼠腸絨毛萎縮甚至脫落，上皮細(xì)胞有空泡形成，隱窩結(jié)構(gòu)破壞，隱窩深度增加，絨毛高度減小，炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重；與模型組相比，各給藥組腸上皮細(xì)胞和隱窩的形狀結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同程度的改善，陽性對照組和穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組大鼠小腸上皮細(xì)胞形態(tài)相對完整，腸絨毛高度增加，隱窩深度減小，表明穿心蓮內(nèi)酯對5-Fu 所致化療性腸黏膜炎大鼠小腸病理損傷有一定的保護作用。

圖8 大鼠回腸組織病理切片（40×）Figure 8 Pathological sections of rat ileum tissue（40×）

4.9 穿心蓮內(nèi)酯對血清中炎癥因子水平的影響

如圖9 所示，模型組大鼠血清中IL-6 和TNF-α水平明顯高于空白組，陽性對照組和穿心蓮內(nèi)酯高、低劑量組大鼠血清中IL-6 和TNF-α水平較模型組均顯著下降（P<0.05）。

圖9 穿心蓮內(nèi)酯對大鼠血清中IL-6和TNF-α含量的影響Figure 9 Effect of andrographolide on the content of IL-6 and TNF-α in rat serum（，n=7）

5 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測穿心蓮內(nèi)酯治療5-Fu 誘導(dǎo)的大鼠化療性腸黏膜炎的靶點，PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果表明，IL-6、TNF 和STAT3 等20 個核心靶點可能是其治療化療性腸黏膜炎的關(guān)鍵作用靶點。TNF 是一種重要的參與全身炎癥的細(xì)胞信號蛋白，在協(xié)調(diào)炎癥免疫反應(yīng)中起著核心作用，可促使其他炎癥因子（如IL-6、IL-1、IL-8 等）的產(chǎn)生[10-11]。IL-6可通過IL-6/STAT3 信號途徑誘導(dǎo)STAT3 磷酸化，而STAT3 自身則誘導(dǎo)抗凋亡因子bcl-xl 和bcl-2，進而誘導(dǎo)T 細(xì)胞抗凋亡，T 細(xì)胞抗凋亡所累積的循環(huán)作用則會導(dǎo)致慢性炎癥[12-13]，因此，穿心蓮內(nèi)酯可能通過抑制TNF、IL-6 和STAT3 的表達發(fā)揮抗炎作用。KEGG 和GO 富集分析結(jié)果表明，穿心蓮內(nèi)酯抗化療性腸黏膜炎的機制主要與炎癥和凋亡相關(guān)的信號通路和生物學(xué)過程有關(guān)，如HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、T 細(xì)胞受體信號通路、氧化應(yīng)激反應(yīng)、MAPK 級聯(lián)的正調(diào)控和細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等生物過程。分子對接的結(jié)果顯示，穿心蓮內(nèi)酯與IL-6、TNF 和STAT3 對接的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol，說明穿心蓮內(nèi)酯與IL-6、TNF 和STAT3 均能較好地結(jié)合，從而減輕機體的炎癥反應(yīng)。

為進一步驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果，本研究通過5-Fu 誘導(dǎo)大鼠化療性腸黏膜炎體內(nèi)模型考察穿心蓮內(nèi)酯的作用及其對炎癥因子的影響。動物實驗表明，穿心蓮內(nèi)酯能夠較好地改善5-Fu 誘導(dǎo)的大鼠化療性腸黏膜炎，顯著改善大鼠體質(zhì)量、腹瀉情況和病理組織損傷，增加肝臟和脾臟指數(shù)，降低血清中促炎因子水平，此結(jié)果與文獻報道穿心蓮內(nèi)酯可作用于p38 MAPK 信號通路改善化療性腸炎是一致的[9]。在穿心蓮內(nèi)酯治療大鼠膿毒癥研究中發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯抗炎機制和NF-κB 信號通路相關(guān)聯(lián)，穿心蓮內(nèi)酯可通過抑制NF-κB 信號通路從而阻斷炎癥因子如IL-6 的產(chǎn)生[14]。本研究中，穿心蓮內(nèi)酯可以明顯降低大鼠血清中的IL-6、TNF-α炎癥因子水平，緩解腸黏膜損傷，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的靶點預(yù)測和KEGG 通路富集分析結(jié)果一致。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，并結(jié)合動物實驗，發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可能通過作用于IL6、TNF 等核心靶點減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮治療化療性腸黏膜炎的作用，具體的作用機制有待進一步研究。