雞矢藤醇提物聯(lián)合抗生素對MRSA的體外抑菌效果研究

蒲俏虹，陳至里，楊彤，周瑩，張少俊，林淑健，劉劼，黃心照，彭拓華

（廣東省生物制品與藥物研究所，廣東 廣州 510440）

耐藥菌感染已成為醫(yī)療機(jī)構(gòu)面臨的一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，嚴(yán)重威脅人類健康。其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是臨床上常見的耐藥菌，全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)及CHINET的監(jiān)測資料顯示多重耐藥菌MRSA 的感染率在50%以上，且ICU、燒傷病房中，感染有加重的趨勢[1-2]。由于MRSA 具有多重耐藥性，臨床中面臨治療難度高、死亡率高等困難，因此成為世界范圍內(nèi)耐藥性檢測的重點(diǎn)對象[3]。目前，臨床上可用于治療MRSA 的藥物非常有限，一線藥物主要有萬古霉素、替考拉寧和去甲萬古霉素等抗生素，而這些藥物價(jià)格昂貴，且具有耳毒性和腎毒性大等缺點(diǎn)，臨床用藥時(shí)需謹(jǐn)慎選擇[4-5]。因此，開發(fā)更多經(jīng)濟(jì)有效的抗MRSA 藥物是目前迫切需要解決的問題。近年來，已發(fā)現(xiàn)多種中藥及相關(guān)活性成分具有顯著抗耐藥菌作用[6-9]，從中藥中開發(fā)抗菌藥物將形成一個(gè)新的研究領(lǐng)域。

雞矢藤性平，味甘、微苦，具有祛風(fēng)利濕、止痛解毒、活血消腫的功效及鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用，臨床上多用于多種疼痛和胃腸道疾病的治療，除此之外，還可用于帶狀皰疹、結(jié)核、癰瘡腫毒和蛇蟲咬傷等疾病的治療，具有很高的藥用價(jià)值[10-13]。已有研究報(bào)道雞矢藤對金黃色葡萄球菌有抑制作用[14]。為了探討雞矢藤醇提物是否對MRSA 有抑菌作用，以及評估雞矢藤醇提物與抗生素聯(lián)用是否具有增強(qiáng)抗生素的抑菌效果，本文通過牛津杯法、微量稀釋法評價(jià)雞矢藤醇提物對MRSA 的抑菌效果，并通過微量棋盤法探究雞矢藤醇提物是否可與常用抗生素產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用，為雞矢藤的抗耐藥菌應(yīng)用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 藥物及樣品

1.1.1 中藥材 雞矢藤Paederia scandens（Lour.）Merr購于佛山市中天中藥飲片有限公司，由廣東省生物制品與藥物研究所彭拓華主任中藥師鑒定為正品。

1.1.2 樣品 稱取100 g 雞矢藤藥材粉末（過2 號篩），加入10 倍體積60% 乙醇，45 ℃超聲提取90 min，期間攪拌多次；過濾后棄去濾渣，濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后加水定容至100 mL，制成質(zhì)量濃度為1 g/mL 的提取物，過濾除菌后-30 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 抗生素 鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（海力健，批號80120051202）；硫酸多黏菌數(shù)B（Aladdin，批號J2126657）；左氧氟沙星（Aladdin，批號J2122423）；硫酸慶大霉素（Aladdin，批號H2106059）；萬古霉素（Aladdin，批號H2125431）；氨芐青霉素（Aladdin，批號E2011092）。

抗生素前期處理：取適量的左氧氟沙星和氨芐青霉素，分別采用生理鹽水稀釋混勻至終質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的工作液。取適量的萬古霉素，采用生理鹽水稀釋混勻至終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 的工作液。取適量慶大霉素，采用生理鹽水稀釋混勻至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的工作液。取適量多黏菌數(shù)B，采用生理鹽水稀釋混勻至終質(zhì)量濃度為10 mg/mL的工作液。

1.2 菌株

1.2.1 試驗(yàn)菌株 56 株MRSA 臨床分離株由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院饋贈。上述菌株由該醫(yī)院2020 年1－12 月從患者送檢的各種標(biāo)本中分離所得（排除污染和同一患者相同部位多次分離的菌株），并經(jīng)VITEK 2 Compact檢定。

1.2.2 質(zhì)控菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923（環(huán)凱生物，批號：G0070 DX）；MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300（廣東省微生物菌種保藏中心，批號：20221109）。

1.3 試劑

MH瓊脂（環(huán)凱生物，20220723）；MH肉湯培養(yǎng)基（環(huán)凱生物，20220804）；TTC（環(huán)凱生物，220320P10）；鹽酸左氧氟沙星氯化鈉注射液（海力健，批號80120051202）。按照說明書的要求配置MH瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH 值至7.2±0.1，121 ℃15 min高壓滅菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 主要儀器

SQP 電子天平（Sartorius，德國）；Heratherm IGS400 恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；HeraSafe KS15 生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，美國）；Nano Quant 酶標(biāo)儀（TECAN，瑞典）；SQ510 C 高壓蒸汽滅菌鍋（YAMATO，日本）；GD-100-P-5 恒溫水浴箱（Grant，美國）；Densicheck Plus 麥?zhǔn)蠞岫葍x（Mérieux，法國）；Centrifuge 5810 R低溫離心機(jī)（Eppendorf，德國）；HZQ-X300 C 恒溫振蕩器（Blue Pard，中國）。

2 方法

2.1 菌株的活化和菌液的制備

無菌條件下分別將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923、MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300 以及56株MRSA 臨床菌株接種于MH 肉湯培養(yǎng)基中，于恒溫空氣浴振蕩培養(yǎng)箱中以37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。將上述菌液在MH瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑單克隆菌落于MH 肉湯培養(yǎng)基中，以37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，完成菌種的活化?；罨蟮木阂? 000 r/min離心5 min，棄掉上清，無菌水重懸后，用麥?zhǔn)蠞岫葍x測定菌液濃度，再用滅菌的MH 肉湯培養(yǎng)基稀釋菌液至1×106CFU/mL，作為實(shí)驗(yàn)菌液。

2.2 牛津杯法檢測抑菌作用

參照文獻(xiàn)[15]方法，于生物安全柜內(nèi)將已滅菌的MH瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，待其凝固。此外，待MH 瓊脂培養(yǎng)基冷卻至45 ℃左右混入相應(yīng)實(shí)驗(yàn)菌液100 μL，混合均勻后準(zhǔn)確分取混菌培養(yǎng)基5.0 mL完全覆蓋在已凝固的培養(yǎng)基上并保證其表面光滑，等待凝固。取已高壓滅菌的牛津杯置于培養(yǎng)基表面，在杯中加入不同濃度的雞矢藤醇提物，以滅菌雙蒸水作陰性對照，左氧氟沙星工作液為陽性對照，將平板置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)過夜，將平板取出后，采用“十字交叉法”測定抑菌圈直徑，拍照后記錄相關(guān)結(jié)果，以抑菌環(huán)直徑>7 mm 判斷為有抑菌作用。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）的測定

參照文獻(xiàn)[16]方法，無菌條件下采用倍比稀釋法將雞矢藤醇提物以及5 種抗生素（多黏菌數(shù)B、左氧氟沙星、慶大霉素、氨芐青霉素、萬古霉素）進(jìn)行稀釋，從1∶2 倍比稀釋至1∶64。倍比稀釋后對應(yīng)的雞矢藤醇提物質(zhì)量濃度分別為500、250、125、62.5和31.25 mg/mL。分別在96 孔板中先后加入100 μL 不同濃度的稀釋藥液以及抗生素，然后加入1×106CFU/mL MRSA 菌懸液100 μL，每個(gè)濃度設(shè)1 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)作空白對照，于37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，每孔加入0.5%TTC 繼續(xù)培養(yǎng)2 h，觀察受試菌的生長情況（觀察有無變紅色），以無菌生長（無紅色）的最低稀釋度為MIC，試驗(yàn)重復(fù)3次。測出MIC后，再依次從無細(xì)菌生長的各孔中吸取100 μL 培養(yǎng)物分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板，置于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃下培養(yǎng)18~24 h，平板上生長的菌落數(shù)<5 個(gè)對應(yīng)的藥液濃度為MBC。

2.4 雞矢藤醇提物對MRSA生長曲線的影響

參考文獻(xiàn)[17]方法，稍作修改。將MRSA 活化后用生理鹽水配制成0.5 個(gè)麥?zhǔn)蠞岫葌溆?。?shí)驗(yàn)分為陽性對照組（僅加菌液不加藥液）、雞矢藤醇提物（含1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC 及2×MIC）組。以不加菌液僅加相同濃度藥液的為陰性對照組，用于消減藥物顏色干擾。在含MH 液體培養(yǎng)液中分別加入1%菌液量和對應(yīng)藥液，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，每2 小時(shí)無菌取樣1 次，用酶標(biāo)儀測定600 nm 波長的吸光度（A）值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次。其中實(shí)驗(yàn)組A600為實(shí)驗(yàn)處理組與同濃度同時(shí)段陰性組的吸光度之差，取2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。以t為橫坐標(biāo)（X），A600為縱坐標(biāo)（Y），繪制MRSA 生長曲線，分析不同濃度雞矢藤醇提物對MRSA生長的影響。

2.5 微量棋盤法測定聯(lián)合用藥的抑菌效果

參照文獻(xiàn)[18]方法，根據(jù)雞矢藤醇提物和5種常用抗生素的MIC結(jié)果，采用倍比稀釋法分別稀釋使其終濃度分別1/32MIC～4MIC。采用微量棋盤稀釋法測定雞矢藤醇提物分別與抗生素（多黏菌數(shù)B、左氧氟沙星、慶大霉素、氨芐青霉素和萬古霉素）聯(lián)用的MIC，分析其部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC），實(shí)驗(yàn)全程在無菌條件下操作，并重復(fù)3 次。FIC 指數(shù)=聯(lián)合用藥時(shí)甲藥MIC/單獨(dú)應(yīng)用甲藥時(shí)MIC+聯(lián)合應(yīng)用乙藥時(shí)MIC/單獨(dú)應(yīng)用乙藥時(shí)MIC。判斷標(biāo)準(zhǔn)：FIC 指數(shù)≤0.5 為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用[2]。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并制作統(tǒng)計(jì)圖，采用兩獨(dú)立樣本非配對t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 牛津杯法檢測抑菌試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，雞矢藤醇提物對ATCC25923、ATCC43300 及其中30 株MRSA 臨床株均具有不同程度的抑菌活性（抑菌環(huán)直徑>7 mm），對MRSA 臨床株抑菌率占53.57%（30/56），見圖1及表1。由圖1可見，雞矢藤醇提物濃度為500 mg/mL和250 mg/mL時(shí)均能表現(xiàn)出顯著的抗菌活性，且MRSA 對不同濃度的雞矢藤醇提物的敏感性呈一定的濃度依賴關(guān)系。結(jié)果表明雞矢藤醇提物對MRSA 具有一定的抑菌作用。

表1 雞矢藤醇提物的MRSA臨床株抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Paederia scandens ethanol extract on MRSA clinical strains

圖1 牛津杯法抑菌試驗(yàn)結(jié)果圖Figure 1 Antibacterial results determined with oxford cup method

3.2 雞矢藤醇提物對MRSA的MIC

微量稀釋法結(jié)果顯示，雞矢藤醇提物對金黃色葡萄球菌ATCC25923 和MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC43300的MIC 均為125.0 mg/mL，MBC 均為500.0 mg/mL，對MRSA 臨床分離株的MIC 為62.5~250.0 mg/mL，MBC為250.0~500.0 mg/mL，見表2。

表2 雞矢藤醇提物抗MRSA的MIC和MBC測定結(jié)果Table 2 MIC and MBC of Paederia scandens ethanol extract against MRSA

3.3 雞矢藤醇提物對MRSA生長的影響

雞矢藤醇提物對MRSA生長抑制曲線如圖2所示，試驗(yàn)菌株為MRSA 臨床株M3。與無藥物處理對照組相比，1/4×MIC、1/2×MIC、1×MIC 和2×MIC 濃度雞矢藤醇提物組的細(xì)菌均出現(xiàn)了不同程度的抑制生長趨勢，細(xì)菌溶液的吸光度顯著降低，且雞矢藤醇提物濃度越高對細(xì)菌生長的影響越大。從生長曲線的變化來看，雞矢藤醇提物縮短MRSA的對數(shù)生長期，延長生長停滯期，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量明顯減少。結(jié)果表明，雞矢藤醇提物對MRSA 的正常生長和繁殖具有抑制作用，且抑制作用的強(qiáng)弱與雞矢藤醇提物濃度呈正相關(guān)。

圖2 雞矢藤醇提物抗MRSA的動態(tài)抑菌曲線（n=3）Figure 2 Dynamic antibacterial curve of Paederia scandens ethanol extract against MRSA（n=3）

3.4 雞矢藤醇提物與抗生素聯(lián)合用藥的抑菌作用

通過棋盤法測定雞矢藤醇提物與不同抗生素之間的聯(lián)合用藥抑菌效果，結(jié)果如表3所示，雞矢藤醇提物可顯著提高慶大霉素（FIC=0.375）對ATCC43300 的抑菌作用，聯(lián)合使用呈現(xiàn)出協(xié)同效果。此外，一定程度上提高左氧氟沙星（FIC=0.625）、氨芐青霉素（FIC=0.531）和萬古霉素（FIC=0.531）對ATCC43300 的抑菌作用，聯(lián)用呈相加作用，與多黏菌數(shù)B 聯(lián)用對ATCC43300 呈無關(guān)作用。另外，雞矢藤醇提物聯(lián)用多黏菌數(shù)B（FIC=0.625）、氨芐青霉素（FIC=1.0）、左氧氟沙星（FIC=0.531）和慶大霉素（FIC=0.75）對MRSA 臨床菌株M3 呈相加作用，而與萬古霉素聯(lián)用對MRSA 臨床菌株呈無關(guān)作用，且聯(lián)合左氧氟沙星（FIC=1.0）、慶大霉素（FIC=0.625）和萬古霉素（FIC=0.516）對金黃色葡萄球菌ATCC25923均有相加的抑菌作用。

表3 雞矢藤醇提物與抗生素聯(lián)用對MRSA的FICTable 3 FIC of Paederia scandens ethanol extract in combination with antibiotics against MRSA

4 討論

由于抗生素的濫用，MRSA 在臨床的檢出率越來越高，尋求解決耐藥新方法迫在眉睫。目前新抗生素的研發(fā)陷入瓶頸，因此拓寬抗菌藥物的來源渠道是一條重要舉措。中藥具有多功能、多靶點(diǎn)作用、不易產(chǎn)生耐藥性、不良反應(yīng)低以及與抗生素聯(lián)用可逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性等優(yōu)點(diǎn)。因此，從中藥尋求抗MRSA的新資源為臨床治療MRSA提供了新思路。

雞矢藤含有豐富的環(huán)烯醚萜苷類成分，可健胃利膽，亦具有降糖、抗菌、消炎、抗癌等多種活性。已有研究[20]報(bào)道雞矢藤對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，MIC 為62.5 mg/mL。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了雞矢藤醇提物的抗菌活性研究，牛津杯抑菌試驗(yàn)和微量稀釋法結(jié)果顯示雞矢藤醇提物對金黃色葡萄球菌ATCC25923 具有抑菌作用，MIC 為125.0 mg/mL，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的抑菌效果，原因可能與不同的提取工藝相關(guān)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中雞矢藤醇提物還對MRSA 臨床分離株均表現(xiàn)出一定的抑菌和殺菌活性，MIC 為62.5~250.0 mg/mL，MBC 為250.0~500.0 mg/mL。此外，動態(tài)抑菌試驗(yàn)中加入不同濃度雞矢藤醇提物后MRSA 菌體生長曲線發(fā)生明顯變化，與正常的金黃色葡萄球菌生長曲線相比，加藥組細(xì)菌經(jīng)歷比對照組稍長的延遲期，進(jìn)入對數(shù)期生長后，細(xì)菌數(shù)量增加幅度緩慢，至穩(wěn)定期時(shí)菌量比對照組明顯減少。由于金黃色葡萄球菌在生長繁殖期，處于對數(shù)期生長時(shí)細(xì)菌的繁殖速度最快，代謝等方面表現(xiàn)最為旺盛，并且對外界各種環(huán)境因素的影響表現(xiàn)也最為敏感。本實(shí)驗(yàn)表明雞矢藤醇提物能通過抑制MRSA對數(shù)生長期的增殖而發(fā)揮抗MRSA作用。

另外，本實(shí)驗(yàn)中微量棋盤法結(jié)果顯示，雞矢藤醇提物與慶大霉素聯(lián)合用藥可協(xié)同抗MRSA 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300，顯著降低慶大霉素的MIC，增加ATCC43300 對慶大霉素的敏感性，還能一定程度提高對金黃色葡萄球菌ATCC25923 和MRSA 臨床株的抑菌作用，聯(lián)用呈現(xiàn)出相加作用，但具體的協(xié)同、相加作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。慶大霉素是氨基糖苷類抗生素，可通過與細(xì)菌核糖體30 S亞基結(jié)合，阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)合成從而發(fā)揮抗菌作用，具有較強(qiáng)的耳、腎毒性[21]。雞矢藤醇提物協(xié)同慶大霉素抑制ATCC43300，能夠有效減少慶大霉素的用量，降低其毒副反應(yīng)。且迄今為止，雞矢藤醇提物提高氨基糖苷類抗生素對金葡菌的抗菌作用均未見報(bào)道。因此，雞矢藤醇提物作為慶大霉素增效劑具有潛在的開發(fā)價(jià)值。此外，雞矢藤醇提物聯(lián)合多黏菌數(shù)B、氨芐青霉素、左氧氟沙星對MRSA 臨床菌株，聯(lián)合氨芐青霉素、左氧氟沙星和萬古霉素對MRSA 標(biāo)準(zhǔn)株ATCC43300 以及聯(lián)合左氧氟沙星和萬古霉素對金黃色葡萄球ATCC25923均表現(xiàn)為相加作用，顯示出一定的抑菌效果以及聯(lián)合用藥有效性，且結(jié)果中聯(lián)合用藥均未出現(xiàn)拮抗作用，說明雞矢藤醇提物與以上抗生素配伍使用可行。以上結(jié)果均提示雞矢藤醇提物的天然抗菌成分可能為解決抗生素耐藥菌問題開辟新的領(lǐng)域。

中藥是我國醫(yī)學(xué)的寶貴遺產(chǎn)，不易產(chǎn)生耐藥[22]，且有研究發(fā)現(xiàn)其能逆轉(zhuǎn)抗生素耐藥性恢復(fù)耐藥菌對抗生素的敏感性[23-24]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雞矢藤醇提物具有抗MRSA作用，但研究所用藥物為雞矢藤醇提物，具體的有效成分及其抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步研究。