紅花黃色素與牛血清蛋白的相互作用研究

劉萍，郭嘉鑫，劉中天

（商洛學(xué)院化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院/陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/陜西省礦產(chǎn)資源清潔高效轉(zhuǎn)化與新材料工程研究中心，陜西商洛 726000）

牛血清蛋白（Bovine serum albumin，簡(jiǎn)稱BSA）為淡黃色晶體顆粒，易溶于水。在蛋白質(zhì)與藥物的相互作用研究中，牛血清蛋白是常用的蛋白質(zhì)選取對(duì)象。BSA是牛血清中的一種球蛋白，與人血清蛋白（HSA）具有相類似的氨基酸組成和排列順序。由于牛血清蛋白在結(jié)構(gòu)上與人血清蛋白高度近似，本身又結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、容易獲取且價(jià)格低廉，因此常被用作HSA的替代品。藥物一直與人類生活密切相關(guān)，從藥物進(jìn)入人體到起效，要經(jīng)歷釋放、與靶點(diǎn)相互作用和代謝三個(gè)過程。藥物在體內(nèi)的吸收和代謝情況，會(huì)直接影響藥物在目標(biāo)部位的濃度及持續(xù)生效的時(shí)間，也決定著藥物的功效和穩(wěn)定性[1]。紅花，屬于菊科植物的干燥管狀花，是一種傳統(tǒng)的草藥，可以通過消除血瘀來激活血液循環(huán)和緩解疼痛。紅花及其主要活性成分紅花黃色素和羥基紅花黃色素A（HYSA）已被開發(fā)成多種藥用產(chǎn)品，如紅花和HYSA注射液，主要用于治療心血管疾病，臨床療效明顯[2-5]。紅花黃色素易溶于水，是臨床上廣泛使用的查爾酮類化合物[6-7]，具有減輕疼痛、降低膽固醇和血壓的作用。因此，了解紅花黃色素和BSA作用的機(jī)制，并結(jié)合理論分析其結(jié)合的參數(shù)，對(duì)醫(yī)生可以幫助指導(dǎo)臨床的醫(yī)學(xué)實(shí)踐，對(duì)藥理工作者有助于完成新藥的設(shè)計(jì)與篩選，減輕藥物的副作用，為尋找新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1200紫外可見光譜儀（上海光譜儀器有限公司）、F-4600熒光光譜儀（日本日立高新技術(shù)公司）、JV-2004N電子天平（南京精密科學(xué)儀器有限公司）、DG-214恒溫水浴鍋（石家莊天宇實(shí)驗(yàn)儀器公司）、pHs-3c pH計(jì)（上海分析儀器廠）。

試驗(yàn)所用的紅花黃色素（麥克林試劑有限公司）、BSA（美國(guó)Sigma公司），三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸銅、氯化鎳、氯化鋅、氫氧化鈉均為上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 Tris-HCl緩沖液儲(chǔ)備液

稱取12.114 g三羥甲基氨基甲烷，加入5.844 g NaCl，溶于蒸餾水中，用HCl或NaOH，調(diào)節(jié)溶液pH值為7.4，然后再加蒸餾水定容至1 000 mL，制備濃度為0.1 mol/L Tris-HCl緩沖常溶液。

1.2.2 BSA儲(chǔ)備液

稱取0.133 6 g BSA，將其放入100 mL容量瓶中，用Tris-HCl緩沖溶液溶解，然后用Tris-HCl緩沖溶液補(bǔ)足體積，制備濃度為2×10－5mol/L BSA溶液，并在4℃的冰箱中保存。

1.2.3 紅花黃色素儲(chǔ)備液

稱取0.019 4 g紅花黃色素，放入100 mL容量瓶中，用Tris-HCl緩沖溶液溶解，然后用緩沖溶液補(bǔ)足體積至刻度，制備濃度為1×10－4mol/L紅花黃色素。

1.2.4 紫外吸收光譜法測(cè)定

分別準(zhǔn)確移取 3.0 mL 2×10－5mol/L BSA 溶液和3.0 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液于兩個(gè)1 cm石英比色皿中，以Tris-HCl緩沖液為參比溶液，先測(cè)試BSA溶液的紫外吸收光譜，然后用微量進(jìn)樣器分別向BSA溶液比色皿和參比溶液比色皿中加入一定體積的紅花黃色素溶液（紅花黃色素的累加體積為100 μL），混合均勻，保持10 min后，以相應(yīng)濃度的紅花黃色素溶液為參比測(cè)試BSA與紅花黃色素混合溶液的紫外吸收光譜。

1.2.5 熒光光譜法測(cè)定

分別在283 K和310 K溫度下，準(zhǔn)確移取3.0 mL 2×10-5mol/L BSA溶液，置于石英比色皿中，分別加入相同濃度的紅花黃色素溶液，混合均勻，保持10 min后，以365 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)試BSA和混合樣品的熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜法

2.1.1 紅花黃色素與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)

用紫外光譜法測(cè)定紅花黃色素與BSA的結(jié)合常數(shù)，紅花黃色素與BSA的結(jié)合可以表示為：

其中，[P]為游離受體BSA的濃度，KA為結(jié)合常數(shù)，K0為解離常數(shù)，[Q]為紅花黃色素的濃度，[QP]為結(jié)合物濃度，[P0]為受體BSA總濃度。

當(dāng)生成物QP不存在紫外吸收時(shí)，游離的受體蛋白的摩爾濃度可用相應(yīng)的紫外吸收強(qiáng)度表示為：

經(jīng)整理式(1)～式(5)得：

其中，以(A0-A)-1對(duì)[Q]-1作Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖，藥物與蛋白質(zhì)結(jié)合常數(shù)KA可以從該圖的斜率和A0求得。

BSA在280 nm附近的吸收峰是蛋白質(zhì)的吸收峰，它能夠反映蛋白的骨架狀態(tài)。由此，可以從蛋白質(zhì)的吸收峰強(qiáng)度和最大吸收峰位移的角度來分析和判定它們之間的結(jié)合。在283 K和310 K條件下，研究了不同濃度的紅花黃色素對(duì)BSA的紫外吸收光譜的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1顯示紅花黃素與BSA之間發(fā)生了一定的相互作用。圖2是將（A0－A)-1對(duì)[Q]-1在 283 K 和 310 K條件下，紅花黃色素與BSA相互作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線圖。通過擬合得到紅花黃色素與BSA在283 K和310 K下的相互作用的線性回歸方程，分別為y=1.044 38+1.802 72×10-5x，R=0.995 24 和 y=1.044 38+1.675 71×10-5x，R=0.993 11，結(jié)合常數(shù)KA分別為5.70×104L/mol和 6.34×104L/mol。

圖2 283 K和310 K時(shí)紅花黃色素與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線

2.1.2 紅花黃色素與牛血清蛋白的結(jié)合作用力

考慮到血清蛋白的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它和藥物小分子之間通常有多種作用力。蛋白大分子與藥物小分子之間的作用力包括范德瓦爾斯力、氫鍵、疏水力和靜電引力。當(dāng)反應(yīng)的焓變大于零，熵變不低于零時(shí)，分子間相互作用力為疏水力。當(dāng)反應(yīng)的焓變不大于零，熵變不低于零時(shí)，分子間相互作用力為靜電引力。當(dāng)焓變小于零和熵變小于零時(shí)，分子間相互作用力為范德瓦爾斯力和氫鍵。當(dāng)自由能變化（ΔG）＜0時(shí)，小分子之間的相互作用可以自發(fā)發(fā)生。如果溫度變化不大，可以認(rèn)為ΔH是常數(shù)，計(jì)算公式為：

式(7)中，K1、K2是在溫度 T1和 T2下牛血清蛋白與藥物小分子的結(jié)合常數(shù)，即為L(zhǎng)ineweaver-Burk靜態(tài)猝滅常數(shù)。

通過計(jì)算作用前后的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，如ΔH和ΔS的大小，能夠判斷藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的作用力類別，結(jié)果如表1。由表1可見，BSA與紅花黃色素的結(jié)合過程的 ΔH＜0，ΔS＞0，同時(shí)ΔG＜0，因此該過程是一個(gè)同時(shí)受到焓和熵二者共同驅(qū)動(dòng)完成的自發(fā)過程，二者之間的作用力類型主要是靜電引力。

表1 紅花黃色素與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.1.3 共存金屬離子對(duì)紅花黃色素與BSA結(jié)合常數(shù)的影響

各種微量元素是生物體維持正常生命活動(dòng)必不可少的物質(zhì)。因此，研究微量元素離子對(duì)小分子藥物與BSA結(jié)合常數(shù)的影響情況，是獲得藥物小分子與生物體內(nèi)的藥理活性信息的重要手段。本研究選擇三種常見的Cu2+、Ni2+和Zn2+作為共同存在的金屬離子，在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，測(cè)定了它們?cè)?10 K時(shí)對(duì)紅花黃色素與BSA結(jié)合常數(shù)的影響情況。圖3為Cu2+、Ni2+和Zn2+存在時(shí)的Lineweaver-Burk曲線，其線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)和結(jié)合常數(shù)的結(jié)果見表2。由表2可以看出，所選的三種金屬離子和BSA之間均有一定程度的結(jié)合，形成的鍵會(huì)影響到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化[8]。在金屬離子存在時(shí)，紅花黃色素與BSA的結(jié)合常數(shù)有微弱的減小，說明金屬離子的加入使得二者的結(jié)合能力略有降低，從而證明Cu2+、Ni2+和Zn2+與紅花黃色素之間存在著競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)，紅花黃色素在血漿中的儲(chǔ)存時(shí)間有所縮短，藥物作用的效率有所提高[9-10]。

圖3 共存金屬離子存在時(shí)紅花黃色素與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線

表2 金屬離子對(duì)紅花黃色素-BSA體系結(jié)合常數(shù)的影響

2.2 熒光光譜法

2.2.1 紅花黃色素對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅

熒光光譜可以幫助了解藥物與蛋白的結(jié)合信息，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等結(jié)合特征的參數(shù)。為了考察紅花黃色素對(duì)BSA熒光光譜的影響，保持BSA的濃度固定不變，改變紅花黃色素的濃度，測(cè)試了二者在283 K和310 K時(shí)相互作用的熒光光譜，見圖4。由圖4顯示，牛血清蛋白的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度，會(huì)伴隨著紅花黃色素濃度的增加而逐漸降低，但其峰位和峰形大體保持不變，證明紅花黃色素對(duì)牛血清蛋白的熒光有猝滅效用。

圖4 不同溫度紅花黃色素對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅光譜

2.2.2 熒光猝滅的類型

其它分子與熒光分子發(fā)生相互作用導(dǎo)致熒光分子熒光強(qiáng)度和壽命減少的所有現(xiàn)象，被稱作熒光猝滅。熒光猝滅包括動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種類型。如果溫度升高，Stern-Volmer猝滅常數(shù)KSV增大，此時(shí)熒光體與熒光猝滅分子之間屬于動(dòng)態(tài)猝滅類型。其原因是有效碰撞的幾率隨著溫度的升高而增大，電子轉(zhuǎn)移的過程得到了促進(jìn)。相反如果升高溫度，猝滅結(jié)合常數(shù)減小，則說明屬于靜態(tài)猝滅類型[1]。

動(dòng)態(tài)猝滅過程遵循Stern-Volmer方程：

式(10)中，F(xiàn)為加入藥物濃度為[Q]時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，KSV為Stern-Volmer猝滅常數(shù)，Kq是猝滅速率常數(shù)，F(xiàn)0為不加猝滅劑時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，τ0為不加猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命。

將生物分子的熒光壽命τ0=10-8s帶入式(10)中，可以求出猝滅常數(shù)KSV和猝滅速率常數(shù)Kq[11-12]。運(yùn)用動(dòng)態(tài)猝滅的Stern-Volmer方程，在溫度283 K和310 K時(shí)，以F0/F對(duì)[Q]作圖，見圖5?？筛鶕?jù)擬合曲線 y283K=7.247×104x+0.952 4，y310K=3.323 3×104x+1.015 3，所得結(jié)果見表3。由圖5可見，310 K時(shí)的曲線斜率明顯小于283 K時(shí)的曲線斜率，且Kq大于最大擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)，這是靜態(tài)猝滅類型的表現(xiàn)，因此紅花黃色素與BSA之間的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖5 紅花黃色素對(duì)BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

表3 紅花黃色素與BSA間的熒光猝滅常數(shù)

靜態(tài)猝滅遵循Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程：

式 (11)中，KLB為猝滅劑與熒光物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，F(xiàn)為猝滅劑濃度為[Q]時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0為猝滅劑濃度為零時(shí)熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。KLB為猝滅劑與熒光物質(zhì)的結(jié)合常數(shù)，又稱為L(zhǎng)ineweaver-Burk猝滅常數(shù)。紅花黃色素猝滅牛血清蛋白的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線與(F0－F)-1和[Q]-1的關(guān)系，見圖6?？筛鶕?jù)擬合曲線求得283 K和310 K時(shí)的靜態(tài)猝滅結(jié)合常數(shù)KLB值，見表3。由表3可見，隨著溫度升高KLB而減小，說明紅花黃色素對(duì)牛血清蛋白的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

圖6 紅花黃色素對(duì)BSA熒光猝滅的Lineweaver-Burk曲線

2.2.3 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)

根據(jù)式(12)可以計(jì)算小分子藥物與大分子蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)和結(jié)合常數(shù)。

式(12)中，F(xiàn)0為未加猝滅劑的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為加入濃度為[Q]的猝滅劑時(shí)的熒光強(qiáng)度。以lg[(F0－F)/F]對(duì)lg[Q]作圖，見圖7，通過線性擬合可以求得紅花黃色素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)和結(jié)合常數(shù)(K)，結(jié)果見表4。由表4可見，紅花黃色素與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約等于0.5，二者的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而減小。

圖7 紅花黃色素與牛血清蛋白的結(jié)合常數(shù)曲線

表4 結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及結(jié)合常數(shù)

3 結(jié)論

通過紫外可見吸收光譜研究了中藥小分子紅花黃色素與牛血清蛋白（BSA）的相互作用情況，考查了溫度和共存金屬離子 Cu2+、Ni2+、Zn2+對(duì)二者結(jié)合常數(shù)的影響。采用熒光光譜研究了紅花黃色素對(duì)生物大分子BSA的熒光猝滅的類型及結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。紅花黃色素與BSA的結(jié)合作用力主要表現(xiàn)為靜電引力。結(jié)合常數(shù)隨溫度的升高而降低，結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級(jí)約為104，并且二者的結(jié)合過程的 ΔH＜0，ΔS＞0，ΔG＜0，驅(qū)動(dòng)力為 ΔH 和 ΔS，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為 0.5。在 Cu2+、Ni2+和Zn2+存在情況下，紅花黃色素與BSA的結(jié)合常數(shù)略小于無金屬離子存在，說明競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)存在于金屬離子和紅花黃色素之間，使得小分子藥物紅花黃色素在血漿中的存儲(chǔ)時(shí)間得到有效地縮短，進(jìn)而提高了紅花黃色素的藥效。