CaMKIV 信號缺失促進(jìn)肌損傷炎癥并影響肌再生

王涵，厲洋洋，菅曉婷，黃靜雯，藍(lán)海強(qiáng)，胡稷杰*，廖華*

1.廣東省組織構(gòu)建與檢測重點實驗室，南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，廣州 510515

肌損傷是日常生活中比較常見的一種疾患，是運動醫(yī)學(xué)比較常見的損傷之一。肌損傷通常由肌纖維破壞、潰變、壞死開始，然后肌肉被炎癥細(xì)胞快速和持續(xù)浸潤。炎癥細(xì)胞可吞噬或降解可能由肌損傷產(chǎn)生的細(xì)胞碎片[1]，還可以釋放多種細(xì)胞因子，促進(jìn)肌肉再生修復(fù)。此外，在肌損傷時期鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶4（CaMKIV）表達(dá)上調(diào)[2]。CaMKIV 是一種多功能蛋白激酶?；罨腃aMKIV 能與鈣/鈣調(diào)蛋白（Ca2+/Calmodulin）結(jié)合，是關(guān)鍵的Ca2+下游信號分子之一[3-5]。CAMKIV 是調(diào)節(jié)外周免疫和炎癥的關(guān)鍵分子，參與淋巴細(xì)胞激活、增殖和終末分化，例如，CaMKIV 參與調(diào)控小鼠胸腺的胚胎發(fā)生[6]，以及成年動物胸腺細(xì)胞亞群成熟[7,8]；干預(yù)cAMP 反應(yīng)元件調(diào)制器α（CREM-α）對IL-2 的合成抑制，下調(diào)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Tregs）細(xì)胞功能，激活效應(yīng)T 細(xì)胞，導(dǎo)致器官損傷[9, 10]。

CaMKIV 能干預(yù)骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+依賴性的肌基因表達(dá)，尤其是線粒體發(fā)生和氧化酶活性，參與肌再生、重塑并決定肌纖維異質(zhì)性[11,12]。肌損傷可觸發(fā)局部炎癥及多種炎性細(xì)胞浸潤，這有助于損傷肌再生[13-15]。我們嘗試構(gòu)建CaMKIV-/-小鼠，并采用CTX 誘發(fā)骨骼肌損傷，分析CaMKIV 信號對對損傷肌內(nèi)炎癥反應(yīng)及肌修復(fù)的影響，為降低肌損傷炎癥、促進(jìn)骨骼肌有效再生及新藥開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 CaMKIV-/-小鼠的構(gòu)建及檢測

采用CRISPR/Cas9 技術(shù)，利用非同源重組修復(fù)引入突變的方式，造成CaMKIV 基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失。簡要過程如下：通過體外轉(zhuǎn)錄方式，獲得Cas9 mRNA 和gRNA（圖1A）；將Cas9 mRNA 和gRNA 顯微注射入C57BL/6J 小鼠(上海南方模式生物科技股份有限公司)受精卵中，獲得F0 代小鼠。PCR擴(kuò)增及測序鑒定（生工生物工程（上海）有限公司，試劑）陽性的F0 代小鼠與C57BL/6J 小鼠交配獲得陽性F1 代小鼠（圖1B）。

圖1 CaMKIV-/-小鼠構(gòu)建A: gRNAs 序列 B: 構(gòu)建策略示意: 使用CRISPR/Cas9 技術(shù)，利用非同源重組修復(fù)引入突變的方式，造成Camk4 基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失Fig.1 The cconstruction of CaMKIV-/- mice A: gRNAs sequence; B: Construction strategy: CRISPR/Cas9 technique was used to cause aberration of Camk4 gene reading frame and loss of function

將獲得的基因敲除雜合子小鼠（CaMKIV+/-）分成兩部分：一部分雜合子小鼠與野生型小鼠交配，擴(kuò)群繁育較多的雜合子小鼠；一部分雜合子小鼠自交，獲得基因敲除純合子小鼠（CaMKIV-/-），進(jìn)行基因敲除效果驗證和后續(xù)的表型分析。

1.2 肌損傷實驗

C57BL/6 (B6)對照鼠（購于南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心），以及CaMKIV-/-小鼠常規(guī)飼養(yǎng)（12 h/12 h 光照/黑夜，飲食、飲水充足自由）。動物實驗遵守南方醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會規(guī)定實施。選擇4～8 周齡小鼠，采用CTX 誘導(dǎo)骨骼肌損傷：小鼠腓腸肌注射30 μL CTX (100 μg/mL; Sigma)，分別于注射后第3、5、7天處死小鼠，收集肌組織標(biāo)本快速冷凍用于基因和蛋白分析等。

1.3 組化及免疫熒光染色

肌組織樣本冰凍切片，厚度8μm，HE 或免疫熒光染色：丙酮固定，添加一抗，4 ℃孵育過夜。PBS 沖洗，二抗室溫孵育1h。PBS 沖洗，DAPI 核染。所用的一抗包括：大鼠抗小鼠Dystrophy(1：400，Abcam)、大鼠抗小鼠F4/80(1：200，ebioscience)。二抗則采用：Alexa Fluor 488 偶 聯(lián) 的 羊 抗 兔IgG(1：400，Santa Cruz)、Cy3 偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(1：400，Santa Cruz)、Cy3偶聯(lián)的羊抗兔IgG(1：400，Santa Cruz)或Alexa Fluor 488 偶聯(lián)的羊抗鼠IgG(1：400，Santa Cruz)。奧林巴斯BX51 熒光顯微鏡(Olympus, 日本)下觀察并分析。

1.4 流式檢測

37 °C、0.2%Ⅱ膠原酶(Merck)消化剪碎的肌組織或培養(yǎng)細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，重懸于熒光激活細(xì)胞分選緩沖液(磷酸鹽緩沖液，廣州鼎國生物技術(shù)有限公司)獲得單細(xì)胞懸液。添加熒光抗體（anti-F4/80-PE,anti-Ly-6C-FITC, anti-CD206-FITC, anti-Ki67-BV421）。流式檢測（多維高清流式細(xì)胞分析儀，BD LSRFortessa X-20)，F(xiàn)lowJo 軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CaMKⅣ-/-小鼠的構(gòu)建及檢測

將注射后的受精卵移植到假孕母鼠中獲取F0 代嵌合體小鼠。采用PCR 擴(kuò)增及測序?qū)ζ溥M(jìn)行基因型鑒定（圖2A）。將陽性F0 代小鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，獲得F1 代雜合小鼠（CaMKIV+/-）（圖2B）。進(jìn)一步自交CaMKIV+/-小鼠，獲得基因敲除純合子小鼠（CaMKIV-/-）。CaMKIV-/-小鼠基因的驗證和表型分析見圖3。

圖2 F0 及F1 代小鼠的鑒定結(jié)果A: F0 代小鼠序列突變情況 B: F1 代小鼠與野生小鼠的測序結(jié)果比對（Query 為野生型基因組序列，Subject 為實際測序結(jié)果）Fig.2 The identification result of F0 and F1 mice A: Sequence mutation of F0 generation mice; B: Comparison of sequencing results between F1 generation mice and wild mice (Query was wild-type genome sequence, Subject was actual sequencing results)

2.2 CaMKⅣ信號參與調(diào)節(jié)小鼠損傷肌內(nèi)炎癥反應(yīng)

HE 染色顯示，野生（WT）小鼠脛骨前肌CTX 損傷后3 d 可見大量肌纖維壞死，細(xì)胞溶解、潰變，伴明顯的炎性細(xì)胞滲出。隨損傷時間延長，炎癥撤退，炎性浸潤減少，受損肌纖維逐漸被大量再生的中央核肌纖維所代替（圖4）。較之WT 鼠，CaMKⅣ-/-小鼠損傷肌內(nèi)炎性滲出加劇，炎癥持續(xù)時間延長（圖4）。免疫染色則證實，CaMKⅣ-/-小鼠損傷肌內(nèi)的單核/巨噬細(xì)胞（F4/80+）數(shù)量較WT 鼠顯著增多，再生的中央核肌纖維（Dystrophin+）數(shù)量卻顯著低于WT 鼠（圖5）。我們的結(jié)果提示，小鼠體內(nèi)CaMKⅣ信號缺失可致肌內(nèi)炎癥程度加劇、炎癥反應(yīng)延長、肌修復(fù)延遲。

圖4 HE 染色顯示CTX 損傷肌組織炎癥及再生A、B 分別為WT 小鼠與CaMKIV-/-小鼠肌組織損傷3 d 后，HE 染色顯示肌內(nèi)組織炎癥浸潤，C、D 分別為WT 小鼠和CaMKIV-/-小鼠肌組織損傷7 d后，HE 染色顯示肌細(xì)胞再生Fig.4 HE staining showed inflammation and regeneration of CTX injured muscle tissue A and B showed intramuscular tissue inflammation 3 days after muscle tissue injury in WT mice and CaMKIV-/-mice; C and D showed intramuscular tissue regeneration 3 days after muscle tissue injury in WT mice and CaMKIV-/- mice

2.5 CaMKⅣ信號缺失影響損傷肌內(nèi)巨噬細(xì)胞表型

流式檢測發(fā)現(xiàn)，CTX 注射可誘導(dǎo)WT 鼠損傷肌內(nèi)促炎的M1 型巨噬細(xì)胞（F4/80+Ly6C+）于壞死期（D3）聚集，隨肌再生進(jìn)行（D5）逐漸下降。我們發(fā)現(xiàn)，同一損傷時間，CaMKⅣ-/-小鼠損傷肌內(nèi)M1 細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)高于WT 鼠（圖6A）。隨損傷時間延長和肌修復(fù)啟動，WT 鼠損傷肌內(nèi)促緩解的M2 細(xì)胞（F4/80+CD206+）數(shù)量逐漸增加，CaMKⅣ-/-鼠損傷肌內(nèi)M2 細(xì)胞比例卻始終低于WT 鼠（圖6B）。這提示，CaMKⅣ信號參與調(diào)控?fù)p傷骨骼肌內(nèi)M1 巨噬細(xì)胞向M2 表型的轉(zhuǎn)變。M2 巨噬細(xì)胞可通過釋放IL-10 等抑炎因子促進(jìn)肌再生[14]，我們因此推測損傷肌內(nèi)M2 細(xì)胞缺失是CaMKⅣ-/-小鼠肌修復(fù)延遲的可能原因。

2.6 CaMKⅣ信號缺失影響肌損傷局部巨噬細(xì)胞增殖

前述研究提示，CaMKⅣ-/-小鼠損傷肌內(nèi)M1 細(xì)胞滯留、M2 細(xì)胞稀少是炎癥持續(xù)、肌修復(fù)延遲的可能原因。2 種巨噬細(xì)胞比例差異是否源于其局部增殖能力改變呢？采用FACS 分析，我們發(fā)現(xiàn)，CaMKⅣ-/-小鼠損傷肌內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞（F4/80+Ki67+）數(shù)量顯著高于對照鼠（圖7A），但CaMKⅣ-/-鼠損傷肌內(nèi)增殖巨噬細(xì)胞以M1 型細(xì)胞為主(F4/80+Ly6C+Ki67+)（圖7B），M2 細(xì)胞的增殖(F4/80+CD206+Ki67+)與對照鼠無顯著差異（圖7C）。上述結(jié)果提示，CaMKⅣ信號缺失促進(jìn)損傷肌內(nèi)巨噬細(xì)胞、尤其是促炎的M1 細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致肌內(nèi)炎癥加劇。

3 討論

肌損傷將觸發(fā)局部炎癥及多種炎性細(xì)胞浸潤，這有助于損傷肌再生[13,16]。以往研究表明，CTX 急性肌損傷-炎癥-再生過程中，CaMKIV 水平于壞死潰變期（3d）快速上調(diào), 隨著肌再生進(jìn)行，CaMKIV 水平及活性逐漸下調(diào)，表明肌損傷導(dǎo)致CaMKIV 信號激活[17]。為明確CaMKIV 信號如何影響肌內(nèi)炎癥，我們構(gòu)建了CaMKIV-/-鼠，采用CTX 注射制備野生鼠及CaMKIV-/-小鼠急性肌損傷模型。我們發(fā)現(xiàn)，CaMKIV 基因缺失將導(dǎo)致肌損傷后炎癥反應(yīng)加重，損傷肌組織內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞細(xì)胞募集增加（CD11b+和F4/80+細(xì)胞數(shù)量顯著上調(diào)）、肌內(nèi)促炎的M1 巨噬細(xì)胞（CD45+/Ly-6C+F4/80+細(xì)胞）比例明顯增高，提示CaMKIV 信號參與調(diào)控?fù)p傷肌內(nèi)巨噬細(xì)胞的表型及功能。

骨骼肌損傷后，肌內(nèi)聚集的巨噬細(xì)胞主要源自滲出的血單核細(xì)胞。但有研究指出[18]，血單核細(xì)胞刪除小鼠的損傷肌內(nèi)仍存在巨噬細(xì)胞聚集（較對照鼠，巨噬細(xì)胞數(shù)量降低57%）, 損傷肌內(nèi)炎性微環(huán)境可誘導(dǎo)滲出的，或定居的M1 及M2 細(xì)胞增殖。我們的研究證實，CaMKIV 基因缺失條件下，損傷肌內(nèi)M1 巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著上調(diào)，M2 細(xì)胞比例低于對照鼠。進(jìn)一步的細(xì)胞增殖分析表明，CaMKIV 基因缺失小鼠損傷肌內(nèi)增殖的M1 細(xì)胞比例顯著高于對照鼠。我們的結(jié)果表明，CaMKIV 信號可抑制M1 細(xì)胞的滲出和局部增殖，是肌損傷后的促修復(fù)因素。

CaMKIV 為免疫反應(yīng)的組成部分，介導(dǎo)Ca2+依賴性巨噬細(xì)胞功能，參與敗血癥等炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)。LPS 誘導(dǎo)條件下，CaMKIV 過表達(dá)可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的M1 極化，上調(diào)IL-6/IL-1 轉(zhuǎn)錄活性、增加促炎分子釋放。反之，缺乏CaMKIV 基因的巨噬細(xì)胞M1 極化能力減弱[19]。CaMKIV 能干預(yù)骨骼肌內(nèi)Ca2+依賴性的肌基因表達(dá)，尤其是線粒體發(fā)生和氧化酶活性，參與肌再生、重塑并決定肌纖維異質(zhì)性。我們以往的研究證明，炎性環(huán)境中肌纖維上調(diào)CaMKIV 蛋白表達(dá)，CaMKIV 基因敲除導(dǎo)致體外分化肌纖維下調(diào)MHC-I/II、TLR3 及部分促炎的肌因子水平[20]。我們推測，本研究觀察的CaMKIV 全敲小鼠所呈現(xiàn)的肌損傷炎癥加劇、肌修復(fù)延遲可能源于：i）CaMKIV 基因缺失影響肌纖維釋放特定肌因子，間接調(diào)控巨噬細(xì)胞功能；ii）CaMKIV 基因缺失影響巨噬細(xì)胞功能及極化。接下來，我們將深入分析損傷肌內(nèi)再生肌纖維，或免疫細(xì)胞CaMKIV 基因缺失對肌內(nèi)炎癥和肌修復(fù)的影響。