哈茨木霉WF2 菌株鑒定及對煙草黑脛病的防效

危 瀟，黎妍妍，姚經(jīng)武，曹春霞，黃大野

（1.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/國家生物農(nóng)藥工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部微生物農(nóng)藥創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.湖北工業(yè)大學(xué)，武漢 430068；3.湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢 430030）

木霉菌（Trichodermasp.）作為一類重要的生防真菌，廣泛存在于自然界中，通常定居在腐爛的木材和其他形式的有機(jī)基質(zhì)中，具有分布廣、適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖快等特點(diǎn)［1，2］。木霉屬包括多個菌種，有超過400 多個種類［3］。在農(nóng)業(yè)防治上，常用的有綠木霉（T.virens）、長枝木霉（T.longibrachiatum）、綠色木霉（T.viride）、康寧木霉（T.koningii）、哈茨木霉（T.harzianum）、棘孢木霉（T.asperellum）、深綠木霉（T.atroviride）、蓋姆斯木霉（T.gamsii）等［3］。它既可以作為生物防治劑，也可以作為生物促進(jìn)劑。木霉可以使用多種復(fù)雜的直接和間接生物防治機(jī)制［4］來防治多種植物病害，既可以對抗生物脅迫如廣譜病原微生物（真菌、細(xì)菌、昆蟲和線蟲）等，也可以對抗非生物脅迫如惡劣的環(huán)境條件等。對病原體的直接影響包括細(xì)胞壁降解酶（CWDEs）的產(chǎn)生、抗生素的合成、對空間和營養(yǎng)物質(zhì)（主要是碳、氮和鐵）的競爭以及與真菌病原體建立直接的寄生關(guān)系［4］。

煙草是中國重要的經(jīng)濟(jì)作物，但煙葉生產(chǎn)主要依賴化學(xué)農(nóng)藥防治土傳病害，長期使用化學(xué)農(nóng)藥易導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)，同時還會造成環(huán)境污染［5］。因此，需探索出綠色、有效的煙草土傳病害防治方法。與化學(xué)農(nóng)藥相比，生物農(nóng)藥具有高效、選擇性強(qiáng)、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。在環(huán)境保護(hù)、綠色發(fā)展等理念的支持下，生物農(nóng)藥已成為生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［5］。

本研究從湖北省五峰縣煙田土壤中分離獲得1株木霉，通過生物學(xué)特征分析和分子生物學(xué)手段鑒定其種類，并采用對峙試驗(yàn)和活體盆栽試驗(yàn)測定其對煙草黑脛病菌和煙草根腐病菌，即煙草疫霉（Phytophthora nicotianae）和尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的生防效果，為利用綠色環(huán)保的生物農(nóng)藥防治煙草病害提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及培養(yǎng)基

供試木霉菌株WF2 分離自湖北省五峰縣煙田土壤樣品。供試病原真菌煙草疫霉和尖孢鐮刀菌由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心提供。供試煙草為云煙87。培養(yǎng)基為馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L、pH 自然；馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDB）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L、pH 自然；V8培養(yǎng)基：V8 汁220 mL、碳酸鈣2 g、瓊脂18 g、蒸餾水1 L，pH 自然；發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮50 g、蒸餾水50 g、pH 自然。

1.2 哈茨木霉的分離純化培養(yǎng)

稱取10 g 土壤樣品，加入90 mL 無菌水，室溫下150 r/min 振蕩培養(yǎng)30 min。吸取上清液，采用10 倍梯度稀釋法分離木霉［6］，每個PDA 培養(yǎng)基平板上均勻涂布100 μL 土壤稀釋液。培養(yǎng)4～5 d，在稀釋液平板上挑取單菌落在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，重復(fù)3～4 次后得到純化菌株，編號WF2。

1.3 哈茨木霉的系統(tǒng)分類學(xué)鑒定

1.3.1 木霉菌株的形態(tài)學(xué)觀察 將分離純化后的菌株WF2 接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫避光培養(yǎng)7 d，每24 h 觀察菌落形態(tài)（包括顏色、質(zhì)地等）［7］。

1.3.2 木霉菌株的分子生物學(xué)鑒定 對分離到的菌株進(jìn)行ITS-PCR 擴(kuò)增，所用引物為通用引物ITS1（5'TCCGTAGGTGAACCTGCCG3'）和ITS4（5'TCCT CCGCTTATTGATATGC3'）。PCR 擴(kuò)增體系為：DNA模板1 μL、2×PCR Master Mix 25 μL、引物ITS1 和ITS4 各1 μL、ddH2O 22 μL。擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)熱5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃復(fù)性10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物在4 ℃條件下保存。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μL Loading buffer混勻，加入1%瓊脂糖凝膠孔中，用DNA Marker 作對照，在1×TAE 電泳緩沖液中電泳，以凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，委托測序公司測序。運(yùn)用MEGA 11 軟件，使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ法）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，同時計算遺傳距離。

1.4 哈茨木霉WF2 離體抑菌活性測定

參考田淼等［8］的研究方法，使用無菌打孔器（直徑5 mm）在WF2 菌株和病原真菌的菌落邊緣打取菌餅，用于對峙培養(yǎng)。處理組，將菌株WF2 的菌餅和病原真菌的菌餅分別接種至PDA 平板（直徑90 mm）上，二者之間的距離為45 mm。對照組，只接種病原真菌。28 ℃恒溫避光培養(yǎng)，每組3 次重復(fù)。10 d 時觀察并用十字交叉法測量菌落直徑，計算抑菌率，計算式如下。

競爭作用測定。使用覆蓋度表示木霉菌株對目標(biāo)病原真菌的寄生能力，參照陳書華等［9］的方法對木霉拮抗系數(shù)進(jìn)行分級，Ⅰ級：木霉菌菌絲覆蓋率100%；Ⅱ級：木霉菌菌絲覆蓋率≥2/3；Ⅲ級：1/3≤木霉菌絲覆蓋率＜2/3；Ⅳ級：木霉菌菌絲覆蓋率＜1/3；Ⅴ級：病原菌菌絲覆蓋率100%。

1.5 木霉對煙草疫霉的盆栽防效試驗(yàn)

1.5.1 木霉菌劑的制備 使用無菌打孔器（直徑5 mm）在WF2 菌株的菌落邊緣打取菌餅，在每瓶PDB 培養(yǎng)基中放置1 塊菌餅，于28 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)48 h，獲得WF2 種子液。以10%的接種量將WF2 種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d。將發(fā)酵完成的培養(yǎng)基于45 ℃烘箱烘干水分后，粉碎機(jī)打碎成粉劑備用，即得WF2 菌劑。

1.5.2 病原真菌菌懸液的制備 將活化好的煙草疫霉菌餅轉(zhuǎn)接于V8 培養(yǎng)基平板中，光照培養(yǎng)14 d，用無菌水將病原菌菌絲及孢子從平板上洗脫下來，按照李小杰等［10］的方法，放入4 ℃冰箱中處理30 min，再在常溫下放置20 min，促進(jìn)菌絲釋放孢子，調(diào)節(jié)成1×106CFU/mL 孢子懸浮液備用。

1.5.3 煙草黑脛病防治試驗(yàn)設(shè)計 將煙草種子（云煙87）播種于裝有基質(zhì)（草炭∶蛭石=3∶1，質(zhì)量比）的育苗缽中［11］，待生長至6 葉期備用。挑選長勢一致的煙苗分為4 個處理組，每處理3 個重復(fù)，每個重復(fù)15 株煙苗。即CK，清水；T1，WF2 菌劑稀釋150 倍；T2，WF2 菌劑稀釋300 倍；T3，太抗木每靈水分散粒劑稀釋300 倍。采用生防菌菌液灌根處理的方式測定其對煙草黑脛病的防效，處理前先將每株煙苗接種20 mL 菌液。施藥24 h 后，接種煙草疫霉孢子懸浮液5 mL/缽。14 d 后調(diào)查病情指數(shù)與防治效果。

1.5.4 病情指數(shù)與防治效果 煙草黑脛病分級標(biāo)準(zhǔn)參照《煙草病蟲害分級及調(diào)查方法》［12］（GB/T 23222—2008），0 級，全株無?。? 級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3 以下葉片凋萎；3 級，莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2 葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑；5 級，莖部病斑超過莖圍的1/2但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎；7 級，莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3 以上葉片凋萎；9 級，病株基本枯死。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，在0.05 水平上采用LSD法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。使用MEGA 11 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株的形態(tài)學(xué)觀察

菌株在PDA 培養(yǎng)基上生長迅速，培養(yǎng)3 d 時出現(xiàn)白色絮狀菌絲且鋪滿整個平板，之后菌絲逐漸變?yōu)榫G色，培養(yǎng)7 d 時菌絲變?yōu)榘稻G色，無明顯氣味，菌落形態(tài)特征與哈茨木霉菌株基本一致（圖1）。

圖1 菌落的形態(tài)學(xué)觀察

2.2 木霉菌株的分子生物學(xué)鑒定

將WF2 的測序結(jié)果經(jīng)過BLAST 后，ITS 片段與Trichoderma harzianumQT2209（KY225652.1）序列相似度達(dá)99.85%。應(yīng)用MEGA 11 軟件與BLAST 比對相近菌株的序列，利用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，WF2 與Trichoderma harzianumQT2209（KY225652.1）為同一個分支（圖2）。綜合形態(tài)學(xué)觀察和系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果，確定菌株WF2 為哈茨木霉。

圖2 菌株WF2 系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 哈茨木霉WF2 離體抑菌活性測定

哈茨木霉WF2 與兩種病原真菌的對峙培養(yǎng)結(jié)果表明，WF2 在PDA 平板上生長迅速，培養(yǎng)3 d 時即對兩種病原真菌產(chǎn)生明顯抑制效果，培養(yǎng)10 d 時，WF2 的菌絲已完全覆蓋在病原真菌的菌絲上，對兩種病原真菌的覆蓋度均為Ⅲ級（圖3、表1）。

表1 木霉菌株WF2 對兩種煙草病原真菌的抑制效果

圖3 哈茨木霉WF2 與兩種病原真菌的對峙培養(yǎng)

通過測量培養(yǎng)10 d 時各處理的菌落直徑，計算出木霉菌株WF2 對兩種煙草病菌的抑制率和覆蓋度。通過表1 可以看出，WF2 對煙草疫霉和尖孢鐮刀菌具有較強(qiáng)的抑制效果。對煙草疫霉的平均抑制率達(dá)到86.75%，對尖孢鐮刀菌的平均抑制率達(dá)到75.00%。

2.4 木霉對煙草疫霉的盆栽防效試驗(yàn)

室內(nèi)盆栽結(jié)果表明，與CK 相比，WF2 菌株和商品菌劑太抗木每靈均能顯著降低煙草黑脛病的病情指數(shù)，使用WF2 菌株處理過的煙苗生長情況良好（圖4）。T1 的煙草黑脛病病情指數(shù)僅為12.28%，防效達(dá)到80.23%；T2 的煙草黑脛病病情指數(shù)為19.40%，防效達(dá)到68.77%；T3 的煙草黑脛病病情指數(shù)僅為6.25%，防效達(dá)到89.94%。商品菌劑太抗木每靈防治效果優(yōu)于木霉菌株WF2，但兩者均具有明顯的防治煙草黑脛病的能力（表2）。

表2 木霉菌株WF2 對煙草疫霉的盆栽防治效果（單位：%）

圖4 木霉菌株WF2 對煙草疫霉盆栽防治效果

3 小結(jié)與討論

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于化肥農(nóng)藥的大量使用，導(dǎo)致環(huán)境污染、生態(tài)失衡、農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)下降及農(nóng)殘超標(biāo)等問題日益嚴(yán)重。木霉菌因其應(yīng)用廣泛、防病效果顯著被越來越多地應(yīng)用在生物防治中。木霉對多種植物病原真菌都有防治效果。據(jù)統(tǒng)計，木霉至少對18 個屬29 個種的植物病原真菌有拮抗作用。包括水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）［13］、鐮刀菌屬（Fusariumspp.）［14］、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）［15］、黃曲霉（Aspergillus flavus）［16］、炭疽菌屬（Colletotrichum）［17］等。它能夠通過直接作用機(jī)制（真菌寄生、產(chǎn)生裂解酶、抗生物質(zhì)、爭奪空間或養(yǎng)分）或間接作用機(jī)制（誘導(dǎo)植物防御）來減少病原體引起的植物疾病。

本研究從湖北省五峰煙田土壤中分離獲得1 株木霉WF2，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和分子學(xué)（ITS 序列）比對，鑒定為哈茨木霉。通過對峙試驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)該菌株對煙草病原菌（煙草疫霉、尖孢鐮刀菌）具有顯著抑制效果。抑制率分別達(dá)到86.75%和75.00%，且對兩種病菌的覆蓋度均達(dá)到Ⅲ級，寄生效果優(yōu)良，可完全抑制病原真菌的生長。后續(xù)進(jìn)行了盆栽試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株對煙草黑脛病防治效果顯著，其150 倍孢子稀釋液（T1）防治效果達(dá)到80.23%，接近商品菌劑太抗木每靈的防治效果。后續(xù)將利用該菌株進(jìn)行田間病害的相關(guān)研究，進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株對煙草病害的防治效果。