珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素干擾試驗(yàn)研究

何映霞，蔡春楊，張寶獻(xiàn)，郭心怡，滕世超，孟麗麗，陳虹

（華蘭生物工程重慶有限公司，重慶 408100）

血漿蛋白制品的純化制備過程中會(huì)應(yīng)用到壓濾技術(shù)，該技術(shù)能對(duì)血漿蛋白沉淀和其上清液進(jìn)行有效分離[1]。純化處理后的珍珠巖適合分離顆粒較大的混懸液，可過濾血漿、血清、血液蛋白等[2]，在血液制品生產(chǎn)中常作為助濾劑去除有害的活性成分。細(xì)菌內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖，為外源性致熱源，可激活中性粒細(xì)胞等釋放出內(nèi)源性熱原質(zhì)，作用于體溫調(diào)節(jié)中樞引起發(fā)熱。珍珠巖中細(xì)菌內(nèi)毒素限度檢查可采用限度法[3]，在生產(chǎn)中常用鱟試劑檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素，判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定。

鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可與細(xì)菌內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)[4]。除了細(xì)菌內(nèi)毒素，鱟試劑還可與某些β-葡聚糖反應(yīng)，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，致使將符合使用要求的珍珠巖誤判為細(xì)菌內(nèi)毒素不符合限度規(guī)定。如遇含有β-葡聚糖的樣品，可使用去G 因子鱟試劑或G 因子反應(yīng)抑制劑來排除鱟試劑與β-葡聚糖的反應(yīng)。

試驗(yàn)中，用于溶液配制或樣品有直接接觸的容器須將外源性細(xì)菌內(nèi)毒素滅活。玻璃器皿常用干熱滅菌法（250 ℃滅菌30 min 以上）或其他不影響細(xì)菌內(nèi)毒素檢查內(nèi)毒素滅活方法。若使用與溶液或樣品有直接接觸的塑料器具應(yīng)選用經(jīng)生產(chǎn)廠家證明無內(nèi)毒素并且對(duì)試驗(yàn)無影響的塑料器具[5]。本文通過研究珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素檢查溶液的制備方式，確認(rèn)該物料能采用鱟試劑（凝膠法）對(duì)該物料進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，為該物料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查溶液制備提供操作依據(jù)。

1 試劑、材料及儀器

1.1 試劑

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)為1806131，規(guī)格為10 EU/支，湛江安度斯生物有限公司，2 ～8 ℃保存；鱟試劑，批號(hào)為1812263、1902272、1903131，規(guī)格為0.06 EU/mL、0.1 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，2 ～8 ℃保存；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，批號(hào)為1807310、1902260，規(guī)格為5 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，室溫保存；稀釋劑Ⅱ，批號(hào)為1804260，規(guī)格為4 mL/支，湛江安度斯生物有限公司，室溫保存；鉻酸洗液，自配，室溫保存；珍珠巖，批號(hào)為H2P1810、H2P18296，美國(guó)Harborlite 公司。

1.2 材料與儀器

旋渦混勻器、移液器（100 ～1 000 μL）、移液器（20 ～200 μL）、無內(nèi)毒素吸頭、無內(nèi)毒素離心管（50 mL）、玻璃試管（15 mm×100 mm）、16 mm 離心管架、密封膜、石英鐘、砂輪。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

2.1.1 玻璃器皿清洗

將鉻酸洗液倒入與溶液或樣品有直接接觸的玻璃器皿中浸泡1 h，將器皿中的鉻酸洗液倒入回收瓶，用自來水洗凈玻璃器皿中殘留的鉻酸洗液，再用純水反復(fù)沖洗3 次以上，洗干凈的玻璃試管放入試管架上瀝干水分，用錫箔紙包好，備用。

2.1.2 去除玻璃器皿表面可能存在的外源性內(nèi)毒素

將用錫箔紙包好的玻璃器皿，放入經(jīng)驗(yàn)證過的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，將溫度調(diào)至220 ℃，待設(shè)備升溫至預(yù)設(shè)溫度后計(jì)時(shí)，恒溫保持180 min 以上，關(guān)掉電源，降溫，取出待用。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核操作步驟

2.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1 支，用BET 水（細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水）1.0 mL 溶解，旋渦混勻15 min，然后BET 水將工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ（λ為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度）。

配制4 管細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)毒素單位分別為0.125 EU/mL、0.06 EU/mL、0.03 EU/mL 和0.015 EU/mL。

2.2.2 待復(fù)核鱟試劑的準(zhǔn)備

取18 支鱟試劑。每支均用0.1 mLBET 水復(fù)溶，備用。

2.2.3 加樣

2λ、λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液每一濃度加4 支管，加樣體積為0.1 mL，另取2 支管加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照，加樣體積均為0.1 mL，作為鱟試劑復(fù)核用。干擾試驗(yàn)加樣方式見表1。

表1 鱟試劑標(biāo)識(shí)靈敏度對(duì)照系列溶液加樣方式

2.2.4 保溫

加樣結(jié)束后，用密封膜將鱟試劑管口密封，混勻時(shí)避免氣泡產(chǎn)生，垂直放入（37±1）℃電熱恒溫水浴箱中，保溫（60±2）min。

2.2.5 觀察并記錄結(jié)果

將鱟試劑管從電熱恒溫水浴箱中輕輕取出，倒轉(zhuǎn)180°且動(dòng)作須輕緩，若管內(nèi)形成的凝膠不變形、滑脫者為陽(yáng)性，記錄（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形、滑脫者為陰性，記錄（-）。

2.2.6 試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

當(dāng)最大濃度2λ的4 管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ的4 管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按式（1）計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（λc）。式中：n為平行管數(shù)（等于4），X為每列陽(yáng)性結(jié)果所對(duì)應(yīng)的最小內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)值（lg）。

2.2.7 結(jié)果

3 批鱟試劑的靈敏度為0.06 EU/mL，與標(biāo)示靈敏度一致。

2.3 初篩預(yù)實(shí)驗(yàn)

由于干擾實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)，珍珠巖pH 值在5 ～11，而細(xì)菌內(nèi)毒素實(shí)驗(yàn)在中性，所以需要選擇稀釋劑進(jìn)行中和，根據(jù)湛江安度斯稀釋劑Ⅰ和稀釋劑Ⅱ的用途，選擇適宜的稀釋劑Ⅱ作為珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素檢查溶液的酸堿度調(diào)節(jié)劑。

2.3.1 珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素檢查溶液的獲取

取珍珠巖適量（按照珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素限度為不大于1 EU/g 取樣），用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解稀釋至2 倍最大有效稀釋倍數(shù)（Maximum Valid Dilution，MVD），充分混勻后于離心機(jī)中4 000 r/min 離心10 min后取上清液加入等量稀釋劑Ⅱ，稀釋至MVD 濃度。

2.3.2 樣品干擾試驗(yàn)溶液制備

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1 支，檢查瓶肩以上是否有粉末，若有粉末則輕彈瓶壁使之落下，然后根據(jù)已有劃痕開啟工作標(biāo)準(zhǔn)品，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。然后用BET 水1.0 mL 溶解，在旋渦混勻器上混勻15 min，用供試品溶液于經(jīng)干烤除熱原的試管中進(jìn)行稀釋，逐步稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度。

對(duì)應(yīng)內(nèi)毒素單位分別為0.125 EU/mL、0.06 EU/mL、0.03 EU/mL 和0.015 EU/mL。

2.3.3 鱟試劑標(biāo)識(shí)靈敏度對(duì)照系列溶液

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水代替珍珠巖溶液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至2λ、λ、0.5λ、0.25λ濃度。陰性對(duì)照為BET 水。

2.3.4 加樣

取規(guī)格為0.1 mL/支的鱟試劑28 支。每支加入0.1 mL 檢查用水溶解，充分溶解后將鱟試劑溶液混合一起。

分別加入已制備好的上述溶液0.1 mL 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶好的鱟試劑中。2λ、λ、0.5λ、0.25λ的樣品干擾試驗(yàn)溶液每一濃度加4 支管，2λ、λ、0.5λ、0.25λ的鱟試劑標(biāo)識(shí)靈敏度對(duì)照系列溶液每一濃度加2 支管，取2 支管加入BET 水作為陰性對(duì)照，加樣體積均為0.1 mL。取2 支管加入珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素檢查溶液，加樣體積均為0.1 mL，見表1。

2.3.5 保溫

加樣結(jié)束后，將鱟試劑混勻，37 ℃保溫60 min±2 min。

2.3.6 觀察并記錄結(jié)果

將鱟試劑管從電熱恒溫水浴箱中輕輕取出，倒轉(zhuǎn)180°且動(dòng)作須輕緩，若管內(nèi)形成的凝膠不變形、滑脫者為陽(yáng)性，記錄（+）；未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形、滑脫者為陰性，記錄（-）。

2.3.7 結(jié)果判定

當(dāng)溶液A 和D 所有平行管都為陰性，并且溶液C的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)要求時(shí)，試驗(yàn)方為有效。當(dāng)溶液B 的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核要求時(shí)認(rèn)為獲取的珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素檢查溶液無干擾作用。其他情況則認(rèn)為存在干擾作用。

2.3.8 試驗(yàn)方法與結(jié)果

取珍珠巖2.0 g，加入16.0 mL 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，充分混勻后于離心機(jī)中4 000 r/min 離心10 min，取上清液2.2 mL 加入稀釋劑Ⅱ2.2 mL，混勻作為珍珠巖溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 鱟試劑標(biāo)識(shí)靈敏度對(duì)照溶液實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過以上試驗(yàn)結(jié)果可知，珍珠巖采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋8 倍充分混勻后于離心機(jī)中4 000 r/min離心10 min，取上清液適量與等量稀釋劑Ⅱ混勻后所得供試品溶液能很好地排除干擾，珍珠巖在上述處理方式下對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查無干擾作用，珍珠巖干擾實(shí)驗(yàn)成立。

2.4 干擾實(shí)驗(yàn)

2.4.1 珍珠巖未經(jīng)干烤

取樣品2.0 g，加入16.0 mL 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，充分混勻后于離心機(jī)中4 000 r/min 離心10 min，取上清液2.2 mL 加入稀釋劑Ⅱ2.2 mL，混勻作為供試品溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 珍珠巖未經(jīng)干烤干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 珍珠巖經(jīng)180 ℃保持3 h 干烤

為了去除珍珠巖中細(xì)菌內(nèi)毒素，樣品經(jīng)180 ℃保持3 h 干烤后樣品取樣品2.0 g，加入16.0 mL 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，充分混勻后于離心機(jī)中4 000 r/min 離心10 min，取上清液2.2 mL 加入稀釋劑Ⅱ2.2 mL，混勻作為供試品溶液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 樣品經(jīng)180 ℃保持3 h 干烤干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過以上試驗(yàn)結(jié)果，得出樣品經(jīng)180 ℃保持3 h干烤后與未經(jīng)180 ℃保持3 h 干烤實(shí)驗(yàn)均有效，供試品在該濃度下無干擾作用，珍珠巖干擾試驗(yàn)成立。

2.4.3 正式干擾試驗(yàn)

使用3 批不同批號(hào)鱟試劑及未前期處理（未經(jīng)過180 ℃保持3 h 干烤去除細(xì)菌內(nèi)毒素）的兩批不同批號(hào)珍珠巖按照干擾試驗(yàn)的操作步驟進(jìn)行試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

鱟試劑靈敏度對(duì)照系列溶液的結(jié)果符合鱟試劑靈敏度復(fù)核要求，試驗(yàn)有效。樣品珍珠巖干擾試驗(yàn)系列溶液中所有試驗(yàn)中陰性對(duì)照溶液和樣品溶液的所有平行管均為陰性，最大濃度2λ的4 管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ的4 管均為陰性，供試品珍珠巖在該濃度下無干擾作用。鱟試劑批號(hào)為1812263 的標(biāo)示靈敏度對(duì)照系列的陽(yáng)性結(jié)果與樣品干擾試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果一致，并符合鱟試劑靈敏度復(fù)核要求，因此檢驗(yàn)結(jié)果無異常。

3 結(jié)論

（1）檢測(cè)珍珠巖細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試劑選擇標(biāo)示靈敏度為0.06 EU/mL。（2）將供試品加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將供試品稀釋8 倍混勻4 000 r/min 離心10 min 提取后，選擇經(jīng)過驗(yàn)證不含內(nèi)毒素和干擾因子的稀釋劑Ⅱ與供試品按照1 ∶1 的比例進(jìn)行稀釋，能排除樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾。