食品微生物檢測技術(shù)應(yīng)用探討

尹 超，李昱鼎，曾 蕾，張及亮，余雅芹

（1.中國檢驗認證集團湖北有限公司，湖北武漢 430056；2.湖北中檢檢測有限公司，湖北武漢 430056）

食源性疾病對公共健康安全構(gòu)成威脅，建立科學(xué)的食品微生物檢測體系對于保障食品安全極為重要。近年來，各種先進的檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)，只有選擇符合實際情況的檢測方法，才能發(fā)揮最大效果。

1 食品微生物檢測的重要性

食品中的有害微生物可以導(dǎo)致食源性疾病，如由細菌、病毒引起的各種食物中毒事件。其中，沙門氏菌、李斯特菌、大腸桿菌O157∶H7等食源性細菌能夠在消費者體內(nèi)生長和繁殖，輕則出現(xiàn)輕微的腸胃不適，重則會出現(xiàn)嚴重的健康問題，甚至死亡。食品微生物污染會影響食品的質(zhì)量和保質(zhì)期，某些微生物可以分解食品中的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等營養(yǎng)成分，從而改變食品的口感、顏色、氣味，影響食用。某些微生物在食品中生產(chǎn)的毒素，如霉菌所產(chǎn)生的黃曲霉毒素，不僅對人體有害，而且通過加熱和常規(guī)的食品加工過程難以消除。因此，食品微生物檢測對保障食品安全、預(yù)防食源性疾病具有重要意義[1]。對食品進行微生物檢測可以監(jiān)控食品在生產(chǎn)流通過程中的衛(wèi)生狀況，及時發(fā)現(xiàn)問題并采取糾正措施。通過檢測結(jié)果判斷食品是否達到微生物指標的標準，是否安全可供食用。食品微生物檢測還可為病原微生物的流行病學(xué)調(diào)查提供線索，追蹤微生物污染的來源，以控制疾病的傳播。

總之，建立科學(xué)合理的食品微生物檢測體系，選擇適當?shù)臋z測技術(shù)，提高檢測范圍和檢測頻次，有助于完善整個食品安全監(jiān)管網(wǎng)絡(luò)，保護公眾健康。

2 食品微生物檢測技術(shù)發(fā)展概況

食品微生物檢測技術(shù)的發(fā)展脈絡(luò)始于早期的傳統(tǒng)檢測方法，逐漸延伸至當今的先進的快速檢測技術(shù)。在早期，食品微生物的檢測主要依賴于微生物培養(yǎng)技術(shù)，包括群體計數(shù)法、多菌種混合分離等[2]。這些方法將食品樣品接種到特定的培養(yǎng)基上，在適宜的溫度和環(huán)境條件下孵化，等待微生物生長。幾天后，觀察和計數(shù)微生物菌落，確定樣品中的微生物數(shù)量。顯微鏡用于觀察細菌的形態(tài)特征，幫助識別不同的微生物種類。雖然這些方法經(jīng)久不衰，且在某些情境下仍然被視為金標準，但它們通常需要的時間較長、操作煩瑣，并且受到多種因素的影響。新型的快速檢測技術(shù)在近幾十年得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。免疫學(xué)方法利用特異性抗體與目標微生物之間的結(jié)合反應(yīng)檢測微生物的存在。酶聯(lián)免疫吸附測定（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是廣泛使用的免疫學(xué)檢測技術(shù)，結(jié)果準確、快速、靈敏度較高。分子生物學(xué)技術(shù)，如聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）、DNA微陣列、高通量測序等，已經(jīng)革命性地改變了食品微生物檢測的方式。PCR在數(shù)小時內(nèi)進行微生物的基因檢測，并且能夠準確地檢測到低至幾個細胞的微生物。此外，電化學(xué)、光學(xué)等傳感技術(shù)的應(yīng)用使生物傳感器成為食品安全快速監(jiān)測的重要工具。隨著納米生物傳感器的發(fā)展，食品微生物檢測向更快速、更便攜化的方向演進。這些新技術(shù)彌補了傳統(tǒng)檢測的不足，極大地拓展了食品微生物檢測的范圍。但任一技術(shù)都存在局限性，必須根據(jù)不同檢測目的，選擇適宜的技術(shù)手段，才能保證結(jié)果的準確可靠。

3 食品微生物檢測技術(shù)

食品微生物的多樣性要求檢測技術(shù)具有廣泛的適應(yīng)性和特異性，如細菌、病毒等不同的微生物群體有特有的生物學(xué)特征，需要使用特定的檢測方法。

3.1 分子生物學(xué)技術(shù)

分子生物學(xué)在食品微生物檢測中所起的作用越來越大，尤其在追蹤和鑒定食品中潛在的病原體時。其中，PCR技術(shù)尤為突出?；谄鋵δ繕薉NA序列的高度擴增能力，這項技術(shù)已經(jīng)在食品安全檢測領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用。

PCR基本原理建立在DNA的指數(shù)級擴增之上。通過反應(yīng)條件的逐步變化，如變性、退火、延伸等，特定的DNA片段在短時間內(nèi)得到大量復(fù)制。此外，為了達到高度的擴增效率和特異性，需要設(shè)計一對能與目標DNA片段兩端完美結(jié)合的引物。這種特異性結(jié)合確保了只有對應(yīng)的DNA片段得到擴增，從而排除了非特異性產(chǎn)品的干擾。一旦PCR反應(yīng)完成，產(chǎn)物可以通過多種方法進行檢測。其中，凝膠電泳是最常用的方法，可以通過電流作用將DNA分子按大小排序。如果樣品中的DNA被成功擴增，研究人員可以在凝膠上看到一個明確的條帶[3]。

以PCR技術(shù)用于檢測乳制品中是否存在致病的沙門氏菌為例，實驗步驟如下。

①樣品預(yù)處理與DNA提取。將肉制品樣本進行適當?shù)木|(zhì)處理，使用專用的DNA提取試劑盒從樣本中提取微生物DNA。②引物設(shè)計。選擇與沙門氏菌特有的基因序列相對應(yīng)的一對引物，確保只有目標細菌的DNA會在PCR過程中被擴增。③PCR混合物制備。將提取的DNA、前述引物、特定的核苷酸、適當?shù)木彌_液以及DNA聚合酶混合在一起，形成PCR反應(yīng)體系。④PCR擴增。將上述混合物放入PCR儀中，并設(shè)置適當?shù)淖冃?、退火、延伸溫度，進行25～35個循環(huán)，使目標DNA片段得到大量擴增。⑤產(chǎn)品檢測。通過凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。如果肉制品樣本中存在沙門氏菌，那么凝膠上將出現(xiàn)一個與預(yù)期大小相符的明確條帶。

盡管PCR技術(shù)在食品微生物檢測中具有顯著的優(yōu)勢，但其在實際應(yīng)用中還面臨一些挑戰(zhàn)。為了確保結(jié)果的可靠性，必須從樣品中有效地提取出高質(zhì)量的DNA，因為DNA的質(zhì)和量會直接影響PCR的效果。此外，引物的設(shè)計、反應(yīng)體系的優(yōu)化、PCR儀器的性能都是決定檢測效果的關(guān)鍵因素。因此，在使用PCR進行食品微生物檢測時，必須綜合考慮這些因素，確保獲得可靠和準確的結(jié)果。

3.2 免疫學(xué)檢測技術(shù)

免疫學(xué)檢測技術(shù)基于抗原與抗體之間的特異性結(jié)合反應(yīng)。在自然界中，抗體由生物體的免疫系統(tǒng)生成，用以識別和中和外部入侵的物質(zhì)，如細菌、病毒或其他外部蛋白質(zhì)，這些被識別的物質(zhì)稱為抗原。利用這種天然的、高度特異性的抗原-抗體親和作用，免疫學(xué)檢測技術(shù)能夠?qū)μ囟ǖ奈镔|(zhì)進行識別和定量[4]。其中，ELISA是最常用的免疫學(xué)檢測方法之一。其利用與目標抗原結(jié)合的抗體實現(xiàn)抗原的檢測，該抗體上連接有一個可以產(chǎn)生顏色反應(yīng)的酶。在生雞肉或牛肉食品中，如果懷疑存在沙門氏菌污染，ELISA可以作為一種快速篩查工具。

在篩查過程中，經(jīng)過特殊處理的沙門氏菌特異性抗體被固定到ELISA板上，將待測食品樣品中的提取物加入每一個孔中。如果樣品中存在沙門氏菌，抗原會與板上的抗體結(jié)合。將另一種標記有酶的抗沙門氏菌抗體加入板中，這些抗體會結(jié)合到任何已經(jīng)與固定抗體結(jié)合的沙門氏菌上。加入含有該酶底物的溶液，酶與底物作用，會產(chǎn)生一個可測量的顏色反應(yīng)，顏色的強度與樣品中沙門氏菌的數(shù)量成正比。

使用ELISA技術(shù)，實驗室可以在幾小時內(nèi)確定食品樣品中是否存在沙門氏菌，這種快速的反饋能夠幫助食品生產(chǎn)商迅速做出決策，召回可能受污染的產(chǎn)品，從而更好地保護消費者的健康。雖然ELISA技術(shù)為食品微生物的檢測提供了一個高度敏感和特異性的工具，但它也有一些局限性和缺點。①雖然抗體和抗原之間的親和作用具有高度的特異性，但有時可能會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，即抗體可能與非目標抗原結(jié)合，導(dǎo)致誤報。②ELISA的結(jié)果會受到樣品中其他成分的干擾，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、鹽，這些成分會影響抗原-抗體的結(jié)合或酶的活性。因此，需對該方法的結(jié)果進行更仔細的解釋，并考慮使用其他確認方法驗證其準確性。

3.3 生物傳感器技術(shù)

生物傳感器的核心原理是利用生物分子的高度特異性與傳統(tǒng)傳感器技術(shù)的集成，為食品微生物的檢測提供方便。在這一技術(shù)中，生物識別元件起到了至關(guān)重要的作用。為識別特定的病原菌，可以利用相應(yīng)的抗體。當這些抗體遇到目標微生物時，會迅速且特異地結(jié)合，形成一個明確的抗原-抗體復(fù)合物[5]。

當選擇了生物識別元件并進行了適當?shù)膬?yōu)化后，接下來的關(guān)鍵步驟是固定。為了確保傳感器上的生物分子仍保持其固有的活性，一般會選擇使用特殊的連接劑或納米顆粒。既可確保生物分子與傳感器表面的緊密結(jié)合，也可避免對其活性造成破壞。當食品樣品與傳感器接觸時，任何存在的目標微生物都會與傳感器表面的生物識別元件結(jié)合，這種結(jié)合會引發(fā)傳感器的一系列物理或化學(xué)變化。在電化學(xué)傳感器中，會觀察到電流或者電阻的變化；在光學(xué)傳感器中，會有光強度的改變或者波長的偏移；在熱敏傳感器中，可以記錄到溫度的微小變動。這些信號的變化與微生物的濃度成正相關(guān)，因此可以提供準確的定量分析數(shù)據(jù)。生物傳感器在食品微生物檢測中的具體應(yīng)用步驟如下。①樣品前處理。將食品樣品進行適當?shù)奶幚恚x心、過濾或稀釋，以獲取含有微生物的溶液。②樣品加載。將處理后的樣品引入到生物傳感器上。③結(jié)合。給予足夠的時間，以便生物識別元件與目標微生物結(jié)合。④洗滌。移除未結(jié)合的物質(zhì)，減少非特異性信號。⑤讀取信號。分析傳感器的信號變化，以確定微生物的存在和數(shù)量。⑥結(jié)果解釋。根據(jù)得到的數(shù)據(jù)，使用預(yù)先建立的標準曲線估算樣品中微生物的濃度。

生物傳感器技術(shù)為食品微生物檢測帶來了很多便利，但還存在一些問題。例如，該技術(shù)對試劑的穩(wěn)定性要求較高，傳感器使用壽命有限，生物識別元件需要不斷優(yōu)化。隨著科技的進步，相關(guān)研究者可以繼續(xù)改進這種技術(shù)，使其發(fā)揮更大的作用，更好地確保食品安全。

4 結(jié)語

食品微生物檢測技術(shù)不斷推陳出新，為確保食品安全提供了有力保障。但任一技術(shù)都存在局限性，必須綜合考量檢測目的、樣本基質(zhì)、成本效益等因素，選擇最佳方案。不同技術(shù)可以相互補充、組合應(yīng)用，以發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。隨著檢測技術(shù)與儀器的優(yōu)化，食品微生物檢測必將更快速、準確、高效。此外，還需建立標準化的檢測流程，培養(yǎng)專業(yè)檢測人才，以保證檢測結(jié)果的可靠性。只有系統(tǒng)規(guī)范地應(yīng)用檢測技術(shù)，才能構(gòu)筑完善的食品安全防線，有效保護公眾健康。