人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)大鼠卵巢早衰模型治療效果的研究

杜小倩,張艷麗,丁 勇,曹 琦,李華鋒,趙振峰,馬春玲,4#

(1濱州醫(yī)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264003;2臨沂市婦幼保健院;3山東翰康生物科技有限公司;4山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,山東 臨沂 276000)

卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是指女性在40歲之前出現(xiàn)卵巢功能障礙的綜合征,主要表現(xiàn)為促性腺激素升高和雌激素水平降低,導(dǎo)致女性出現(xiàn)圍絕經(jīng)期癥狀,身體多器官臟器功能受到影響,目前臨床尚無(wú)根本性恢復(fù)卵巢功能的治療方法。外泌體是由活細(xì)胞分泌的直徑約30～150 nm的細(xì)胞外囊泡,為細(xì)胞信號(hào)分子,可以選擇性攜帶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、microRNA、mRNA等進(jìn)入細(xì)胞,從而影響細(xì)胞功能。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體(huMSCs-exo)因無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議、發(fā)揮作用迅速、低免疫原性、無(wú)成瘤性、易保存和運(yùn)輸,安全性更高,而受到研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。本研究旨在探討huMSCs-exo對(duì)大鼠POF模型的治療效果,從而為提供POF的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 8周齡清潔級(jí)雌性SD大鼠15只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司),體質(zhì)量(220±10)g,全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料,室溫22～25℃,相對(duì)濕度35%～55%,模擬正常晝夜生理節(jié)律,予12 h光照,自由飲水和進(jìn)食。本研究均符合臨沂市婦幼保健院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)動(dòng)物研究指導(dǎo)原則。

1.2主要試劑和設(shè)備 順鉑注射液(齊魯制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字:H20040813);大鼠E2、FSH、LH雌激素ELISA試劑盒(武漢菲恩生物科技有限公司);濾光片型光吸收酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular 公司, CMax Plus);Leica EG1150包埋機(jī)、Leica RM2235切片機(jī)、Leica HI1210攤片機(jī)、Leica HI1220烘片機(jī)、Leica CV5030全自動(dòng)玻璃蓋片機(jī)和Leica ST5010病理染色機(jī)(德國(guó)Leica Biosystems Nussloch GmbH公司);BX43顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3方法

1.3.1HuMSCs-exo的分離和鑒定 HuMSCs-exo來(lái)源于足月妊娠剖宮產(chǎn)胎兒的臍帶。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取出新鮮臍帶,PBS反復(fù)清洗,去掉臍帶動(dòng)脈和表面羊膜,剪成直徑約1.5 mm大小的組織塊,5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待間充質(zhì)干細(xì)胞爬出組織,去除組織塊,用0.25%胰酶消化,傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)上清液離心除去細(xì)胞碎片、死細(xì)胞等雜質(zhì)后得到外泌體沉淀,棄去上清液,加入PBS得到外泌體,分裝后于-80℃冰箱保存。HuMSC-exo的鑒定:透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài),納米顆粒跟蹤分析儀分析粒徑大小,Western Blot檢測(cè)標(biāo)記蛋白。

1.3.2動(dòng)物模型構(gòu)建 將15只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組,各5只鼠。其中B、C兩組每周一次將順鉑(4 mg/kg)通過(guò)腹腔注射到大鼠體內(nèi)進(jìn)行造模,持續(xù)2周,A組同時(shí)間注射等體積生理鹽水。

1.3.3外泌體治療方法 造模完成后,于次日開(kāi)始C組注射huMSCs-exo懸液1 mL(0.75 mg/mL)治療,其他兩組注入等體積生理鹽水,1次/d,直至第18天將其處死。

1.4指標(biāo)評(píng)定 大鼠的行為觀察:造模后,每日對(duì)比觀察各組大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、被毛光澤、對(duì)外界的反應(yīng)和進(jìn)食量等。體重測(cè)量:造模前1 d、自造模之日開(kāi)始每周測(cè)量大鼠體重。促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、雌二醇(E2):各組大鼠造模前1 d、第14、18天行眼眶取血,分離血清,ELISA法檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1HuMSC-exo的鑒定 電鏡下外泌體呈扁圓形、球形或杯狀的形態(tài)(見(jiàn)封三圖1),其平均粒徑為81.9 nm,粒徑主峰73.0 nm,原液濃度4.02×1010粒子/mL(見(jiàn)封三圖2);通過(guò)Western Blot檢測(cè)分析,特異性標(biāo)志蛋白分子CD9、CD81、HSP70為陽(yáng)性(見(jiàn)封三圖3)。

2.2大鼠行為學(xué)改變 A組:大鼠無(wú)明顯異常表現(xiàn),精神狀態(tài)良好,進(jìn)食量正常,活動(dòng)敏捷,皮毛光滑。B、C組:隨著給藥時(shí)間的推移,絕大部分進(jìn)食逐漸減少,形體逐漸消瘦,反應(yīng)遲鈍,對(duì)外界反應(yīng)淡漠,皮毛暗淡,毛發(fā)蓬松。至給藥結(jié)束時(shí),3組大鼠均未出現(xiàn)死亡。

2.3體重變化 隨喂養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)時(shí)間,A組大鼠體重呈增高趨勢(shì),B、C組呈遞降趨勢(shì)。見(jiàn)表1。

表1 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)體重變化

2.4E2、FSH、LH水平 隨時(shí)間的延長(zhǎng),各組激素水平變化見(jiàn)表2。

表2 三組大鼠不同時(shí)點(diǎn)血清FSH、LH、E2水平的比較

3 討論

近年來(lái),POF的發(fā)病率呈上升趨勢(shì),是女性不孕的主要原因之一。臨床多采用激素替代療法,在一定程度上改善患者生活質(zhì)量,但不能恢復(fù)卵巢功能[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是具有自我更新潛力和分化成各種特化細(xì)胞類型能力的成體多能祖細(xì)胞,于1966年首次從骨髓中發(fā)現(xiàn),隨后在成人其他組織如脂肪、牙髓、胎盤(pán)、羊水、臍帶血中均有發(fā)現(xiàn)[3]。目前,MSCs已在組織再生領(lǐng)域的研究中顯示出了明顯的療效,然而因其致瘤風(fēng)險(xiǎn)和倫理道德?tīng)?zhēng)議[4-5],其臨床應(yīng)用受到一定制約。有研究發(fā)現(xiàn),MSCs釋放的外泌體在減少細(xì)胞損傷、增強(qiáng)修復(fù)作用方面具有與MSCs同樣的作用。各種細(xì)胞來(lái)源的外泌體可通過(guò)多種途徑與不同的靶細(xì)胞相互作用,包括直接結(jié)合、吞噬、直接融合和內(nèi)吞,然后產(chǎn)生特異的治療效果。Jeongyeon Heo等研究發(fā)現(xiàn),外泌體在內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞類型之間進(jìn)行物質(zhì)交換對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的改善作用[6]。另外,在癌癥、神經(jīng)退行性疾病、代謝性疾病以及免疫性炎癥等疾病中外泌體也具有一定的治療作用[7-9]。在利用間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體治療POF模型的研究中發(fā)現(xiàn),骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體攜帶的miR-644-5p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)p53抑制了POF小鼠的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[10]。這些證據(jù)有力說(shuō)明了外泌體有望成為治愈POF的一個(gè)新型療法。

本研究中利用huMSCs來(lái)源的外泌體對(duì)順鉑誘導(dǎo)的POF大鼠模型進(jìn)行治療,結(jié)果顯示,huMSCs-exo治療后三種激素的水平都有改變,與正常對(duì)照組的水平接近,證明huMSCs-exo具有改善卵巢功能的作用。這充分證明了huMSCs-exo在POF治療中的潛力,然而目前仍處于探索階段,還需對(duì)其發(fā)揮作用的機(jī)制和劑量的標(biāo)準(zhǔn)化方案方面進(jìn)行探討和驗(yàn)證。