基于公共數(shù)據(jù)庫分析VSIG4在結(jié)直腸癌中的表達及意義*

李輝，馬輝，溫佳穎，唐宇星，黃志廣△

1 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科 廣西南寧 530021

2 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院放療科 廣西南寧 530007

3 廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科 廣西南寧 530021

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。研究顯示CRC 的發(fā)病主要與年齡、環(huán)境以及家族遺傳這三個因素有關(guān)[3-4]。由于缺乏早期特征性癥狀以及腸鏡檢查依從性低，多數(shù)CRC 首診時即為中晚期。目前CRC 的標準治療方法包括手術(shù)治療、化療和放療。然而，近年來免疫治療在多種癌癥的治療中取得了較為理想的療效，特別是對于非小細胞肺癌和惡性黑色素瘤等[5-8]。在CRC 中，免疫檢查點阻斷僅對具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定型的亞群有效，而占比約90%的微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）型CRC 對免疫治療應答率較低[9-10]。如果能找到一種新的標志物或免疫治療的新通路，將為CRC 提供一種新的治療策略[11]，這對于CRC 的早診早治和靶向治療、免疫治療具有重要意義。

含V-set免疫球蛋白域蛋白4（V-set and immunoglobulin domain-containing protein 4，VSIG4）是免疫球蛋白超家族中的一員。在腫瘤患者中，VSIG4的過表達促進了U87-MG 膠質(zhì)母細胞的上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和遷移，可與Rab18 相互作用影響膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[12-13]。VSIG4還被證實是晚期胃癌患者預后不良的獨立預測因素[14]。VSIG4作為C3b/iC3b 的補體受體，還可以參與調(diào)節(jié)機體的免疫微環(huán)境[15]，通過作用于巨噬細胞的補體，調(diào)節(jié)多種免疫反應從而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[16]。雖然目前已有文獻報道VSIG4在CRC 中表達下調(diào)，但其在CRC的發(fā)生發(fā)展及患者預后中發(fā)揮的作用尚不明確[17]。

本研究對來源于多個公共數(shù)據(jù)庫中VSIG4的mRNA表達數(shù)據(jù)進行匯總分析，通過GO、KEEG 和GSEA（gene set enrichment analysis）富集分析進一步探索VSIG4的生物學作用和參與的信號通路，利用CIBERSORT算法分析VSIG4與免疫細胞浸潤的關(guān)系，并進一步探討VSIG4的表達對CRC患者預后的影響。

1 資料與方法

1.1 獲取和處理CRC mRNA數(shù)據(jù)集

本研究由兩名研究者對UCSC XENA、GTEx、GEO 和TCGA 等數(shù)據(jù)庫中的CRC mRNA 數(shù)據(jù)集進行檢索和篩選。GEO 數(shù)據(jù)庫的檢索詞包括colorectal、colon、 rectum、 mRNA、 messenger RNA、 cancer、tumor、carcinoma。TCGA 數(shù)據(jù)庫的CRC mRNA 數(shù)據(jù)集和GTEx數(shù)據(jù)庫的正常結(jié)直腸組織樣本mRNA數(shù)據(jù)集均從UCSC XENA 數(shù)據(jù)庫中直接獲得。本研究在UCSC XENA 數(shù)據(jù)庫中直接選擇TCGA Colon and Rectal Cancer（COADREAD）和GTEx 記錄進行對應表達矩陣的下載。所有納入的數(shù)據(jù)均符合以下標準：（1）物種為智人；（2）樣本類型為組織；（3）每組樣本數(shù)量不低于3例。隨后對納入的mRNA數(shù)據(jù)集進行l(wèi)og2標準化。R 軟件（4.0.5 版）的SVA 包（3.36.0 版）用于合并相同平臺的mRNA 數(shù)據(jù)集并去除批次效應。本研究所有數(shù)據(jù)的檢索工作均截止于2022年12月。

1.2 分析VSIG4在CRC中的表達

GraphPad Prism 軟件（8.0.2 版）和R 軟件的Ggplot2 包（3.3.5 版）用于繪制箱型圖和受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線以研究VSIG4的表達情況及其區(qū)分CRC 樣本和非癌對照組樣本的檢驗效能。隨后本研究通過Stata 軟件（16.0 版） 計算標準化均數(shù)差（standardized mean difference，SMD） 和生成集成受試者工作特征（summary receiver operating characteristic，SROC）曲線以整合分析所有納入的數(shù)據(jù)。敏感性分析和Egger’s 檢驗分別用于檢驗納入mRNA 數(shù)據(jù)集的異質(zhì)性和發(fā)表偏移。

1.3 獲取VSIG4的正相關(guān)基因

Pearson 相關(guān)性分析由R 軟件的“Cor.test”函數(shù)執(zhí)行，篩選標準：Person’sr＞0.5 和P＜0.05。隨后對篩選出的基因取交集，在所有mRNA 數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)8次及以上的基因被認為是VSIG4的正相關(guān)基因。

1.4 探索VSIG4的生物學功能及信號通路

利用R 軟件的Org.Hs.eg.db 包（3.1.0 版）進行基因的GO 注釋，并從KEGG rest API （https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html） 獲取最新的“KEGG pathway”基因注釋，以此作為背景將VSIG4及其正相關(guān)基因映射到背景集合中。R軟件的ClusterProfiler包（3.14.3 版）用于執(zhí)行富集分析，并可視化GO 分析中P值最小的前10個GO術(shù)語。本研究依據(jù)VSIG4mRNA表達值將TCGA mRNA數(shù)據(jù)集的CRC樣本分為高VSIG4mRNA表達組（VSIG4mRNA表達值≥表達值中位數(shù)） 和低VSIG4mRNA 表達組（VSIG4mRNA表達值＜表達值中位數(shù)），隨后通過GSEA軟件（3.0版）和h.all.v7.4.symbols.gmt 子集合進行GSEA分析。P＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25的術(shù)語被認為具有統(tǒng)計學意義。

1.5 探索VSIG4與免疫細胞浸潤的關(guān)系

為進一步探索VSIG4與免疫細胞浸潤的關(guān)系，本研究使用R 軟件的IOBR 包（0.99.9 版） 中的CIBERSORT 算法對TCGA mRNA 數(shù)據(jù)集的每個CRC樣本相關(guān)免疫細胞浸潤進行評分。分組依據(jù)同1.4，使用SPSS 26.0軟件進行秩和檢驗比較兩組間免疫浸潤評分的差異，通過Ggplot2包進行差異的可視化。

1.6 分析VSIG4對患者預后的影響

為評估VSIG4在CRC 患者中作為預后指標的潛力，本研究在GEO 數(shù)據(jù)庫中重新檢索和篩選了包括總生存期（overall survival，OS）信息的CRC mRNA數(shù)據(jù)集，并納入了TCGA 數(shù)據(jù)庫中包含OS 信息的CRC 樣本，要求納入的mRNA 數(shù)據(jù)集總患者數(shù)量不低于50例。上述檢索工作截止于2022年12月。

隨后，同樣以每個mRNA 數(shù)據(jù)集的VSIG4mRNA表達值中位數(shù)為截斷值進行分組，利用R軟件的Survival包（3.2.13版）、Survminer包（0.4.9版）繪制Kaplan-Meier 曲線，進行Cox 分析，并計算每個mRNA數(shù)據(jù)集的風險比（hazard ratio，HR）和95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）。為綜合評估VSIG4對CRC患者預后的整體影響，本研究采用Stata軟件匯總分析所有納入mRNA數(shù)據(jù)集的HR和95%CI。

2 結(jié)果

2.1 VSIG4在CRC中表達下調(diào)

本研究從多個公共數(shù)據(jù)庫中檢索并納入了2 265例CRC 樣本和1 259 例正常結(jié)直腸組織樣本（圖1）。納入mRNA數(shù)據(jù)集的基礎信息如表1所示。

表1 本研究納入的所有mRNA數(shù)據(jù)集特征信息

圖1 檢索符合納入標準的CRCmRNA數(shù)據(jù)集的過程

箱型圖提示在約50%的mRNA 數(shù)據(jù)集中，VSIG4在CRC 樣本中表達下調(diào)（P＜0.05）（圖2）。在GSE126092、GSE20842 和GSE156355 數(shù)據(jù)集的ROC曲線中AUC＞0.8（P＜0.05）（圖3）。基于3 524例樣本的mRNA 數(shù)據(jù)集匯總分析結(jié)果如圖4。分析結(jié)果提示VSIG4在CRC 中表達下調(diào)（SMD＝-0.60，95%CI為-0.86～-0.34；圖4A），所有納入本研究的數(shù)據(jù)集間無明顯異質(zhì)性及發(fā)表偏倚（圖4B、圖4C）。SROC曲線提示VSIG4具有良好的區(qū)分CRC 樣本和正常結(jié)直腸組織樣本的能力（AUC＝0.75，敏感度為0.65，特異度為0.79；圖5）。

圖2 CRC組和非癌對照組中VSIG4 mRNA的表達分析結(jié)果

圖3 CRC mRNA數(shù)據(jù)集的ROC曲線

圖4 所有樣本的mRNA數(shù)據(jù)集匯總分析結(jié)果

圖5 VSIG4表達情況的SROC曲線分析結(jié)果

2.2 VSIG4在CRC中的生物學功能及通路

對Pearson相關(guān)性分析結(jié)果進行篩選并取交集后，總共有212個基因在所有mRNA數(shù)據(jù)集中出現(xiàn)8次及以上，這些基因被認為是VSIG4的正相關(guān)基因。對這些基因進行后續(xù)分析，GSEA富集分析結(jié)果如圖6所示，分析結(jié)果提示VSIG4的表達與MYC靶點V2（MYC targets V2）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、MYC靶點V1（MYCtargets V1）、IL2/STAT5信號傳導（IL2 STAT5 signaling）、KRAS信號傳導上調(diào)（KRASsignaling up）和細胞凋亡（apoptosis）等腫瘤相關(guān)信號通路相關(guān)（圖6A、圖6B）。GO 功能富集分析顯示，VSIG4主要富集在細胞外基質(zhì)（extracellular matrix）、細胞表面（cell surface）、囊泡（vesicle） 和質(zhì)膜（plasma membrane part）等部位，參與調(diào)控免疫反應（regulation of immune response）、防御反應（defense response）和調(diào)控應激反應（regulation of response to stimulus）等生物過程，并影響信號受體結(jié)合（signaling receptor binding）、信號受體的活性（signaling receptor activity）和分子傳遞者的活性（molecular transducer activity）等（圖7）。KEGG富集分析結(jié)果如圖8所示，分析結(jié)果提示VSIG4參與許多重要的信號通路，包括補體和凝血級聯(lián)反應（complement and coagulation cascades）、金黃色葡萄球菌感染（staphylococcus aureus infection）、吞噬體（phagosome）、百日咳（pertussis）、成骨細胞分化（osteoclast differentiation）等（圖8A）。

圖6 VSIG4的GSEA富集分析結(jié)果

圖7 VSIG4及其正相關(guān)基因的GO富集分析結(jié)果

2.3 VSIG4的表達與TIME有關(guān)

CIBERSORT 分析的結(jié)果顯示，M0巨噬細胞（M0 macrophages）、M1巨噬細胞（M1 macrophages）、M2巨噬細胞（M2 macrophages）、靜息型肥大細胞（resting mast cells）和中性粒細胞（neutrophils）的浸潤在VSIG4mRNA高表達組相對增多。VSIG4mRNA低表達組的初級B 細胞（naive B cells）、漿細胞（plasma cells）、CD4 靜息記憶T 細胞（CD4 resting memory T cells）、活化NK細胞（activated natural killer cells）、單核細胞（monocytes）、活化樹突狀細胞（activated dendritic cells）和活化肥大細胞（activated mast cells）的浸潤程度高于VSIG4mRNA高表達組（圖8B）。

2.4 VSIG4的高表達提示CRC患者預后不良

為研究VSIG4的表達與CRC 患者預后的關(guān)系，本研究從GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫中重新收集了970 例CRC患者樣本的OS數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖9所示。Kaplan-Meier 曲線可見（圖9A～圖9F），VSIG4mRNA 高表達組的CRC 患者相對于VSIG4mRNA 低表達組的CRC 患者有預后不良的趨勢，但預后差異并沒有顯著的統(tǒng)計學差異。因此，我們繼續(xù)對上述970例CRC患者Cox 分析的所有HR和95%CI進行了匯總分析，結(jié)果顯示VSIG4的表達上調(diào)是CRC 患者的預后危險因素（HR＝1.40，95%CI為1.09～1.78；圖9G）。

圖9 970例CRC患者OS的預后分析結(jié)果

3 討論

本研究基于公共數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)VSIG4在CRC 中低表達，并且能較好地區(qū)分CRC 和正常結(jié)直腸組織。MYC靶點V2、氧化磷酸化、MYC靶點V1、IL2/STAT5信號傳導、KRAS信號傳導上調(diào)和細胞凋亡等腫瘤相關(guān)信號通路可能是誘發(fā)CRC 發(fā)生發(fā)展的機制。在所有的CRC 患者中，進一步探索VSIG4與患者預后的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VSIG4低表達的患者預后更優(yōu)，這可能與腫瘤的免疫微環(huán)境密切相關(guān)。

VSIG4在多種癌癥中異常表達。Zhu 等[18]研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌中VSIG4的表達顯著下調(diào)，其表達水平與AFP 水平及腫瘤遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌患者的無病生存期有關(guān)。在卵巢癌中，VSIG4顯著過表達并影響卵巢癌的進展和復發(fā)[19]。本研究首次通過公共數(shù)據(jù)庫大樣本量綜合評估了CRC 中VSIG4mRNA 表達情況，基于3 524 例樣本的匯總分析證實VSIG4在CRC 中表達下調(diào)（SMD＝-0.60；95%CI為-0.86～-0.34），SROC 曲線分析結(jié)果提示VSIG4可較好地區(qū)分CRC 樣本和正常結(jié)直腸組織樣本，有作為CRC 診斷標志物的潛力。GSEA 分析發(fā)現(xiàn)VSIG4的表達與MYC靶點V2、氧化磷酸化、MYC靶點V1、IL2/STAT5信號傳導、KRAS信號傳導上調(diào)和細胞凋亡等腫瘤相關(guān)信號通路相關(guān)。MYC靶點V1、V2 信號通路可以調(diào)控MYC癌基因，MYC基因家族是人類癌癥中最常被激活的信號基因之一，其通過促進腫瘤細胞增殖和免疫逃逸來維持癌癥發(fā)展。靶向MYC基因相關(guān)通路不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增長，還可以恢復機體的免疫監(jiān)測功能[20]。氧化磷酸化是為結(jié)直腸癌細胞提供能量的主要代謝途徑之一，在CRC 中經(jīng)常發(fā)生突變的癌基因和抑癌基因（如KRAS、BRAF和p53）已經(jīng)被證明可通過驅(qū)動代謝底物的攝取和代謝來改變代謝通路[21]。細胞凋亡和增殖是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一對矛盾體，兩者間的動態(tài)平衡狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及浸潤轉(zhuǎn)移等生物學行為密切相關(guān)。結(jié)直腸黏膜上皮細胞增殖和凋亡在正常生理狀況下處于相對平衡而不斷更新的狀態(tài)，以保證其結(jié)構(gòu)和功能的完整性。一旦這種平衡被打破，組織結(jié)構(gòu)就有受到破壞或腫瘤形成的可能。因此，細胞凋亡通路也是研究CRC 發(fā)生發(fā)展的重要因素。

基于CIBERSORT 算法的免疫浸潤分析提示幼稚B 細胞、漿細胞、CD4 靜息記憶T 細胞、活化NK 細胞、單核細胞、活化樹突狀細胞和活化肥大細胞的浸潤水平在VSIG4低表達組中相對增多。CD4 靜息記憶T細胞具有記憶性，可以在再次遇到抗原時迅速激活并協(xié)助抗腫瘤免疫反應。NK細胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它們可以直接殺傷腫瘤細胞，參與天然免疫反應。樹突狀細胞在免疫反應中具有重要地位，活化狀態(tài)的樹突狀細胞可以呈遞抗原并激活T細胞，從而啟動抗腫瘤免疫反應。然而，肥大細胞、單核細胞卻能促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，研究證實在CRC 中，活化的黏膜肥大細胞產(chǎn)生的mMCP-1 通過調(diào)節(jié)CD11b+Gr1+細胞活性在結(jié)腸組織中的積累來抑制T細胞的活化，促進腫瘤細胞的生長[22-23]。在乳腺癌中，腫瘤細胞分泌CSF1誘導單核細胞表達和釋放CXCL7，進而介導FAK和MMP13信號通路促進乳腺癌細胞遷移和侵襲[24]。M0 巨噬細胞、M1 巨噬細胞、M2 巨噬細胞的免疫浸潤水平則在VSIG4低表達組中相對減少。M1巨噬細胞通過直接介導細胞毒性和抗體依賴的細胞介導的細胞毒性發(fā)揮抗腫瘤作用[25-26]。研究證實，在結(jié)腸癌中，M1 巨噬細胞顯著增加了脂肪組織干細胞中腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體表達，從而促進腫瘤干細胞凋亡和減少M2巨噬細胞群來抑制結(jié)腸癌的發(fā)展[27]。此外，也有研究證實，表達VSIG4的腫瘤相關(guān)巨噬細胞可作為抗腫瘤免疫的負細胞調(diào)節(jié)因子抑制腫瘤特異性CD8+T 細胞毒性[28]。因此，通過免疫藥物調(diào)控VSIG4相關(guān)的腫瘤免疫微環(huán)境有望成為CRC 免疫治療的新思路，但相關(guān)的機制還需要進一步的研究。

我們針對VSIG4表達與CRC 患者預后的關(guān)系的預后分析結(jié)果表明，VSIG4表達上調(diào)是CRC 患者預后的危險因素。Xu 等[29]的研究顯示在膠質(zhì)瘤中高表達VSIG4可以抑制免疫T淋巴細胞的活化，從而導致膠質(zhì)瘤的進展和預后較差，相反的，VSIG4低表達組預后較好。同樣的，在肺癌中，發(fā)現(xiàn)VSIG4通過連接T 細胞上未知的受體，可抑制CD4+和CD8+T 細胞增殖以及細胞因子（IL-2和IFN-γ）的產(chǎn)生[30]。所以我們推測在VSIG4低表達組中，可能由于免疫浸潤細胞的抗腫瘤作用大于促腫瘤發(fā)展的作用，從而使患者獲得較好的預后。

綜上所述，VSIG4在CRC 中表達下調(diào)并通過相應的腫瘤信號通路參與CRC 的發(fā)生，其與腫瘤免疫微環(huán)境和預后的相關(guān)性為我們開展進一步研究提供了新的思路。然而，本研究仍具有一定的局限性，所有的結(jié)果都是基于公共數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，在今后的研究中，我們將通過實驗進一步探索VSIG4在CRC中的作用機制。

利益沖突聲明全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。