黃瓜瓜類蚜傳黃化病毒的檢測與分析

張廣榮 孫述俊 文朝慧 何蘇琴

摘要：黃瓜是我國重要的蔬菜種類之一，目前已報(bào)道約36種病毒可侵染黃瓜，其中瓜類蚜傳黃化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus，CABYV）平均檢出率為0.65%。2021年9月在甘肅省白銀地區(qū)發(fā)生病毒病的黃瓜田，發(fā)現(xiàn)葉片呈現(xiàn)黃化、明脈癥狀黃瓜病株。為明確其病原，采集病株后，采用分子生物學(xué)方法對病樣進(jìn)行了檢測。RT-PCR及病毒CP基因序列測定分析結(jié)果表明，該病樣受到瓜類蚜傳黃化病毒Cucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV）的感染。這是繼2017年在甘肅酒泉市瓜州縣的甜瓜上檢測到CABYV后，在甘肅白銀市靖遠(yuǎn)縣的黃瓜上再次檢測到該病毒。

關(guān)鍵詞：黃瓜；瓜類蚜傳黃化病毒；病毒??；白銀市

中圖分類號：S436.42? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2023）11-1074-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2023.11.018

Report of Cucurbit Aphid-borne Yellows Virus Infecting Cucumbers

in Baiyin， Gansu Province

ZHANG Guangrong 1， SUN Shujun 1， WEN Zhaohui 2， HE Suqin 3

（1. Baiyin Station of Plant Protection and Quarantine， Baiyin Gansu 730900， China; 2. Technical Centre of Lanzhou

Customs District， Lanzhou Gansu 730010， China; 3. Institute of Plant Protection， Gansu Academy of

Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： Cucumis sativus is one of the important vegetable species in China. To date， nearly 36 viruses have been reported to be able to infect cucumber. Among them， the average detection rate of cucurbit aphid-borne yellows virus（CABYV） is 0.65%. In September 2021， a cucumber plot with viral disease occurred in the Baiyin， Gansu Province， and there was symptoms of yellowing and vein clearing on the leaves from cucumber-diseased plant. The disease strains were collected and tested using molecular biology methods to verify the pathogen. RT-PCR and viral CP gene sequencing analysis showed that the disease sample was infected by the CABYV. CABYV on melons was discovered firstly in Guazhou County， Jiuquan in 2017， which was noticed secondly on cucumbers in Baiyin of Gansu Province in September 2021.

Key words： Cucumis sativus; Cucurbit aphid-borne yellows virus; Virus disease; Baiyin

收稿日期：2023 - 05 - 09；修訂日期：2023 - 06 - 06

基金項(xiàng)目：蘭州海關(guān)科研項(xiàng)目（LK-2022-004）。

作者簡介：張廣榮（1965 —），男，甘肅鎮(zhèn)原人，高級農(nóng)藝師，主要從事日光溫室蔬菜病蟲害防治工作。Email： zgr0815@163.com。

黃瓜（Cucumis sativus）是我國重要的蔬菜種類之一，年均播種面積達(dá)122.97萬hm2，總產(chǎn)量約? 6 623.08萬t，播種面積及產(chǎn)量均居世界第1位［1 ］。黃瓜在生產(chǎn)過程中遭受多種病害侵?jǐn)_，已報(bào)道約36種病毒可侵染黃瓜［2 ］，在我國，劉勇等［3 ］采用斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附法（Dot-ELISA）、RT-PCR及PCR擴(kuò)增、小RNA測序分析等血清學(xué)和分子生物學(xué)方法，對全國范圍內(nèi)采集的3 283份黃瓜病毒病樣本進(jìn)行檢測，共檢測到19種病毒，其中檢出率最高的4種病毒為黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）和煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus， TMV），平均檢出率依次為28.97%、21.38%、14.35%和10.20%，而瓜類蚜傳黃化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus， CABYV）平均檢出率為0.65%。

CABYV是一種單鏈正義RNA病毒，屬黃癥病毒科（Luteoviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），在田間主要通過棉蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）和馬鈴薯長管蚜（Macrosiphum euphorbiae）以持久非增殖型方式傳播［4 ］，該病毒還可通過嫁接傳播，目前尚未有經(jīng)汁液機(jī)械接種或種子傳播的報(bào)道［5 ］。CABYV最早于1992年在法國首次報(bào)道［4 ］，目前我國北京、上海、浙江、江蘇、河南、遼寧、陜西、甘肅、內(nèi)蒙古、云南、新疆等?。ㄊ小^(qū)）均有發(fā)生［3， 6 - 8 ］。2017年在甘肅瓜州地區(qū)的甜瓜上檢測到該病毒［8 ］。

2021年9月在甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣北灣鎮(zhèn)新坪村的溫室大棚中，發(fā)現(xiàn)了表現(xiàn)葉片黃化和明脈等病毒病癥狀的黃瓜植株。為明確其病原，采用PCR方法對病樣進(jìn)行了檢測，以期為黃瓜病害的防治提供參考。

1? ?材料與方法

1.1? ?病害癥狀及病情調(diào)查

依據(jù)田間癥狀進(jìn)行病害癥狀描述，調(diào)查黃瓜棚內(nèi)表現(xiàn)典型病毒病癥狀的瓜苗病株率，采用Z字形5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)調(diào)查2壟（30株/壟）。

病株率=（病株數(shù)/調(diào)查植株總數(shù)）×100%

1.2? ?樣品采集

于2021年9月上旬（黃瓜苗期），自靖遠(yuǎn)縣北灣鎮(zhèn)新坪村大棚黃瓜田（種植黃瓜品種為德爾688，由天津德瑞特種業(yè)有限公司提供）采集葉片黃化、明脈的典型病株1份，置于潔凈塑料袋中，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采樣過程中發(fā)現(xiàn)棚內(nèi)有煙粉虱和蚜蟲發(fā)生。

1.3? ?引物

參照文獻(xiàn)Deng 等［9 ］、Juarez等［10 ］的方法分別合成粉虱傳雙生病毒（whitefly-transmitted geminivirus， WTG）的通用引物和瓜類蚜傳黃化病毒（CABYV）的特異性引物（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.4? ?DNA提取和PCR檢測

黃瓜葉片總DNA采用［寶生物工程（大連）有限公司］的植物基因組提取試劑盒提取，根據(jù)說明書進(jìn)行操作，同時(shí)提取健康黃瓜葉片總DNA，作為健康對照。

PCR反應(yīng)體系為：2.5 μL 10×PCR反應(yīng)緩沖液（含Mg2+）、2.0? μL dNTP（2.5 μmol/L）、1.0 μL引物PA（10 μmol/L）、1.0 μL 引物PB（10 μmol/L）、0.5 μL Taq酶、2.0 μL植物總DNA，ddH2O補(bǔ)足體積至25.0 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5? ?RNA提取和RT-PCR檢測

黃瓜葉片總RNA提取采用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，根據(jù)制造商［寶生物工程（大連）有限公司］的說明書進(jìn)行操作，同時(shí)提取健康黃瓜葉片總RNA，作為健康對照。

RT-PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液、1.0 μL酶、1.0 μL引物CE-9（10 μmol/L）、1.0? μL引物CE-10（10 μmol/L）、3 μL植物總RNA、6.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s、55 ℃ 40 s、72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。

將PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并在紫外燈下切取含目的片段的凝膠。

利用愛思進(jìn)Axygen DNA凝膠回收試劑盒純化回收DNA片段，將純化回收的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于LB培養(yǎng)基上生長，挑選陽性克隆，送金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.6? ?序列分析

將測序得到的核苷酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，并下載相關(guān)序列（表2）。將文獻(xiàn)報(bào)道的部分CP序列作為分類標(biāo)準(zhǔn)［11 ］，甜瓜蚜傳黃化病毒（Melon aphid-borne yellows virus， MABYV）的CP序列作為外群，采用MEGA X軟件中的鄰接法（Neighbour Joining， NJ）構(gòu)建CP基因核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗(yàn)計(jì)算系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的置信度。將測序得到的核酸序列編碼的外殼蛋白（coat protein， CP）序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對，采用MEGA X軟件中的最大似然法（Maximum Likelihood， ML）構(gòu)建CP基因氨基酸系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次Bootstrap檢驗(yàn)計(jì)算系統(tǒng)樹中節(jié)點(diǎn)的置信度。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?黃瓜樣品癥狀

采樣大棚的黃瓜田發(fā)病株率為0.3%，罹病黃瓜植株的葉片表現(xiàn)明顯的黃化、明脈癥狀（圖1）。

2.2? ?PCR檢測

利用WTG通用引物（PA和PB）對田間采集的病樣進(jìn)行檢測，在發(fā)病黃瓜樣品及健康對照中均未擴(kuò)增到目標(biāo)條帶（數(shù)據(jù)未顯示）。表明該黃瓜樣品中不存在WTG感染。

2.3? ?RT-PCR檢測

以CABYV特異性引物進(jìn)行的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，在黃瓜病樣中擴(kuò)增出約600 bp的特異性條帶，健康樣品和空白對照未擴(kuò)增到目標(biāo)條帶（圖2），表明該黃瓜病樣中存在CABYV的感染。病樣PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行序列測定，序列比對分析結(jié)果表明，該序列（GenBank登錄號：OQ913376）與已報(bào)道的福建南瓜上分離物CABYV-FJCP基因的核苷酸序列（GenBank登錄號：GQ221223）的同源性為98.33%、氨基酸序列的同源性為98.48%，證明所測定的序列為CABYV的CP基因部分序 列［11 ］。

2.4? ?CABYV的系統(tǒng)進(jìn)化分析

在基于CP基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，本研究獲得的CABYV分離物（GenBank登錄號：OQ913376）和瓜類蚜傳黃化病毒（如KR231953.1、KR231943.1、KR231944.1、KR231952.1等）均聚為同一分支，即亞洲分支（圖3、圖4），與福建分離物（GenBank登錄號：GQ221223）、新疆分離物（GenBank登錄號：EU636992）及韓國分離物（GenBank登錄號：KR231952）的親緣關(guān)系較近，聚在亞洲分支，而與歐洲（地中海分支）及中國臺灣（臺灣分支）分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3? ?討論與結(jié)論

Kwak等［11 ］測定了2013 — 2014年從韓國出現(xiàn)黃化癥狀的植株上收集的22個(gè)CABYV分離物的完整基因組序列，并與之前報(bào)道的CABYV基因組序列進(jìn)行比較。其研究結(jié)果顯示，根據(jù)完整核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，CABYV可分為4個(gè)分支，即亞洲分支、地中海分支、臺灣分支和CABYV-R分支。通過分析CP基因序列的相似性，本研究獲得的白銀CABYV分離物與亞洲分支聚集在一起。

除了葫蘆科作物（Cucurbitaceae），萵苣（Lactuca sativa）、蠶豆（Vicia faba）、鷹嘴豆（Cicer arietinum）、西番蓮（Passiflora spp.）以及部分葫蘆科、錦葵科（Malvaceae）、莧科（Amaranthaceae）、十字花科（Brassicaceae）、藜科（Chenopodiaceae）、唇形科（Lamiaceae）的野生植物也是CABYV的自然寄 主［16 - 20 ］，在病毒傳播中起到病毒庫的重要作用。CABYV主要引起葫蘆科植物，如黃瓜、甜瓜、西瓜、西葫蘆、南瓜和苦瓜等葉片黃化和增厚，在果實(shí)上癥狀不明顯，但感染后會導(dǎo)致花和綠葉面積減少，致使果實(shí)產(chǎn)量降低。在黃瓜中，產(chǎn)量損失可高達(dá)50%［21 ］。

本研究是繼吳洋等［8 ］2017年在甘肅酒泉市瓜州縣甜瓜上檢測到CABYV后，在甘肅白銀市靖遠(yuǎn)縣黃瓜上再次檢測到該病毒，鑒于其具有蚜傳特征，同時(shí)也可以隨著種苗調(diào)運(yùn)等途徑遠(yuǎn)距離擴(kuò)散危害，生產(chǎn)上應(yīng)密切關(guān)注，加強(qiáng)種苗監(jiān)測，早發(fā)現(xiàn)，早防控，減少對產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展造成的危害。通過控制蚜蟲，清除雜草等可減少或推遲CABYV病毒的傳播和擴(kuò)散；有針對性地篩選和利用抗性品種，也是病害防控的有效措施。

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