黃牛源Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)的鑒定

李小軍,姜龍龍,呂超超,閆文朝

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471023;2.濟(jì)源市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南濟(jì)源 454650)

片形吸蟲(chóng)隸屬于復(fù)殖目的片形科片形屬,是反芻動(dòng)物體內(nèi)的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)。牛、羊等動(dòng)物感染片形吸蟲(chóng)后因肝臟功能紊亂導(dǎo)致生產(chǎn)力下降,給畜牧業(yè)造成較為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。肝片形吸蟲(chóng)還可感染人,全球有高達(dá)9 000萬(wàn)人面臨片形吸蟲(chóng)感染的風(fēng)險(xiǎn)[2]。

片形吸蟲(chóng)主要是肝片形吸蟲(chóng)(Fasciolahepatica)和大片形吸蟲(chóng)(F.gigantica)。近年來(lái),在埃及、伊朗、日本、韓國(guó)和中國(guó)等地發(fā)現(xiàn)有雜合型片形吸蟲(chóng)[3-5]。由于肝片形吸蟲(chóng)與大片形吸蟲(chóng)的大小指標(biāo)實(shí)際上存在相當(dāng)大的變化及重疊,傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類(lèi)對(duì)于二者的準(zhǔn)確鑒定和區(qū)分是不可靠的[4]。PCR和測(cè)序等分子技術(shù)已應(yīng)用于片形吸蟲(chóng)的鑒定和分類(lèi)[6]。目前用于片形吸蟲(chóng)種類(lèi)鑒定的分子標(biāo)記主要有核糖體和線粒體DNA序列。其中的核糖體小亞基的第1和第2內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS1、ITS2)和線粒體cox1、nad1基因常被用于片形吸蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定[5-7]。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,河南省奶牛中存在肝片形吸蟲(chóng)和大片形吸蟲(chóng)[8-9],但目前尚未見(jiàn)雜合型片形吸蟲(chóng)的報(bào)道。本研究對(duì)濟(jì)源地區(qū)1例黃牛感染的片形吸蟲(chóng)在形態(tài)學(xué)鑒定基礎(chǔ)上,對(duì)蟲(chóng)體的核糖體ITS1、ITS2以及線粒體cox1、nad1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序和序列分析,確定了其種類(lèi),為片形吸蟲(chóng)病的流行病學(xué)及其防控補(bǔ)充了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2019年10月從河南省濟(jì)源市某肉牛屠宰廠采集疑似片形吸蟲(chóng)感染的肝臟,帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢查。從肝臟中采集到片形吸蟲(chóng)蟲(chóng)體,保存于70%乙醇,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查,該病牛為3歲本地黃牛,生前消瘦,常年在濟(jì)源市太行山區(qū)放牧生活。

1.1.2 主要試劑 基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品;2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans2K?DNA Marker和核酸染料GelStain,北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀(Genesy 96T),西安天隆科技有限公司產(chǎn)品;電泳儀DYY-6C,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀(Tanon-2500),上海天能科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肝臟病變與蟲(chóng)體形態(tài)的觀察 眼觀肝臟的大體病理變化。肉眼及解剖鏡觀察蟲(chóng)體的形態(tài)結(jié)構(gòu),直尺測(cè)量蟲(chóng)體的大小,參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]對(duì)蟲(chóng)體種類(lèi)進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 蟲(chóng)體基因組DNA提取 挑取4條形態(tài)大小差異較大的蟲(chóng)體用于DNA的提取,分別命名為JY001～JY004。參考文獻(xiàn)所述方法[11]處理蟲(chóng)體后按照組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取蟲(chóng)體DNA,保存于-20 ℃冰箱,備用。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 采用參考文獻(xiàn)[7,12-13]報(bào)道的引物分別擴(kuò)增片形吸蟲(chóng)的核糖體ITS1和ITS2區(qū)域、線粒體基因nad1和cox1,引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)體系為25 μL,包括2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL、上游引物和下游引物(10 pmol/μL)各1 μL、滅菌超純水8.5 μL和模板2 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55～57℃(表1) 30 s,72 ℃ 30～60 s(表1),共35個(gè)循環(huán);72 ℃ 7 min。取5 μL PCR產(chǎn)物,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后,用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照。

表1 片形吸蟲(chóng)PCR檢測(cè)引物

1.2.4 測(cè)序與序列分析 將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將所得序列用軟件Chromas和DNA Star 7.1 SeqMan校對(duì)拼接,在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast,對(duì)本研究所得序列與GenBank中序列相似性作初步分析。利用軟件BioEdit、DNA Star 7.1 MegAlign對(duì)所得序列和片形吸蟲(chóng)的參考序列進(jìn)行截短和序列比對(duì)。利用軟件MEGA 6以鄰接法構(gòu)建nad1和cox1基因的遺傳進(jìn)化樹(shù),作Bootstrap分析,重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000次。

本研究獲得的黃牛源片形吸蟲(chóng)代表分離株JY004的ITS1、ITS2、cox1和nad1基因序列已提交至GenBank,登錄號(hào)分別為OP850829、OP850586、OP837076和OP837184。

2 結(jié)果

2.1 肝臟病理變化及蟲(chóng)體形態(tài)觀察結(jié)果

肉眼觀察,病牛肝臟腫大,可見(jiàn)明顯結(jié)節(jié)囊腫。切開(kāi)結(jié)節(jié)囊腫,膽管內(nèi)可見(jiàn)淡黃色膿性分泌物和黑色鈣化塊狀物。從膽囊和膽管中分離的蟲(chóng)體呈淡紅色片狀,蟲(chóng)體肥厚,大小為(27～44) mm×(7～16) mm,平均長(zhǎng)寬比為2.73(測(cè)量了12個(gè)完整蟲(chóng)體的數(shù)據(jù))。蟲(chóng)體頭錐明顯,靠近前端有口吸盤(pán)和腹吸盤(pán),二者距離較近,蟲(chóng)體前寬后窄,兩側(cè)不平行,肩部特征不明顯。該形態(tài)學(xué)符合片形吸蟲(chóng)的特征,但尚不能準(zhǔn)確定種。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)提取的4份DNA樣品JY001～JY004進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到了ITS1、ITS2、nad1和cox1的條帶,分別約為600、470、619、474 bp(圖1),均與預(yù)期大小相符。

A～D.ITS1、ITS2、nad1、cox1; M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～4.JY001-JY004

2.3 分子鑒定結(jié)果

根據(jù)測(cè)序結(jié)果,JY001和JY002兩份樣品的ITS1、ITS2測(cè)序色譜圖存在較多噪音信號(hào),無(wú)法獲得完整可靠的序列,剩余兩份樣品JY003和JY004四個(gè)基因均獲得完整準(zhǔn)確序列。因此,選擇樣品JY003和JY004用于后續(xù)序列比對(duì)分析和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

2.3.1 ITS1和ITS2序列分析結(jié)果 序列比對(duì)結(jié)果顯示,JY003和JY004的ITS1序列和ITS2序列均完全一致。JY003和JY004的ITS1序列與大片形吸蟲(chóng)序列相似性在99.5%以上,與肝片形吸蟲(chóng)序列相似性為98.9%～99.2%。測(cè)序色譜圖顯示,這兩份樣品在6個(gè)位點(diǎn)存在雜合套峰,且每個(gè)雜合位點(diǎn)的堿基與肝片形吸蟲(chóng)和大片形吸蟲(chóng)的堿基一致(表2和圖2)。

▲:所指為雜合位點(diǎn),出現(xiàn)套峰

表2 片形吸蟲(chóng)ITS1核苷酸變異情況

JY003和JY004的ITS2序列與肝片形吸蟲(chóng)和大片形吸蟲(chóng)序列相似性均在98.8%以上。測(cè)序色譜圖顯示,這兩份樣品有4個(gè)位點(diǎn)存在雜合套峰,且每個(gè)雜合位點(diǎn)的堿基與肝片形吸蟲(chóng)和大片形吸蟲(chóng)的堿基一致(表3)。

表3 片形吸蟲(chóng)ITS2核苷酸變異情況

根據(jù)ITS1和ITS2序列分析結(jié)果,參考有關(guān)文獻(xiàn),提示河南濟(jì)源片形吸蟲(chóng)分離株JY003和JY004為雜合型片形吸蟲(chóng)。

2.3.2nad1和cox1基因序列分析結(jié)果 JY003與JY004的nad1基因序列相同。二者與GenBank上已發(fā)布的肝片形吸蟲(chóng)序列的相似性為91.4%～91.6%,與大片形吸蟲(chóng)序列相似性為96.8%～100%,其中與大片形吸蟲(chóng)中國(guó)云南、日本和韓國(guó)分離株的序列相似性高達(dá)100%。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上,JY003和JY004與大片形吸蟲(chóng)處于同一分支上(圖3)。

圖3 基于片形吸蟲(chóng)nad1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

JY003與JY004的cox1基因序列也相同。二者與GenBank上已發(fā)布的肝片形吸蟲(chóng)序列的相似性為93.1%～93.4%,與大片形吸蟲(chóng)序列相似性為97.3%～99.2%,其中與大片形吸蟲(chóng)越南和泰國(guó)分離株的相似性達(dá)99%以上。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上JY003和JY004與大片形吸蟲(chóng)處于同一分支(圖4)。

圖4 基于片形吸蟲(chóng)cox1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

片形吸蟲(chóng)病是危害牛、羊等反芻動(dòng)物的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)病,也是一種重要的人畜共患病[2]。片形吸蟲(chóng)主要是肝片形吸蟲(chóng)和大片形吸蟲(chóng),也有近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的位于二者之間的雜合型[5,13-14]。片形吸蟲(chóng)成蟲(chóng)的頭錐、肩部和長(zhǎng)寬比等特征常作為形態(tài)學(xué)種類(lèi)鑒定的指標(biāo),但由于蟲(chóng)體發(fā)育階段等因素會(huì)影響其形態(tài)學(xué)鑒定的準(zhǔn)確性[4,15]。本研究對(duì)采集到的河南省濟(jì)源市本地黃牛肝臟中片形吸蟲(chóng)蟲(chóng)體,首先通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)觀察,發(fā)現(xiàn)其與片形吸蟲(chóng)的形態(tài)特征基本吻合,但由于肩部特征不明顯,蟲(chóng)體兩側(cè)不平行,未能確定其為何種片形吸蟲(chóng)。為更確切地鑒定其種類(lèi),從分子水平上做了進(jìn)一步鑒定。

針對(duì)片形吸蟲(chóng)的ITS1和ITS2區(qū)域,我們對(duì)河南濟(jì)源黃牛源分離株進(jìn)行了分子鑒定,結(jié)果為Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)。相較與核糖體DNA,線粒體基因如nad1和cox1系母系遺傳,具有進(jìn)化速率較快,不易發(fā)生基因重組等特點(diǎn),也被廣泛用于片形吸蟲(chóng)的種類(lèi)鑒定和遺傳進(jìn)化分析[6,5],但無(wú)法區(qū)分片形吸蟲(chóng)是否存在雜合型[13-15]。因此,本研究除了用標(biāo)記分子ITS1和ITS2外,還利用線粒體nad1和cox1基因進(jìn)行序列和遺傳進(jìn)化分析。分析結(jié)果顯示,濟(jì)源黃牛源分離株JY003和JY004的nad1和cox1基因均與大片形吸蟲(chóng)進(jìn)化關(guān)系最近,其中nad1序列與大片形吸蟲(chóng)中國(guó)云南、日本和韓國(guó)分離株相似性高達(dá)100%。這表明本研究分離的黃牛源片形吸蟲(chóng)分離株為大片形吸蟲(chóng)作為母系的Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)。

一般認(rèn)為中國(guó)南方反芻動(dòng)物和人群感染大片形吸蟲(chóng),北方地區(qū)流行肝片形吸蟲(chóng)[5,16-17]。后來(lái)發(fā)現(xiàn),肝片形吸蟲(chóng)和大片形吸蟲(chóng)地理隔離性已被打破,在黑龍江、吉林、云南、廣西、福建、貴州、湖北、湖南、廣東和青海等地區(qū)均存在Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng),其中大片形吸蟲(chóng)作為母系的Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位[13-15,18]。Ichikawa-Seki M等[19]分析了來(lái)自中國(guó)各地共211株片形吸蟲(chóng),發(fā)現(xiàn)Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)為優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)株,占比高達(dá)63.0%。本研究從中原地區(qū)黃牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng),進(jìn)一步驗(yàn)證了“Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)成為中國(guó)大陸流行的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)株”的推論。

有關(guān)河南地區(qū)動(dòng)物片形吸蟲(chóng)感染情況的報(bào)道很少。李明[8]曾對(duì)濟(jì)源地區(qū)奶牛肝片形吸蟲(chóng)感染情況做過(guò)調(diào)查,基于nad1基因分析結(jié)果顯示,奶牛肝片形吸蟲(chóng)感染率為5.42%。劉復(fù)生報(bào)道[9],基于nad1基因分析表明,河南省中牟縣奶牛存在大片形吸蟲(chóng)和肝片形吸蟲(chóng)。由于上述兩項(xiàng)調(diào)查研究?jī)H采用線粒體基因nad1進(jìn)行分子鑒定,無(wú)法鑒定出Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng)。本研究采用核糖體和線粒體標(biāo)記分子對(duì)來(lái)自河南省濟(jì)源市本地黃牛的蟲(chóng)株進(jìn)行分子鑒定,首次確定了在河南地區(qū)存在Fh/Fg雜合型片形吸蟲(chóng),為我國(guó)片形吸蟲(chóng)的流行病學(xué)研究提供了重要補(bǔ)充,為動(dòng)物和人片形吸蟲(chóng)病的防控提供了重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。