負(fù)載自噬抑制小干擾RNA的聚精氨酸多肽納米膠束抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的初步研究

胡楚玲,顧芬芬,宮春愛,夏清明

0 引言

前列腺癌已成為危害男性健康的重要腫瘤之一,激素抵抗是晚期前列腺癌治療的難題[1]。以多西他賽為基礎(chǔ)的聯(lián)合治療是內(nèi)分泌治療失敗后前列腺癌的一線化療方法,但存在化療耐藥的問題[2-3]。目前,前列腺癌化療耐藥可能與前列腺癌細胞內(nèi)自噬活性的異常升高有關(guān)[4-6]。

細胞自噬是一種細胞自我降解的過程,在適應(yīng)代謝應(yīng)激、保持基因組完整性及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[7-8]。在腫瘤治療中,凋亡耐受是產(chǎn)生腫瘤耐藥的重要機制,細胞自噬可抵抗抗腫瘤藥物誘導(dǎo)的凋亡,促進腫瘤耐藥[9-11]。因此,抑制細胞自噬可能是逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥的關(guān)鍵。Beclin1基因也稱BECN1基因,是酵母ATG6的同系物,也是哺乳動物參與自噬的特異性基因[12]。Beclin1基因主要通過與III型PI3K形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其他ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位,調(diào)節(jié)自噬活性[13]。上調(diào)Beclin1在哺乳動物中的表達能夠刺激自噬的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn),40%～75%的卵巢癌、乳腺癌及前列腺癌中存在BECN1基因的缺失性突變[14]。因此,自噬抑制可作為提高化療療效的重要輔助策略。采用 RNAi 技術(shù)(Beclin1siRNA)下調(diào) Beclin1 的表達[15],通過靶向Ⅲ型PI3K通路抑制前列腺癌細胞的自噬活性,可提高其對化療藥物多西他賽(Docetaxel,DTX)的敏感性[16-18],進一步表明 Beclin1siRNA 可作為一種治療前列腺癌的新方法。因此,如果將 Beclin1siRNA 與化療藥物共同遞送到腫瘤組織,則可提高晚期前列腺癌細胞對多西他賽等化療藥物的敏感性?；诖?本研究在聚精氨酸組氨酸(HR)的組氨酸末端氨基上修飾DOX-EMCH[19],并通過半胱氨酸分子內(nèi)交聯(lián)形成大分子載體,與si-Beclin1共孵育形成共載膠束(DHRss-B),同時選擇人前列腺癌細胞系PC-3細胞作為實驗對象,探討其體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用,旨在尋找一種靶向效率高、生物相容性好、毒性低的納米載體。

1 材料和方法

1.1 主要儀器和試劑 Zeta sizer ZS90粒度測定儀(Malvern公司,英國),JEM-2010透射電鏡(JEOL公司,日本),L-精氨酸鹽酸鹽、L-精氨酸和DOX-EMCH[生工生物工程(上海)股份有限公司,中國],si-Beclin1(CST,美國),MDC試劑盒(Sigma,美國),beclin1、LC3II/I、p62、Paxillin抗體及二抗(Abcam,英國),1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司,美國),其他試劑均為分析純。

1.2 細胞系及細胞培養(yǎng) 人前列腺癌細胞系PC-3細胞(購自中科院上海細胞所),將RPMI1640+10%FBS+1%青霉素/鏈霉素于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)嚴(yán)格按照細胞培養(yǎng)規(guī)程及無菌條件操作。

1.3 DHRss-B的制備及表征 首先,在芴甲氧羰基保護的前提下采用固相合成法[20]合成聚精氨酸組氨酸(HR)多肽,并通過反相高效液相色譜法進行純化。接著,阿霉素衍生物(DOX-EMCH)與HR肽末端羧基通過縮合反應(yīng)得到DOX-HR (DHR)。產(chǎn)品通過反相高效液相色譜法純化。然后,DHR(50 mg)和L-半胱氨酸鹽酸鹽0.58 mg溶于1.8 ml (pH 7.0)蒸餾水,隨后向混合溶液中滴加0.2 ml 5%過氧化氫溶液并攪拌,此后避光孵育12 h。反應(yīng)物裝入透析袋(截留分子量=1 000),在蒸餾水中室溫下透析12 h,將透析后的產(chǎn)物冷凍干燥24 h,以獲得純化的DHRss。將獲得的DHRss與si-Beclin1共孵育30 min,得到DHRss-B。采用粒徑分析儀測定DHRss-B的粒徑、電位。將制備的DHRss-B置于2～8 ℃條件下分別于第0、24、48、72、96小時肉眼觀察外觀形狀,并考察其粒徑、電位變化,以評價穩(wěn)定性。

1.4 DHRss-B納米膠束的體外細胞學(xué)評價

1.4.1 流式細胞術(shù)考察細胞攝取能力 采用流式細胞術(shù)考察納米膠束在人前列腺癌細胞PC-3的攝取能力。將處于對數(shù)生長期的PC-3細胞按2×105個/孔接種到12孔板,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。采用FAM熒光標(biāo)記的si-Beclin1和DHRss納米膠束,按照N/P=10、20、40、80的比例混合,渦旋30 s,避光孵育30 min,制備熒光素標(biāo)記的DHRss-B。培養(yǎng)后更換為無血清培養(yǎng)基,之后每孔加入不同濃度的DOX、DHRss(DOX為0.5、1、2 μg/ml)和不同N/P的DHRss-B,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用PBS將細胞清洗3次,胰酶消化,離心后PBS重懸。采用流式細胞儀考察細胞對納米膠束的攝取情況。

1.4.2 CCK-8法考察納米膠束的細胞毒性 采用CCK-8法對DHRss-B納米膠束的細胞毒性進行考察。將處于對數(shù)生長期的人前列腺癌細胞PC-3按8×103個/孔接種到96孔板中,置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基,之后每孔加入不同濃度的DHRss-B納米膠束(si-Beclin1 100 nM;DOX為0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 μg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h,吸掉培養(yǎng)基,更換為含CCK-8的新鮮培養(yǎng)基,繼續(xù)孵育1～2 h。酶標(biāo)儀450 nm測定OD值。以未處理細胞為對照,未接種細胞的孔為空白孔,計算每孔的細胞活力。

由于siRNA體內(nèi)易被酶降解,因此采用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000(Lipo2000)保護si-Beclin1。將si-Beclin1與Lipo2000共同孵育以制備Si-LIP組。將新鮮配置的Si-LIP、DOX、DHRss、DHRss-B(si-Beclin1 100 nM,DOX 0.5 μg/ml)分別加入至培養(yǎng)孔中,繼續(xù)培養(yǎng)48 h。通過顯微鏡觀察不同處理后PC-3細胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.4.3 MDC法染色觀察細胞自噬情況 接種1×104個 PC-3細胞于預(yù)先加入蓋玻片的24孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將si-Beclin1與Lipo2000共同孵育以制備Si-LIP組。將新鮮配置的HR、Si-LIP、DOX、DHRss、DHRss-B(si-Beclin1 100 nM,DOX 0.5 μg/ml)分別加入至培養(yǎng)孔中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,用1×wash buffer洗滌2次,加入120 μl MDC染液,室溫避光染色1 h;用1×wash buffer洗滌3次,滴加50 μl抗猝滅封片液封片后,置于4 ℃避光保存,置于熒光顯微鏡下觀察細胞自噬情況。

1.4.4 蛋白免疫印跡試驗 采用蛋白免疫印跡試驗考察納米膠束對細胞自噬的影響。將處于對數(shù)生長期的人前列腺癌細胞PC-3以每孔5×105個細胞的密度接種于6孔板中,孵育24 h。將新鮮配置的HR、Si-LIP、DOX、DHRss、DHRss-B (si-Beclin1 100 nM,DOX 0.5 μg/ml)分別加入至培養(yǎng)孔中,繼續(xù)培養(yǎng) 24 h,收集細胞,用RIPA裂解緩沖液重懸,冰上孵育30 min。然后,收集蛋白質(zhì)樣本。等量的蛋白通過煮沸5 min變性,SDS-PAGE分離,轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Millipore,美國)上,用5%脫脂奶粉在室溫下阻斷1 h,然后用抗體P62、Beclin1、LC3、Paxillin檢測。

1.4.5 納米膠束抗侵襲作用研究 采用Transwell法考察納米膠束抗細胞侵襲能力。Matrigel在4 ℃過夜融化,用4 ℃預(yù)冷的無血清培養(yǎng)基稀釋Matrigel至終濃度1 mg/ml,冰上操作,在Transwell上室底部中央垂直加入100 μl稀釋后的Matrigel,37 ℃孵育1 h,使Matrigel凝成固體,將預(yù)先經(jīng)DOX、DHRss、DHRss-B(si-Beclin1 100 nM;DOX 0.5 μg/ml)處理的細胞按5×103個加入到小室中,下室加入含10% FBS的培養(yǎng)基,37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。孵育結(jié)束后小心取出細胞小室,洗掉小室上層培養(yǎng)液,PBS清洗一遍,4%多聚甲醛固定5 min,0.5%結(jié)晶紫染色20 min,PBS清洗2次,立即用棉簽擦去上層的細胞,靜置風(fēng)干,顯微鏡下觀察濾膜下層的細胞。

2 結(jié)果

2.1 納米膠束的合成與表征 粒徑、電位是納米膠束基本的考察指標(biāo)。如圖1A所示,DHRss-B的粒徑為(129.9±2.5)nm,圖1A中的DHRss-B透射電鏡圖顯示,納米膠束呈球形分布,大小均勻,粒徑在100 nm左右,與粒徑儀測得的粒徑相一致。圖1B為DHRss-B的電位圖,電位為(25.8±1.65)mV,表明DHRss-B具有較好的分散性。圖1C為DHRss-B的穩(wěn)定性考察結(jié)果,結(jié)果顯示,DHRss-B在48 h內(nèi)平均粒徑和電位無明顯變化,72 h 后的平均粒徑和電位略有增大,可能是由于隨著時間的推移,部分納米膠束出現(xiàn)凝聚現(xiàn)象。

圖1 DHRss-B的粒徑電位圖和穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.2 納米膠束的攝取 通過流式細胞術(shù)檢測納米膠束的細胞攝取能力。如圖2A所示,PC-3細胞對DOX的攝取呈劑量依賴性。當(dāng)DOX濃度為0.5、1.0、2.0 μg/ml時,DOX陽性細胞分別占45.57%、54.11%和88.66%。然而,DHRss的細胞攝取在DOX低濃度時即有較高的攝取。當(dāng)DOX濃度為0.5 μg/ml時,DHRss陽性細胞率明顯高于DOX的陽性細胞率(93.01%vs.45.57%,P<0.05)。采用FAM探針標(biāo)記si-Beclin1,通過流式細胞術(shù)定量分析FAM-si-Beclin1的細胞攝取情況。如圖2B所示,FAM熒光信號隨N/P比值的增大而增大,當(dāng)N/P為80時,FAM陽性細胞分別是N/P=20和N/P=40的1.79倍和1.32倍 (P<0.05),顯著高于si-LIP組。這些結(jié)果表明,經(jīng)細胞膜穿透肽修飾的DOX更容易進入細胞。其中,DHRss-B在N/P為40時,表現(xiàn)出最佳的吸收效率。

圖2 PC-3細胞對DOX和DHRss-B的流式細胞攝取能力

2.3 CCK-8考察納米膠束的細胞毒性 圖3A、3B分別表示用不同濃度DOX和DHRss-B處理24 h和48 h后PC-3細胞的存活率。結(jié)果表明,培養(yǎng)48 h后,游離DOX對PC-3細胞的IC50值為0.95 μg/ml。DHRss-B的IC50值低于游離DOX (0.45 μg/mlvs.0.95 μg/ml,P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明,與si-Beclin1共遞送可顯著增強阿霉素的細胞毒性。

圖3 不同DOX濃度下DHRss-B和DOX對PC-3細胞的殺傷能力

顯微鏡觀察結(jié)果顯示,對照組細胞密度均勻,生長狀態(tài)良好,無壞死脫落;Si-LIP和HR處理后,細胞形態(tài)無明顯變化;單純DOX處理可見部分細胞皺縮變圓,該現(xiàn)象在DHRss-B組最為明顯,脫落和死亡的細胞明顯增多。見圖4。

圖4 顯微鏡觀察不同處理組作用48 h后的PC-3細胞形態(tài)(40×)

2.4 熒光顯微鏡觀察MDC染色自噬小體 不同藥物組作用48 h后的MDC染色結(jié)果如圖5所示。由圖中可見,DOX單藥組熒光最強,DHRss組次之,DHRss-B組最弱,表明化療藥物可以刺激腫瘤細胞產(chǎn)生自噬,共載了DOX和si-Beclin1的納米膠束(DHRss-B)組成功在細胞內(nèi)產(chǎn)生了抑制自噬的作用。DHRss組較DOX組弱的原因可能與納米膠束使化療藥物達到緩釋效果有關(guān)。

圖5 MDC染色法觀察各組細胞自噬情況(200×)

2.5 Beclin1、LC3、p62和Paxillin蛋白表達 為了探討B(tài)eclin1在調(diào)節(jié)阿霉素誘導(dǎo)自噬中的作用,采用Western blot檢測Beclin1、LC3和p62的表達水平。與對照組相比,DOX處理誘導(dǎo)自噬標(biāo)記蛋白LC3II表達顯著升高,p62蛋白表達顯著降低(圖6)。此外,LC3II/I在DHRss-B組表達較弱,p62在DHRss-B中積累,表明DOX可誘導(dǎo)PC-3細胞自噬,包裹si-Beclin1納米顆?？山档妥允砂l(fā)生率。從圖7可以看出,Paxillin在DHRss-B組的表達水平最低,可能與DHRss-B抑制細胞自噬有關(guān)。

圖6 WB法檢測各組Beclin1、LC3、p62的表達水平

圖7 WB法檢測各組Paxillin的表達水平

2.6 抗細胞侵襲能力 DHRss-B抗細胞侵襲能力結(jié)果如圖8所示。對照組細胞侵襲能力最強,DOX組具有較強的侵襲能力,DHRss-B組侵襲能力明顯降低。

圖8 顯微鏡觀察各處理組細胞侵襲情況(40×)

3 討論

本研究在前期構(gòu)建了共載DOX和si-Beclin1的聚精氨酸多肽膠束抗腫瘤活性的基礎(chǔ)上,對其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的作用進行了初步研究,旨在通過聯(lián)合給藥提高對轉(zhuǎn)移性腫瘤的療效。首先,制備的多肽納米膠束具有較為合適的粒徑,粒徑大小均勻,可充分利用腫瘤的增強滲透滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect,EPR)[21-22],使藥物富集于靶區(qū)。在細胞攝取方面,DHRss組在DOX濃度較低時,就能達到較高的細胞攝取,表明納米膠束包裹后,增強了與細胞膜的親和力,從而達到有效運輸和高效釋放的目的。

細胞毒性結(jié)果顯示,隨著藥物濃度的增加,各給藥組的細胞毒性也相應(yīng)增加,表明DOX藥物具有劑量依賴性的特征。在相同藥物濃度下,DHRss-B的細胞毒性強于DOX,表明DHRss-B可以通過共載化療藥物DOX和基因藥物si-Beclin1,實現(xiàn)抗腫瘤細胞增殖的作用。

通過MDC染色法和Western blot法,對Beclin1、LC3、p62蛋白的表達進行檢測,結(jié)果表明,DOX組導(dǎo)致PC-3細胞內(nèi)Beclin1及LC3II/I表達升高,可以初步推測DOX誘導(dǎo)細胞過度自噬,胞內(nèi)自噬體急劇增多。而DHRss-B組由于si-Beclin1發(fā)揮抑制自噬作用后抵抗了DOX引起的自噬,從而使Beclin1及LCII/I的表達下降。p62的表達也驗證了這一現(xiàn)象。

納米多肽膠束抗細胞轉(zhuǎn)移能力可從抗細胞侵襲試驗及Paxillin的表達得到初步結(jié)論。Paxillin作為一種接頭蛋白,能將信號從細胞外經(jīng)整合素途徑向細胞內(nèi)傳遞,是細胞骨架與胞外基質(zhì)連接不可缺少的交通紐帶[23-25],在細胞黏附和遷移過程中起著關(guān)鍵作用,與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的關(guān)系十分密切[26-27]。細胞侵襲試驗結(jié)果顯示,給藥后各組細胞的侵襲能力下降,DHRss-B組侵襲能力最弱,表明DHRss-B具有較好的抗細胞侵襲能力。此外,經(jīng)過DOX和si-Beclin1共處理后細胞自噬能力下降,Paxillin的表達下降,符合其作用原理。本研究表明,DHRss-B作為化療基因治療聯(lián)合制劑具有較好的抗腫瘤轉(zhuǎn)移能力,后期可進一步開展其抗腫瘤轉(zhuǎn)移的機制研究。