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    樂果和苦參堿農(nóng)藥在柞蠶幼蟲體內(nèi)的代謝研究

    2023-12-12 08:46:46張春楊宮田嬌張海東郭鴻儒楊淑芳
    北方蠶業(yè) 2023年4期
    關(guān)鍵詞:試蟲樂果柞蠶

    張春楊 宮田嬌 張海東 郭鴻儒 周 影 楊淑芳

    (吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院,吉林吉林 132012)

    柞蠶 (Antheraeapernyi)作為一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的資源昆蟲,在我國多個(gè)省份均有放養(yǎng)。然而,近年來吉林地區(qū)多斑柞跳象、天幕毛蟲、柞蠶飾腹寄蠅等柞樹害蟲危害嚴(yán)重,對(duì)柞蠶生產(chǎn)造成極大影響。為了減輕蟲害,蠶場(chǎng)普遍采用噴灑農(nóng)藥的方法,但柞蠶與天幕毛蟲同屬于鱗翅目,故柞蠶中毒現(xiàn)象屢見不鮮,嚴(yán)重影響了蠶業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

    樂果作為一種有機(jī)磷類殺蟲劑,其殺蟲機(jī)理是抑制害蟲乙酰膽堿酯酶的活性,對(duì)昆蟲具有胃毒、觸殺、熏蒸等作用,一直是防治多斑柞跳象、柞蠶飾腹寄蠅的主要藥劑。柞蠶接觸到樂果后,可能會(huì)出現(xiàn)體軀翻轉(zhuǎn)、扭曲、吐液、偶有脫肛等情況,最終可能導(dǎo)致死亡。

    苦參堿是由苦參提取制成的天然植物源類生物農(nóng)藥,以苦參堿、氧化苦參堿含量最高,對(duì)害蟲具有觸殺、拒食、麻痹神經(jīng)中樞系統(tǒng)等生物活性。苦參堿因其為廣譜殺蟲劑但對(duì)人畜低毒且能在大自然中快速降解的特性,已在多省市地區(qū)作為綠色防控技術(shù)藥品予以推廣,大范圍應(yīng)用于小麥、玉米、茶葉等農(nóng)作物的害蟲防治。然而,有研究發(fā)現(xiàn)雖然不同齡期柞蠶幼蟲對(duì)苦參堿農(nóng)藥的耐受度不同,但其LC50均低于生產(chǎn)推薦使用濃度[1]。

    為了進(jìn)一步探究?jī)煞N農(nóng)藥在柞蠶體內(nèi)的代謝和消除規(guī)律,為蠶場(chǎng)農(nóng)藥的施用提供參考,本文以五齡第3天柞蠶為試蟲,將高、低兩個(gè)劑量的樂果和苦參堿通過浸葉法[2]對(duì)試蟲進(jìn)行一次經(jīng)口染毒。通過對(duì)試蟲體內(nèi)樂果和苦參堿含量的測(cè)定,了解試蟲對(duì)兩種農(nóng)藥吸收的速度、在體內(nèi)存留時(shí)間的長(zhǎng)短、分布特征和從機(jī)體清除的速度,以便進(jìn)一步評(píng)估樂果和苦參堿農(nóng)藥的施用對(duì)柞蠶的毒性風(fēng)險(xiǎn)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試柞蠶品種109,由吉林省蠶業(yè)科學(xué)研究院柞蠶育種室提供。

    1.2 供試藥品

    樂果,有效成分含量40.0%,獸藥字060082920,遼寧鳳凰蠶藥廠產(chǎn)品;苦參堿,有效成分含量1.3%,山東省乳山韓威生物科技有限公司產(chǎn)品。

    1.3 儀器與試劑

    API4000+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(ESI離子源,美國AB SCIEX公司);渦旋混合器(美國Talboys);KQ-500DE超聲波清洗器 (昆山超聲儀器);KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)); TTL-DC吹氮儀(北京同泰聯(lián)科技);樂果溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1.00 mg/mL,中國計(jì)量科學(xué)研究院);苦參堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度98.9%,上海安普實(shí)驗(yàn)科技),氧化苦參堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度99.9%,天津阿爾塔科技);色譜純甲醇、乙腈(Fisher Scientific);色譜純甲酸(CNW);分析純無水硫酸鈉(北京化工);QuEChERS試劑凈化管(5982-5256安捷倫公司):15 mL離心管內(nèi)裝147.7 mg PSA,15.1 mg GCB,887.2 mg 硫酸鎂;QuEChERS試劑提取包:內(nèi)含硫酸鎂4 g,氯化鈉1 g,二水檸檬酸三鈉1 g,檸檬酸氫二鈉0.5 g( Waters公司);固相萃取凈化柱OasisPRIME HLB Plus Short(335 mg)柱(Waters公司);0.1%甲酸—水溶液;0.1%甲酸—甲醇液;50%甲醇水溶液(含0.1%甲酸);80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸); 0.2 μm濾膜(Pall Corporation)。

    1.4 藥物處理及樣本采集

    取5齡眠起第3天柞蠶幼蟲,體重8~9 g,空腹12 h,設(shè)置3次重復(fù)處理,每次重復(fù)選取10頭發(fā)育程度一致的健康柞蠶幼蟲,在自然條件下室內(nèi)插枝飼養(yǎng)。用足量的2 g/L樂果、0.000 06 g/L苦參堿溶液浸漬后陰干的柞樹葉一次性飼喂,并設(shè)置高低兩個(gè)劑量。其中低劑量組的給藥劑量為40 g/kg體重,高劑量組為80 g/kg體重。進(jìn)口染毒后更換正常新鮮柞樹葉飼喂,樂果組于給藥后0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、24 h、3 d、5 d、10 d取試蟲待測(cè),苦參堿組于給藥后0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、6 h、24 h、72 h取試蟲待測(cè)。所有待測(cè)樣本于-20 ℃保存。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    藥代謝動(dòng)力學(xué)的藥時(shí)數(shù)據(jù)使用DAS3.2.8軟件非房室模型進(jìn)行分析。

    2 樂果含量檢測(cè)

    2.1 樣品處理Ⅰ

    2.1.1 樣品提?、?/p>

    稱取2.50 g(精確至0.01 g)試樣于50 mL離心管中,加入80%乙腈水溶液(含0.2%甲酸)10 mL,渦旋1 min,超聲提取20 min,向離心管中加QuEChERS試劑提取鹽,再渦旋提取2 min后,在4 ℃下9 500 r/min離心5 min,上清液待凈化。

    2.1.2 樣品凈化Ⅰ

    用5 mL注射器抽取4 mL提取液,過OasisPRIME HLB Plus Short(335 mg)柱,棄去前面1.0 mL樣液,收集后面的凈化液備用。再準(zhǔn)確吸取2.00 mL凈化液于10 mL濃縮管中,于40 ℃水浴中氮吹至近干,準(zhǔn)確加入1.0 mL 50%甲醇溶液(含0.1%甲酸)溶解殘?jiān)?渦旋30 s,超聲2 min,渦旋1 min后,將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,13 000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜后,進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

    2.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件Ⅰ

    2.2.1 色譜條件Ⅰ

    Kinetex2.6 μm Biphenyl 100?色譜柱(100mm×3.0mm);柱溫40 ℃;流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相,A泵為 0.1% (V/V)甲酸—水,B泵為0.1% (V/V)甲酸—甲醇。流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1。

    2.2.2 質(zhì)譜條件Ⅰ

    離子源:ESI。掃描方式:正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+MRM)。離子源參數(shù):電噴霧電壓(IS)5 500 V;霧化氣壓力(GS1)60 Psi;輔助氣壓力(GS2)60 Psi;氣簾氣壓力(CUR)30 Psi。離子源溫度(TEM)550 ℃;噴撞氣(CAD)7 mL/min。監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓參數(shù)見表2。

    表2 樂果監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓參數(shù)

    3 苦參堿含量檢測(cè)

    3.1 樣品處理Ⅱ

    3.1.1 樣品提?、?/p>

    稱取經(jīng)充分粉碎、混合均勻的試樣2.50 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入80%乙腈水溶液(含0.2%氨水)10 mL,渦旋1 min,超聲提取20 min,向離心管中加5.0 g無水硫酸鈉,再渦旋提取2 min后,9 500 r/min離心5 min(4 ℃),上清液待凈化。

    3.1.2 樣品凈化Ⅱ

    吸取5.0 mL上清提取液加入到安捷倫QuEChERS試劑凈化管中(15 mL離心管內(nèi)裝147.7 mg PSA,15.1 mg GCB,887.2 mg硫酸鎂),渦旋2 min,5 000 r/min離心5 min(4 ℃)。準(zhǔn)確吸取2.00 mL凈化液于10 mL濃縮管中,于40 ℃水浴中氮吹至近干,準(zhǔn)確加入1.0 mL 50%甲醇溶液(含0.1%甲酸)溶解殘?jiān)?渦旋30 s,超聲2 min,渦旋1 min后,將溶液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中,13 000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm濾膜后,進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

    3.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件Ⅱ

    3.2.1 色譜條件Ⅱ

    Kinetex2.6 μm Biphenyl 100 ?色譜柱(100 mm×3.0 mm);柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min;進(jìn)樣量5 μL;流動(dòng)相,A泵為 0.1%甲酸—水,B泵為0.1%甲酸—甲醇。流動(dòng)相及梯度洗脫條件同樂果。

    3.2.2 質(zhì)譜條件Ⅱ

    離子源:ESI。掃描方式:正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(+MRM)。離子源參數(shù):電噴霧電壓(IS)5 500 V;霧化氣壓力(GS1)413 700 Pa;輔助氣壓力(GS2)413 700 Pa;氣簾氣壓力(CUR)206 850 Pa。離子源溫度(TEM)550 ℃;碰撞氣(CAD)7 mL/min。監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓參數(shù)見表3。

    表3 苦參堿監(jiān)測(cè)離子對(duì)、碰撞氣能量和去簇電壓參數(shù)

    4 結(jié)果與分析

    4.1 樂果在柞蠶幼蟲體內(nèi)的代謝及消除情況

    樂果在試蟲體內(nèi)的體藥含量見表4,C-T實(shí)測(cè)值群體曲線見圖1,代謝動(dòng)力學(xué)非房室模型統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)見表5。

    A—低劑量組 B—高劑量組圖1 樂果在試蟲體內(nèi)的C-T曲線圖

    表4 樂果體藥含量

    表5 樂果非房室模型統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)

    以上數(shù)據(jù)顯示,低劑量組的Tmax和AUC值均大于高劑量組;而Cmax、MRT和t1/2β值小于高劑量組。結(jié)合體藥含量及C-T曲線圖的結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)低劑量樂果農(nóng)藥在試蟲體內(nèi)駐留能力強(qiáng),衰減速度慢,而高劑量則相反。這可能與樂果農(nóng)藥的致毒機(jī)理有關(guān),即有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的毒性作用是使乙酰膽堿聚集引起膽堿能神經(jīng)先興奮后抑制。高劑量的樂果使試蟲體內(nèi)乙酰膽堿短期大量聚集,蠶體更加興奮,活動(dòng)量大,從而加速了體內(nèi)樂果的代謝。

    4.2 苦參堿在柞蠶幼蟲體內(nèi)的代謝及消除情況

    苦參堿在在試蟲體內(nèi)的體藥含量見表6,C-T實(shí)測(cè)值群體曲線見圖2。代謝動(dòng)力學(xué)非房室模型統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)見表7。

    A—低劑量組 B—高劑量組圖2 苦參堿在試蟲體內(nèi)的C-T曲線圖

    表6 苦參堿體藥含量

    表7 苦參堿非房室模型統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)

    以上數(shù)據(jù)顯示,高低劑量組試蟲體內(nèi)苦參堿含量均在1 h 達(dá)到最大峰值,但其 t1/2β差距顯著,且低劑量組Cmax約為高劑量組的1.5倍。低劑量組試蟲體內(nèi)苦參堿含量在2-3 h間出現(xiàn)大幅度衰減,6 h時(shí)已低于檢出限;但高劑量組在24 h仍能從試蟲體內(nèi)測(cè)得苦參堿。說明苦參堿農(nóng)藥起效快,易被蠶體吸收和分布,但是高劑量的苦參堿農(nóng)藥相比低劑量,其在試蟲體內(nèi)存留能力更強(qiáng)、持續(xù)作用時(shí)間長(zhǎng)。一方面可能是與苦參堿會(huì)導(dǎo)致染毒試蟲拒食、神經(jīng)中樞系統(tǒng)麻痹有關(guān)。另一方面也可能由于苦參堿不僅具有水溶性,在堿性條件下脂溶性也有較好的理化性質(zhì)[3],未經(jīng)吸收的苦參堿在柞蠶中腸堿性條件下被重新持續(xù)吸收。說明在蠶場(chǎng)病蟲害防治過程中,即使在安全濃度下也應(yīng)謹(jǐn)慎的使用苦參堿農(nóng)藥。

    5 討 論

    本研究利用LC-MS/MS檢測(cè)經(jīng)口一次性染毒的柞蠶幼蟲體內(nèi)的藥物濃度,通過對(duì)其代謝動(dòng)力學(xué)結(jié)果分析,初步了解了兩個(gè)劑量水平的樂果和苦參堿在柞蠶幼蟲體內(nèi)的代謝情況,這些結(jié)果可以為蠶場(chǎng)農(nóng)藥的合理施用提供參考,以減少柞蠶幼蟲體內(nèi)農(nóng)藥的殘留和積累。實(shí)驗(yàn)過程中樂果和苦參堿溶液的濃度是參考了本課題組前期實(shí)驗(yàn)中72 h的LC50[1]。本研究采用柞蠶幼蟲體藥濃度的方法進(jìn)行藥物代謝分析,在以后的實(shí)驗(yàn)中可根據(jù)研究需要取蠶體不同組織分別進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)使用的檢測(cè)方法中苦參堿最低檢出限為 0.05 μg/kg,氧化苦參堿最低檢出限為 0.1 μg/kg[4]。兩種農(nóng)藥檢測(cè)方法的方法學(xué)驗(yàn)證均滿足 GB/T 27404—2008 《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄中對(duì)精密度、回收率的要求。

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