阿魏酸哌嗪預(yù)處理對(duì)膿毒癥大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

李 堤，王建剛 ，劉新宇

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院研究生院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院血液凈化科,河南 南陽(yáng) 473000)

膿毒癥是造成急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)的主要原因之一[1],約60%的膿毒癥患者并發(fā)AKI[2],而重癥監(jiān)護(hù)病房中膿毒癥并發(fā)AKI患者病死率高達(dá)41%[3]。既往研究表明,膿毒癥在AKI的病因和發(fā)病機(jī)制中起重要作用,腎組織對(duì)膿毒癥的反應(yīng)機(jī)制與AKI有關(guān)[4]。目前,膿毒癥并發(fā)AKI患者的治療方法有限,主要包括抗生素控制感染、及時(shí)應(yīng)用液體復(fù)蘇、血液凈化技術(shù)等治療手段[5]。阿魏酸哌嗪(piperazine ferulate,PF)是由川芎的有效成分阿魏酸和哌嗪環(huán)縮合成的化合物,通過(guò)抗凝血、舒張血管、抑制血小板聚集和炎癥、減少血管內(nèi)膜、松弛血管平滑肌、擴(kuò)張腎血管等作用,改善腎血流動(dòng)力學(xué)和微循環(huán);PF在臨床中主要應(yīng)用于慢性腎小球腎炎、腎病綜合征、高血壓腎病以及糖尿病腎病的治療[6-7]。有研究表明,PF聯(lián)合黃芪注射液能有效降低AKI患者β2微球蛋白、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL)水平,從而改善腎功能[8]。有研究報(bào)道,PF可抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1和纖連蛋白(fibronectin,FN)的表達(dá),從而改善高血壓腎病大鼠的腎功能[9]。但是,目前PF治療AKI患者的具體機(jī)制仍不清楚。本研究主要觀察PF對(duì)Toll樣受體 4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3 (NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)信號(hào)通路的影響,探討PF在AKI治療中的作用機(jī)制,以期為PF的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性Sprague Dawley(SD)大鼠32只,購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物許可證:SCXK(湘)2019-0004,體質(zhì)量(300±20) g;飼養(yǎng)于南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,溫度(23±2) ℃,濕度50%,12 h/12 h光-暗循環(huán);用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室飼料喂養(yǎng),自由飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按照中國(guó)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》執(zhí)行。

1.2 主要試劑與儀器

PF分散片購(gòu)自山東希爾康泰藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字H20052333),9 g·L-1氯化鈉溶液購(gòu)自石家莊第四制藥有限公司,血清肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所,NGAL、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、降鈣素原(procalcitonin,PCT)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,多聚甲醛固定液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司,蘇木精染色液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,伊紅染色液、無(wú)水乙醇、二甲苯、鹽酸、包埋石蠟、中性樹(shù)膠均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,磷酸酶抑制劑和放射免疫沉淀法(radio immunoprecipi-tation assay,RIPA)裂解液購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州捷倍斯生物科技有限公司,鼠單抗TLR4購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購(gòu)自杭州賢至生物有限公司,兔多抗NF-κB、兔多抗NLRP3購(gòu)自美國(guó)Affinity公司;Multiskan FC酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司,DS-Fi3光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司,DK-20000-IIIL電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自河北菲斯福儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組與處理

PF混懸液制備:將PF分粉碎,溶于9 g·L-1氯化鈉溶液,充分搖勻震蕩。按照隨機(jī)數(shù)字表法將32只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、低劑量PF組、高劑量PF組,每組8只。低劑量PF組、高劑量PF組大鼠每天分別給予50、100 mg·kg-1PF混懸液灌胃,連續(xù)7 d;假手術(shù)組、模型組大鼠每天灌胃9 g·L-1氯化鈉溶液(0.1 mL·kg-1),連續(xù)7 d。假手術(shù)組大鼠僅打開(kāi)大鼠腹腔緩慢翻動(dòng)并找到盲腸后將其歸位,縫線關(guān)閉腹腔。模型組、低劑量PF組、高劑量PF組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔手術(shù)構(gòu)建大鼠AKI模型[10-11]:術(shù)前禁食12 h,可自由飲水。在無(wú)菌條件下,大鼠腹腔注射0.04 mL·kg-1水合氯醛麻醉。麻醉下進(jìn)行腹部正中線切開(kāi)約2 cm,緩慢找到盲腸,在回腸盲腸瓣下3-0縫線結(jié)扎盲腸,維持腸道連續(xù)性。在盲腸表面上3個(gè)間隔約0.8 cm的位置用18G針頭貫穿3次盲腸,輕輕擠壓,擠出少量糞便。之后按大鼠腸道生理位置還納盲腸,逐層縫合關(guān)閉腹腔,手術(shù)操作后立即用9 g·L-1氯化鈉溶液(0.1 mL·kg-1)皮下注射,防止大鼠出現(xiàn)休克死亡。術(shù)后大鼠可以自由進(jìn)食飲水。造模前藥物灌胃后出現(xiàn)2只大鼠死亡(高劑量PF組 1只,低劑量PF組 1只),造模過(guò)程出現(xiàn)4只大鼠死亡(模型組2只,高低劑量PF組和低劑量PF組各1只),最后分別剔除假手術(shù)組Scr最高和最低值各1只,納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)共24只大鼠,假手術(shù)組、模型組、低劑量PF組、高劑量PF組各6只。

1.3.2 血液及腎臟組織標(biāo)本收集

造模24 h后,各組大鼠腹腔注射0.04 mL·kg-1水合氯醛進(jìn)行麻醉,在麻醉狀態(tài)下剪開(kāi)大鼠頸動(dòng)脈,取血并置于不含抗凝劑的血液生化管中,室溫靜置2 h后,3 000 r·min-1離心15 min,收集血清備用。斷頭處理各組大鼠,打開(kāi)腹腔,切除腎臟,采用9 g·L-1氯化鈉溶液清洗腎臟組織;取部分腎組織,40 g·L-1多聚甲醛固定液固定;剩余腎組織置于-80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 生物化學(xué)法檢測(cè)大鼠Scr、BUN水平

取各組大鼠血清標(biāo)本,應(yīng)用生物化學(xué)法檢測(cè)Scr、BUN水平,嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)大鼠血清NGAL、IL-6和PCT水平

取各組大鼠血清標(biāo)本,應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清NGAL、IL-6和PCT水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察大鼠腎組織病理變化

取固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液中的腎組織,流水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制作厚約4 μm切片;取組織切片,行HE染色,顯微鏡下觀察大鼠腎組織病理變化。

1.3.6 Western blot法檢測(cè)大鼠腎組織中TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白表達(dá)

取保存于冰箱中的大鼠腎組織,使用 200 μL RIPA裂解液裂解腎組織,用含蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物提取總蛋白,BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度;應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白樣品,電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜,用脫脂奶粉溶液在室溫下封閉2 h;然后,滴加TLR4(滴度為14 000)、兔多抗NF-κB(滴度為11 000)、兔多抗NLRP3(滴度為11 000)和GAPDH(滴度為11 000)一抗,4 ℃孵育過(guò)夜;滴加二抗辣根過(guò)氧化物酶,室溫孵育2 h;使用增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光溶液顯影,應(yīng)用Image Pro Plus軟件分析灰度值,以GAPDH為內(nèi)參對(duì)照,目的蛋白相對(duì)表達(dá)量以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠Scr、BUN水平比較

模型組和低劑量PF組大鼠Scr、BUN水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組大鼠Scr水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組與假手術(shù)組大鼠BUN水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低劑量PF組和高劑量PF組大鼠Scr、BUN水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組大鼠Scr、BUN水平顯著低于低劑量PF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠Scr、BUN水平比較Tab.1 Comparison of the levels of Scr and BUN of rats among the four groups

2.2 4組大鼠血清NGAL、IL-6和PCT水平比較

模型組和低劑量PF組大鼠血清NGAL、IL-6、PCT水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組大鼠血清PCT水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組與假手術(shù)組大鼠血清NGAL和IL-6水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量PF組和高劑量PF組大鼠血清NGAL、IL-6和PCT水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組大鼠血清NGAL、IL-6和PCT水平均顯著低于低劑量PF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠血清NGAL、IL-6和PCT水平比較Tab.2 Comparison of serum NGAL,IL-6 and PCT levels of rats among the four groups

2.3 4組大鼠腎組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組大鼠腎組織無(wú)明顯異常改變(圖1A)。模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹變性,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多紅染物,可見(jiàn)腎小管充血、變性壞死,管腔有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),系膜毛細(xì)血管間細(xì)胞增殖(圖1B)。低劑量PF組大鼠部分腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)輕中度腫脹,部分腎小管上皮細(xì)胞變性壞死,未見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1C)。高劑量PF組大鼠腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹,未見(jiàn)明顯變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1D)。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:低劑量PF組;D:高劑量PF組。

2.4 4組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白水平比較

模型組和低劑量PF組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB、NLRP3蛋白水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組大鼠腎組織中TLR4蛋白水平顯著高于假手術(shù)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量PF組與假手術(shù)組大鼠腎組織中NF-κB、NLRP3蛋白水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);低劑量PF組和高劑量PF組大鼠腎組織中TLR4、NLRP3蛋白水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);PF高劑量組大鼠腎組織中NF-κB水平顯著低于模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);低劑量PF組與模型組大鼠腎組織中NF-κB水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量PF組大鼠腎組織中TLR4、NLRP3蛋白水平顯著低于低劑量PF組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量PF組與低劑量PF組大鼠腎組織中NF-κB水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of the relative expressions of TLR4,NF-κB and NLRP3 protein in renal tissues of rats among the four groups

3 討論

膿毒癥是目前臨床中急危重癥患者主要面臨的并發(fā)癥之一[12]。NGAL是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與膿毒癥并發(fā)AKI相關(guān)的生物標(biāo)志物;正常情況下,NGAL主要在中性粒細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞中呈低水平表達(dá)[13]。而在AKI模型大鼠尿液及血漿中NGAL水平會(huì)明顯升高,認(rèn)為其可作為AKI的判斷依據(jù)[14]。Scr和BUN是常用的反映腎功能的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,模型組、低劑量PF組大鼠Scr、BUN及血清NGAL水平顯著高于假手術(shù)組,高劑量PF組大鼠Scr水平顯著高于假手術(shù)組,低劑量PF組和高劑量PF組大鼠Scr、BUN及血清NGAL水平顯著低于模型組,高劑量PF組大鼠Scr、BUN及血清NGAL水平顯著低于低劑量PF組。另外,腎組織病理學(xué)檢測(cè)顯示,假手術(shù)組大鼠腎組織無(wú)明顯異常改變;模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞明顯腫脹變性,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有較多紅染物,可見(jiàn)腎小管有充血變性壞死,管腔有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),系膜毛細(xì)血管間細(xì)胞增殖;低劑量PF組大鼠部分腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)輕中度腫脹,部分腎小管上皮細(xì)胞變性壞死,未見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);高劑量PF組大鼠腎小管上皮細(xì)胞輕度腫脹,未見(jiàn)明顯變性壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);提示PF預(yù)處理對(duì)AKI具有保護(hù)性作用,且這種作用呈一定的劑量依賴性。

IL-6和PCT在全身炎癥反應(yīng)中起重要作用,與機(jī)體感染嚴(yán)重程度及膿毒癥患者的預(yù)后密切相關(guān)[15]。有研究表明,IL-6對(duì)膿毒癥具有較高的診斷效能、敏感度及特異度[16-17]。PCT水平在全身炎癥反應(yīng)尤其是細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)時(shí)會(huì)明顯升高,可作為膿毒癥或膿毒性休克早期診斷的血清標(biāo)志物,且動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)PCT水平有助于指導(dǎo)膿毒癥感染患者的治療[18]。本研究結(jié)果顯示,模型組和低劑量PF組大鼠血清IL-6、PCT水平顯著高于假手術(shù)組,高劑量PF組大鼠血清PCT水平顯著高于假手術(shù)組,低劑量PF組和高劑量PF組大鼠血清IL-6、PCT水平顯著低于模型組,高劑量PF組大鼠血清IL-6、PCT水平顯著低于低劑量PF組;提示PF預(yù)處理可能通過(guò)抑制IL-6和PCT水平對(duì)膿毒癥腎損傷發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。

TLR4受體是免疫細(xì)胞表面識(shí)別病原的識(shí)別受體家族成員之一,在膿毒癥發(fā)生過(guò)程,可激活NF-κB,引起IL-6、PCT及腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的表達(dá),加重炎癥反應(yīng)[19-20]。NLRP3炎癥復(fù)合體是一組多蛋白組成的分子,由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白和半胱天冬酶前體-1組成的多蛋白復(fù)合體[21-22]。研究表明,NLRP3炎癥復(fù)合體主要參與AKI病理過(guò)程,可促進(jìn)Scr水平升高,增加中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),促進(jìn)炎癥反應(yīng)[23]。本研究結(jié)果顯示,模型組和低劑量PF組大鼠腎組織中TLR4、NF-κB、NLRP3 蛋白水平顯著高于假手術(shù)組,高劑量PF組大鼠腎組織中TLR4蛋白水平顯著高于假手術(shù)組,低劑量PF組和高劑量PF組大鼠腎組織中TLR4、NLRP3蛋白水平顯著低于模型組,高劑量PF組大鼠腎組織中NF-κB水平顯著低于模型組,高劑量PF組大鼠腎組織中TLR4、NLRP3蛋白水平顯著低于低劑量PF組;提示AKI大鼠腎組織中TLR4、NF-κB、NLRP3 蛋白表達(dá)水平顯著升高,而PF可抑制TLR4、NF-κB、NLRP3 的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路,從而對(duì)膿毒癥AKI發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié)論

PF干預(yù)可有效降低大鼠Scr、BUN及血清NGAL、IL-6和PCT水平,對(duì)AKI大鼠腎臟發(fā)揮一定保護(hù)性作用,其作用機(jī)制可能與抑制TLR4、NF-κB、NLRP3 的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控TLR4/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。