腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的shRNA敲低大鼠雙側(cè)臂旁外側(cè)核EP3受體對(duì)發(fā)熱反應(yīng)的影響

何田慧,王楠萍,吳思濠,魏滟麟,胥建輝,張 潔

外周注射脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)能夠誘導(dǎo)體溫調(diào)節(jié)中樞視前區(qū)合成釋放發(fā)熱介質(zhì)前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2),PGE2與誘導(dǎo)發(fā)熱的關(guān)鍵受體即EP3受體結(jié)合后,引起炎癥性發(fā)熱[1-4]。研究[5-7]表明,參與前饋體溫調(diào)節(jié)的臂旁外側(cè)核(lateral parabrachial nucleus, LPB)也介導(dǎo)了發(fā)熱反應(yīng)。在清醒和麻醉大鼠LPB局部應(yīng)用PGE2均能引起明顯的發(fā)熱反應(yīng),其效應(yīng)器機(jī)制與棕色脂肪代謝產(chǎn)熱和骨骼肌戰(zhàn)栗產(chǎn)熱增強(qiáng),尾部皮膚散熱減少有關(guān)[6-7]。在LPS致熱過(guò)程中,LPB局部能夠合成PGE2,而且不管是減少LPB的PGE2生成,還是直接毀損LPB,均減弱了LPS性發(fā)熱反應(yīng),提示LPB部分參與了LPS致熱反應(yīng),但LPB的PGE2是否通過(guò)EP3受體參與LPS性發(fā)熱尚不清楚。該實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾、腦立體定位、無(wú)線遙測(cè)、能量代謝測(cè)定和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法觀察敲低LPB的EP3受體表達(dá)對(duì)LPB微量注射PGE2和腹腔注射LPS引起的發(fā)熱反應(yīng)的影響,以研究EP3受體是否介導(dǎo)LPB PGE2參與LPS致熱反應(yīng)的過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量140～160 g,購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件下單籠飼養(yǎng)。腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)介導(dǎo) 的 AAV2-CMV-EGFP病毒(3.15×1012v.g./ml)及AAV2-shRNA-Ptger3(EP3)-EGFP病毒(3.42×1012v.g./ml)由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供, RNA Later購(gòu)自美國(guó)Life公司,TRIzol購(gòu)自美國(guó)Ivitrogen公司,PrimeScriptTMRT reagent Kit購(gòu)自大連TaKaRa公司,FastStart Essential DNA Probes Master及實(shí)時(shí)熒光PCR探針購(gòu)自美國(guó)Roche公司。腦立體定位儀(68018)購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司,動(dòng)物能量代謝分析系統(tǒng)(CLAMS-HC-8R)及溫度傳感器(G2 E-Mitter transponders)均購(gòu)自美國(guó)Columbus Instruments公司,冰凍切片機(jī)(CM1950)購(gòu)自德國(guó)Leica公司,自動(dòng)熒光顯微鏡(BX63)購(gòu)自日本奧林巴斯公司,實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(CFX96)購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 動(dòng)物分組20只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為shRNA-control組(對(duì)照組)和shRNA-EP3組(實(shí)驗(yàn)組)各 10只,每組動(dòng)物中,5只用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),5只用于體溫(Tcore)和能量代謝(EE)測(cè)定以及轉(zhuǎn)染情況觀察。分別向shRNA-control組和shRNA-EP3組大鼠LPB內(nèi)注射AAV2-CMV-EGFP和AAV2- shRNA-Ptger3-EGFP病毒,2周后植入溫度傳感器,3周后植入留置導(dǎo)管,4周后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠制備含有LPB冰凍腦切片觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.3 AAV2-shRNA-Ptger3-EGFP病毒合成shRNA干擾序列的篩選和病毒載體的構(gòu)建由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司完成。根據(jù)Ptger3(EP3受體)基因設(shè)計(jì)并合成3條shRNA干擾序列(表1)。經(jīng)過(guò)外源篩選有效RNAi載體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得知shRNA b序列對(duì)目的基因的表達(dá)有敲減作用,因而該靶點(diǎn)為有效靶點(diǎn)。最終通過(guò)AAV將shRNA b序列包裝為AAV2- shRNA-Ptger3-EGFP病毒。

表1 大鼠Ptger3的3條shRNA及陰性對(duì)照shRNA

1.4 腦立體定位和病毒干擾140～160 g的大鼠經(jīng)4%戊巴比妥鈉 (1 ml/kg,腹腔注射)麻醉后,進(jìn)行腦立體定位。LPB坐標(biāo)為前囟后8.30～8.35 mm,中線左右旁開(kāi)2.10 mm,深6.35～6.45 mm。每只大鼠LPB的2個(gè)位點(diǎn)分別注射250 nl病毒,注射速率為50 nl/min。3周后,于LPB上方植入留置導(dǎo)管。術(shù)后連續(xù) 3 d 肌肉注射頭孢曲松鈉(10 mg/100 g)以防止術(shù)后感染。

1.5 溫度傳感器植入和遙控測(cè)溫大鼠麻醉后,參照文獻(xiàn)[6-7]的方法,腹腔植入溫度傳感器。實(shí)驗(yàn)前連續(xù)7 d,每天上午10時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行頭頸部撫摸(handle),以減輕大鼠的應(yīng)激反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前1天下午,將大鼠移入清潔代謝籠,置于人工氣候箱內(nèi)的無(wú)線遙測(cè)接收板上進(jìn)行適應(yīng)性過(guò)夜,并開(kāi)啟動(dòng)物代謝分析系統(tǒng)監(jiān)測(cè)大鼠Tcore和EE。每日上午9:30—10:30利用大鼠頭部留置導(dǎo)管向大鼠LPB注射生理鹽水(0.1 μl)、PGE2(0.1 μg/0.1 μl)或腹腔注射脂多糖(100 μg/kg),隨后連續(xù)同步監(jiān)測(cè)記錄10 h大鼠自由活動(dòng)時(shí)的Tcore和EE。

1.6 AAV病毒轉(zhuǎn)染位點(diǎn)形態(tài)學(xué)檢測(cè)大鼠麻醉后,經(jīng)升主動(dòng)脈灌注生理鹽水和多聚甲醛溶液進(jìn)行前固定,剝離鼠腦后進(jìn)行后固定。用30%蔗糖溶液脫水,在冰凍切片機(jī)中沿冠狀面切片,制備30 μm厚含有LPB的腦切片,貼于黏附性玻片上,用抗熒光衰減封片劑封片后,用熒光顯微鏡檢測(cè)病毒注射的位點(diǎn)及轉(zhuǎn)染情況。

1.7 LPB EP3受體mRNA表達(dá)水平檢測(cè)大鼠麻醉后,斷頭取腦,參照文獻(xiàn)[6]用顯微鑷在冰上快速分離出LPB腦組織并轉(zhuǎn)移至RNA later中,儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取樣品總RNA,并測(cè)定總RNA的濃度和純度。引物由成都擎科梓熙科技有限公司合成(表2)。根據(jù)PrimeScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū),將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)FastStart Essential DNA Probes Master試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)和Ptger3(EP3受體)的mRNA水平。EP3受體mRNA通過(guò)β-actin(內(nèi)參)mRNA 表達(dá)水平進(jìn)行相對(duì)定量,計(jì)算方法為2-ΔΔCt。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物

2 結(jié)果

2.1 AAV成功轉(zhuǎn)染大鼠LPB并敲低LPB EP3受體mRNA的表達(dá)由于對(duì)照病毒和干擾病毒均攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白EGFP,故利用綠色熒光來(lái)觀察病毒表達(dá)部位。在熒光顯微鏡下觀察到shRNA-EP3組及shRNA-control組大鼠AAV病毒轉(zhuǎn)染均主要集中于LPB腦區(qū)(圖1A、B),提示AAV病毒成功轉(zhuǎn)染至兩組大鼠的LPB。接下來(lái),通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證2組大鼠LPB的EP3受體mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果顯示,與 shRNA-control 對(duì)照組相比,AAV病毒注射敲低了shRNA-EP3組大鼠LPB的EP3受體mRNA 的表達(dá)(P<0.05)(圖 1C)。提示,AAV 介導(dǎo)的 shRNA有效敲低了大鼠LPB EP3受體mRNA的表達(dá)。

圖1 病毒注射4周后大鼠 LPB轉(zhuǎn)染效果以及LPB EP3受體mRNA表達(dá)的變化

圖2 LPB應(yīng)用生理鹽水對(duì)shRNA-control組和shRNA-EP3組大鼠Tcore和EE的影響

2.2 敲低LPB的EP3受體表達(dá)對(duì)基礎(chǔ)體溫的影響shRNA-control組和shRNA-EP3組大鼠在24 ℃環(huán)境中的基礎(chǔ)體溫差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;向2組清醒大鼠LPB微量注射生理鹽水均引起Tcore和EE出現(xiàn)短暫輕微的升高,但2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 2)。

2.3 敲低LPB的EP3受體表達(dá)對(duì)LPB PGE2致熱作用的影響向shRNA-control組清醒大鼠LPB注射PGE2引起Tcore和EE均明顯升高,其峰值分別出現(xiàn)在給藥后的30 min和25 min。而往shRNA-EP3組大鼠LPB注射PGE2引起清醒大鼠Tcore和EE均僅有輕微升高,與shRNA-control組相比,Tcore升高作用明顯減弱,EE也有降低趨勢(shì)(圖3)。

2.4 敲低LPB的EP3受體表達(dá)對(duì)LPS性發(fā)熱的影響shRNA-control組大鼠腹腔注射LPS引起典型的雙相發(fā)熱,體溫分別在2.5 h和5.5 h左右達(dá)峰值,且均高于基礎(chǔ)體溫水平。shRNA-EP3組大鼠腹腔注射LPS后也引起體溫升高,5.5 h體溫與基礎(chǔ)體溫比較明顯升高,但與shRNA-control組相比,發(fā)熱反應(yīng)減弱,腹腔注射LPS后5.5 h的體溫明顯低于shRNA-control組,2.5 h的體溫也有降低趨勢(shì)(圖4)。

3 討論

在LPS等致熱源的刺激下,發(fā)熱介質(zhì)PGE2合成并釋放到參與體溫調(diào)節(jié)的腦區(qū),與其受體結(jié)合后引起發(fā)熱[1-4]。PGE2受體包括EP1-EP4 4個(gè)類型,其中EP3受體介導(dǎo)了PGE2的大部分中樞發(fā)熱效應(yīng),是誘導(dǎo)發(fā)熱的關(guān)鍵受體[2]。研究[6-7]表明,LPB也參與發(fā)熱反應(yīng),是PGE2在視前區(qū)外的又一致熱作用部位,但LPB PGE2的致熱作用是否由EP3受體介導(dǎo)尚需證實(shí)。該研究通過(guò)AAV介導(dǎo)的shRNA敲低大鼠LPB EP3受體表達(dá)的模型,觀察LPB EP3受體表達(dá)降低對(duì)發(fā)熱反應(yīng)的影響,以研究LPB EP3受體是否介導(dǎo)LPB PGE2的致熱作用以及LPS引起的全身性發(fā)熱反應(yīng)。該研究采用腦立體定位注射的方式將AAV直接注入LPB,并參考文獻(xiàn)[8],選擇注射AAV病毒4周這個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察病毒轉(zhuǎn)染和敲低效率。在熒光顯微鏡下,shRNA-EP3組及shRNA-control組大鼠AAV病毒轉(zhuǎn)染主要集中于LPB腦區(qū),確保了干擾部位的局限性;與shRNA-control對(duì)照組相比,shRNA-EP3組大鼠LPB的EP3受體mRNA的表達(dá)明顯減少,表明AAV2-shRNA-Ptger3-EGFP病毒有效敲低了LPB的EP3受體表達(dá)。shRNA-control 組和shRNA-EP3組大鼠的基礎(chǔ)體溫?zé)o明顯差異,LPB微量注射生理鹽水引起2組大鼠均出現(xiàn)核團(tuán)注射操作引起的Tcore和EE的短暫輕微升高,但2組間無(wú)明顯差異,提示,LPB EP3受體未參與基礎(chǔ)體溫的調(diào)節(jié)以及注射操作引起的應(yīng)激性體溫升高。往shRNA-control組清醒大鼠LPB注射PGE2引起EE和Tcore明顯升高,其峰值分別出現(xiàn)在給藥后的25 min和30 min,這與先前研究[6]LPB PGE2通過(guò)增加產(chǎn)熱,誘導(dǎo)發(fā)熱的結(jié)果一致。而向shRNA-EP3組大鼠LPB注射PGE2引起清醒大鼠Tcore和EE均僅有輕微升高,與shRNA-control組相比,Tcore升高作用明顯減弱,EE增加也有減弱趨勢(shì),提示EP3受體介導(dǎo)了LPB PGE2的致熱作用。

Oishi et al[9]研究表明,特異性敲除小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的EP3受體,消除了LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱反應(yīng),提示神經(jīng)系統(tǒng)的EP3受體介導(dǎo)了LPS性發(fā)熱。進(jìn)一步的研究[4]表明,視前區(qū)的EP3受體在LPS性發(fā)熱中起關(guān)鍵作用。另有報(bào)道[10]顯示,選擇性抑制環(huán)氧化酶-1,減少PGE2生成,可阻斷LPS誘導(dǎo)的發(fā)熱反應(yīng)和LPB等腦區(qū)的Fos蛋白(神經(jīng)元激活標(biāo)志物)表達(dá)。敲除PGE2合成的終端酶mPGES-1也明顯減少了LPS誘導(dǎo)的LPB等腦區(qū)Fos蛋白表達(dá)。先前實(shí)驗(yàn)[6-7]顯示,腹腔注射LPS后,大鼠LPB的環(huán)氧化酶-2與mPGES-1的mRNA和蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào);而且不管是向雙側(cè)LPB注射環(huán)氧化酶-2抑制劑減少PGE2的生成,還是應(yīng)用鵝膏氨酸直接毀損LPB,均減弱了LPS性發(fā)熱反應(yīng)幅度,提示,LPB合成的PGE2可能參與了LPS性發(fā)熱,但該過(guò)程是否由LPB EP3受體介導(dǎo)尚不清楚。在shRNA-control組中,大鼠腹腔注射LPS引起典型的雙相發(fā)熱,體溫分別在2.5 h和5.5 h左右達(dá)峰值,這與先前研究[1,6-7]報(bào)道的LPS致熱反應(yīng)一致,說(shuō)明AAV病毒注射對(duì)LPS性發(fā)熱沒(méi)有影響。在shRNA-EP3組,大鼠腹腔注射LPS后也引起體溫升高,5.5 h體溫明顯高于基礎(chǔ)體溫,但與shRNA-control組相比,發(fā)熱反應(yīng)明顯減弱,腹腔注射LPS后5.5 h的體溫低于shRNA-control組,提示敲低LPB EP3受體表達(dá)削弱了LPS引起的發(fā)熱,LPB EP3受體部分參與了LPS引起的全身性發(fā)熱。

綜上所述,敲低LPB的EP3受體表達(dá)不但削弱了LPB局部應(yīng)用PGE2引起的發(fā)熱反應(yīng),還減弱了腹腔注射LPS引起的全身性發(fā)熱。提示LPB PGE2的致熱作用由EP3受體介導(dǎo),表明除了視前區(qū)EP3受體,LPB的EP3受體也在LPS性發(fā)熱中起一定作用。