包被siRNA的葉酸改性聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯納米材料的制備及其表征

朱嫚嫚,程 勇,饒 鵬,張貴陽,劉 昊,肖 雷,劉加濤,

利用RNA干擾(RNA interference,RNAi)的新興療法能夠選擇性沉默目標(biāo)基因,精準(zhǔn)調(diào)控信號通路[1],常用于癌癥、遺傳性疾病和病毒感染等疾病的治療。但小干擾RNA(siRNA)為帶有陰電荷的水溶性大分子,易被清除,體內(nèi)生物利用率低。此外,siRNA還具有易被酶解,跨膜吸收差,并可通過與Toll樣受體的相互作用誘發(fā)機(jī)體不良反應(yīng)等缺點(diǎn)[2-3]。因此,為將siRNA運(yùn)送至特定的靶器官甚至是靶細(xì)胞并發(fā)揮特異性調(diào)控作用,常需對siRNA進(jìn)行特定修飾。近年來,以毒性和免疫原性低的納米載體作為siRNA遞送系統(tǒng)成為研究熱點(diǎn)。維生素E聚乙二醇1000琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)載體同時(shí)具有親水和疏水性基團(tuán),可顯著提高siRNA穩(wěn)定性和滲透性[4]。此外,活化巨噬細(xì)胞表面表達(dá)大量葉酸受體[5]。因此,以葉酸修飾TPGS作為載體,通過交聯(lián)作用構(gòu)建包裹X-框結(jié)合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)siRNA的葉酸改性聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯(folic acid modified TPGS, FA-TPGS)復(fù)合物并對其進(jìn)行表征鑒定,觀察其安全性和對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子XBP1s的敲降作用,以期為探究XBP1s在巨噬細(xì)胞表型和功能轉(zhuǎn)化中的作用并為靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的疾病治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器羅丹明B異硫氰酸酯、乙二胺、葉酸均購自美國Sigma-Aldrich公司; NaHCO3和硫酸鎂粉末均購自上海碧云天有限公司;TPGS和N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)均購自上海麥克林試劑公司;對甲苯磺酰氯(p-Toluene Sulfonyl Chloride,PTSC)、二氯甲烷、三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺(N, N-Dimethylformamide,DMF)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸[N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochl-oride,CDC]和1,4二氧六環(huán)均購自上海阿拉丁試劑公司。

細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司;青-鏈霉素、DAPI 染核液均購自上海碧云天有限公司;山羊抗兔蛋白激酶小鼠抗β-actin mAb購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;兔抗XBP1s mAb購自美國CST公司;細(xì)胞凋亡試劑盒購自上海貝博生物科技公司。

透射電子顯微鏡(Talos L120C G2,美國Thermo公司);動態(tài)光散射儀(Zeta sizer Nano-ZS, Malvern ZS90, 英國Malvern公司);紫外-可見分光光度計(jì)(UV-1900)、熒光吸收光譜儀(RF5301PC)(日本島津公司);全波長酶標(biāo)儀(Infinite M1000 PRO,瑞士Tecan公司);場發(fā)射掃描電子顯微鏡(GeminiSEM 300,德國蔡司公司);流式細(xì)胞儀(CytoFLEX,美國Beckman coulter公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7購自武漢普諾賽生命科技有限公司并在含有10% 胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長到80%左右更換培養(yǎng)基傳代。

1.3 羅丹明B修飾siRNA的合成無菌無酶環(huán)境下,將羅丹明B(rhodamine B,RhB)異硫氰酸鹽DMSO溶液(0.266 mg/ml,500 ml)加入到siXBP1無酶水溶液(1.65 mg/ml,1 ml,2 ∶1)中并充分搖動混勻后逐滴加入適量NaHCO3澄明上清液(0.1 ml,1 mol/L)以調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0,室溫下磁力攪拌過夜。將混合物置于截留分子量為1 000的透析袋中(9 L ddH2O)兩端用透析夾夾緊,于37 ℃ 條件下在磁力攪拌器上攪拌透析過夜,每8 h換液1次,并經(jīng)冷凍干燥48 h得到RhB修飾的siXBP1紅色粉末(RhB-siXBP1)。

1.4 FA改性TPGS的合成將0.19 g PTSC和1 g TPGS加至5 ml CH2Cl2溶液中,室溫下磁力攪拌并逐滴加入1.4 ml 三乙胺,反應(yīng)12 h后逐滴加入2～3滴濃鹽酸,以中和未反應(yīng)完全的三乙胺。加入適量硫酸鎂以去除多余水分,經(jīng)抽濾得濾液,并將濾液于室溫下旋蒸30 min。預(yù)冷的無水乙醚滴加到冷凝濾液中析出沉淀后于40 ℃干燥箱中干燥,得白色沉淀。氮?dú)鈼l件下將白色沉淀充分溶解于2 ml DMF溶液中,然后加入適量乙二胺,40 ℃下劇烈攪拌24 h得到TPGS-NH2配合物。

將等摩爾當(dāng)量的FA(2.207 mg)和CDC(0.857 mg)溶解于PBS緩沖液中,磁力攪拌30 min后,滴加等摩爾當(dāng)量的NHS(0.578 mg) 反應(yīng)3 h以活化FA。將TPGS-NH2(100 mg)充分溶解于2 ml PBS緩沖液中,然后逐滴滴加活化的FA溶液,室溫下磁力攪拌72 h并將混合物置于截留分子量為1 000的透析袋中(9 L ddH2O)于37 ℃條件下在磁力攪拌器上攪拌透析以去除多余反應(yīng)物。所得樣品經(jīng)冷凍干燥后得到姜黃色FA-TPGS油狀物。

1.5 FA-TPGS包被siRNA的合成將FA-TPGS和siXBP1按照一定比例混合均勻后(5 ∶1),通過交聯(lián)作用合成了FA-TPGS包裹siRNA的納米材料(FA-TPGS@RhB-siXBP1,簡寫為FT@XBP1)。首先,將FA-TPGS(2.24 mg)、RhB-siXBP1和1,4-二氧六環(huán)(2 ml)加入青霉素瓶中,超聲處理20 min后借助微型流量計(jì)進(jìn)行組裝(7 ml ddH2O)并于磁力攪拌器上快速攪拌2 h。將得到的樣本置于截留分子量為1 000的透析袋中透析,最后經(jīng)冷凍干燥得淡紅色粉末。

1.6 FT@XBP1的鑒定及表征

1.6.1TEM(transmission electron microscopy, TEM) 取FA-TPGS和FT@XBP1 100 μl PBS緩沖液[c(FA-TPGS):0.896 mg/ml]溶于ddH2O至適宜濃度,取100 μl左右液體滴至銅網(wǎng)上,空氣中自然干燥后利用透射電子顯微鏡鑒定FA-TPGS及FT@XBP1形態(tài)及粒徑大小,并拍照。

1.6.2動態(tài)光散射(dynamic light scattering, DLS) 取適宜濃度的FA-TPGS和FT@XBP1各100 μl,超聲波振蕩處理2 min左右后采用動態(tài)光散射儀室溫下測定納米載體及納米載體-siRNA復(fù)合物粒徑大小及分布情況。

1.6.3紫外可見光吸收光譜 應(yīng)用紫外吸收光譜儀觀測納米載體包裹siXBP1前后紫外吸收情況。分別取各樣品溶于100 μl PBS緩沖液[c(FA-TPGS):0.896 mg/ml]再用PBS緩沖液稀釋至適宜濃度。用紫外-可見分光光度計(jì)在260～280 nm范圍內(nèi)收集每個(gè)樣本的紫外-可見吸收光譜,最后利用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.6.4熒光吸收光譜 借助熒光吸收光譜儀觀察FT@XBP1及其對照組FT@NC熒光光譜圖。將 RhB 標(biāo)記的FT@NC和FT@XBP1溶于100 μl PBS緩沖液[c(FA-TPGS):0.448 mg/ml]再用PBS緩沖液稀釋至適宜濃度。采用熒光光譜儀室溫考察RhB的熒光變化情況。RhB的激發(fā)光波長為550 nm,最大發(fā)射波長為580 nm, 狹縫寬度設(shè)置為5 nm。最后用 Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.7 相對釋放將FT@XBP1納米顆粒分別分散在1 ml PBS(pH值為5.0和7.4)中并在室溫下置于截留分子量為15 000的透析袋中(9 L ddH2O)進(jìn)行透析,兩端用透析夾夾緊,于37 ℃條件下在磁力攪拌器上攪拌,分別于0、10、20、30和40 h取樣檢測,每次取透析介質(zhì) 2 ml,取后用等體積磷酸鹽緩沖液補(bǔ)充。采用全波長酶標(biāo)儀檢測siXBP1從FT@XBP1納米材料的釋放情況,按照公式[6]以時(shí)間為橫坐標(biāo),siRNA累積釋放率為縱坐標(biāo),做出siRNA的體外釋放研究曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,相關(guān)度為P<0.05。根據(jù)公式計(jì)算每個(gè)取樣點(diǎn)的累積藥物釋放量。

1.8 細(xì)胞相容性

1.8.1掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM) 將RAW264.7細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的接種密度接種于鋪有無菌10 mm圓形玻片的6孔板中,待細(xì)胞貼壁生長40%～50%,將FA-TPGS以及FT@XBP1納米材料[c(FA-TPGS):2.4 μg/ml]與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 共孵育48 h。刺激結(jié)束后,棄培養(yǎng)上清液,并用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞,將樣品用5% 戊二醛(1 ml)固定過夜,并依次加入一系列乙醇(30%、50%、70%、80%、90%和100%)進(jìn)行樣本脫水處理。樣本經(jīng)冷凍保存并噴金后借助掃描電子顯微鏡進(jìn)行拍攝。

1.8.2CCK-8檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞,計(jì)數(shù)后按照3×103個(gè)/孔接種到96孔板中。待細(xì)胞融合度達(dá)60%～70% 后,以PBS組為對照,每組分別加FA-TPGS和FT@XBP1[c(FA-TPGS):2.4 μg/ml]繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后,每孔加入 CCK-8 試液 10 μl,避光孵育2～4 h,最后在酶標(biāo)儀上檢測OD450數(shù)值,計(jì)算FA-TPGS和FT@XBP1對RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響。

1.8.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 為了研究FT@XBP1納米材料對巨噬細(xì)胞凋亡的影響,課題組使用FT@XBP1納米材料和對照組刺激細(xì)胞48 h后棄掉培養(yǎng)基,以1 200 r/min離心5 min收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS清洗3次后按照說明書加入結(jié)合液,混合均勻后避光加入10 μl Annexin V吹打混勻,繼續(xù)加入15 μl PI溶液避光孵育15 min,最后通過流式細(xì)胞儀獲得數(shù)據(jù),并計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。

1.9 激光共聚焦檢測細(xì)胞攝取將RAW264.7細(xì)胞以5×104個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種在激光共聚焦小皿中培養(yǎng),約6 h后,加入FT@XBP1[c(FA-TPGS):5 μg/ml]與RAW264.7 細(xì)胞共孵育24 h,棄上清液,用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞,4% 多聚甲醛 200 μl固定細(xì)胞5～10 min, 室溫下在5% BSA溶液中封閉1 h, 最后用含抗熒光淬滅劑的DAPI染色5～10 min后于激光共聚焦顯微鏡鏡下拍攝。

1.10 Western blot實(shí)驗(yàn)應(yīng)用FT@XBP1納米材料轉(zhuǎn)染RAW264.7 細(xì)胞48 h后通過Western blot技術(shù)檢測經(jīng)FT@XBP1處理后巨噬細(xì)胞XBP1s的表達(dá)水平。簡而言之,提取細(xì)胞蛋白質(zhì)后通過聚丙烯酸凝膠電泳將目標(biāo)蛋白(10～20 μg)轉(zhuǎn)至 PVDF 膜上,封閉后,再用 PBS 清洗 3次,每次8 min, 后與按比例進(jìn)行稀釋(1 ∶1 000)的特異性一抗(β-actin和XBP1s)4 ℃孵育過夜,次日將條帶與相應(yīng)種屬的二抗室溫下共孵育1 h, 最后使用發(fā)光成像系統(tǒng)檢測熒光信號并拍攝。

2 結(jié)果

2.1 FT@XBP1顆粒大小及粒徑分布構(gòu)建了包被XBP1 siRNA的葉酸改性TPGS納米載體(FT@XBP1),如圖TEM(圖1A)和DLS(圖1B)所示,FT@XBP1聚合物外觀呈球形,尺寸均勻,與FA-TPGS納米載體的顆粒大小接近,平均粒徑為(200±20)nm。

圖1 FA-TPGS和FT@XBP1的顆粒大小和粒徑分布

2.2 FT@XBP1的特征峰鑒定熒光光譜顯示,FT@NC和FT@XBP1均在550 nm左右處顯現(xiàn)RhB的特征吸收峰(圖2A)。紫外吸收光譜圖表明,FA-TPGS、FT@XBP1在220～300 nm處均有FA-TPGS的特征吸收峰,并且RhB修飾的siXBP1和FA-TPGS聚合交聯(lián)后,分別在350 nm和550 nm左右顯示出siRNA的小的吸收峰,這表明FA-TPGS和RhB-siXBP1成功結(jié)合(圖2B)。

2.3 FT@XBP1相對釋放將FT@XBP1置于不同pH值的PBS溶液中,由圖3可見,RhB-siXBP1 在pH 5.0的PBS溶液中24 h累積釋放量高達(dá)(69.65±3.95)%,并且在36 h保持不變,而在pH 7.4的PBS溶液中時(shí),RhB-siXBP1的相對釋放率穩(wěn)定在(52.28±4.69)% 左右。上述結(jié)果提示,酸性條件有利于RhB-siXBP1從FA-TPGS納米載體中的釋放。

圖3 FT@XBP1的相對釋放(n=3)

2.4 RAW264.7細(xì)胞攝取FT@XBP1通過激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7與FT@XBP1共孵育24 h后紅色熒光的分布情況。結(jié)果顯示,RhB(紅色)標(biāo)記的聚合物可以被巨噬細(xì)胞成功攝取并吞入細(xì)胞質(zhì),部分進(jìn)入細(xì)胞核(圖4)。

圖4 激光共聚焦顯微鏡檢測RAW264.7細(xì)胞攝取FT@XBP1

2.5 FT@XBP1的安全性通過SEM、CCK-8和凋亡試驗(yàn)檢測FT@XBP1的細(xì)胞毒性。將FA-TPGS和FT@XBP1分別與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7共培養(yǎng)48 h。如圖5A所示,SEM成像顯示與FA-TPGS相比,FT@XBP1對RAW264.7細(xì)胞狀態(tài)幾乎無影響。分別使用不同濃度的FA-TPGS和FT@XBP1與RAW264.7共培養(yǎng)48 h,CCK-8試驗(yàn)顯示FT@XBP1在濃度為0.15～4.80 μg/ml范圍內(nèi)幾乎不降低巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力(圖5B)。并且凋亡檢測也表明,與PBS組相比,FT@XBP1在2.40 μg/ml的濃度下對巨噬細(xì)胞凋亡無明顯影響(F=3.314,P=0.122)(圖5C、D)。結(jié)果顯示,FT@XBP1對巨噬細(xì)胞具有良好的細(xì)胞相容性和安全性。

圖5 FT@XBP1對巨噬細(xì)胞的安全性分析

2.6 FT@XBP1的敲降作用通過Western blot方法檢測FT@XBP1對巨噬細(xì)胞XBP1s的敲除作用。如圖6所示,與FT@NC組相比,2.40 μg/ml的FT@XBP1刺激RAW264.7細(xì)胞48 h后能明顯降低巨噬細(xì)胞XBP1s的表達(dá)(F=22.601,P<0.001)。

圖6 FT@XBP1對巨噬細(xì)胞XBP1s的沉默作用

3 討論

巨噬細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分,也是參與炎癥反應(yīng)和損傷-修復(fù)的重要細(xì)胞成分,在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。根據(jù)經(jīng)典學(xué)說,活化的巨噬細(xì)胞通常分為兩種表型,即經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2巨噬細(xì)胞。研究表明,巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在多種疾病的發(fā)生發(fā)展和治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用。如特異性阻斷髓系LDH-A可將TAM向抗腫瘤表型轉(zhuǎn)變,同時(shí)改善腫瘤細(xì)胞浸潤[7],IL4/IL13激活的M2樣巨噬細(xì)胞有助于組織修復(fù)和炎癥消退,從而保護(hù)動脈粥樣硬化[8]。因此,靶向調(diào)控巨噬細(xì)胞表型重編程可能是有效的疾病治療策略。

營養(yǎng)缺乏、低氧、高代謝需求和氧化應(yīng)激等都會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)折疊功能的紊亂,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS),進(jìn)而激活UPR反應(yīng)[9]。該課題組前期研究[10]表明,肝癌細(xì)胞可以將ERS信號傳遞給微環(huán)境的巨噬細(xì)胞,促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2轉(zhuǎn)化。也有研究[11]報(bào)道,ERS可能是巨噬細(xì)胞M2表型轉(zhuǎn)化所必須的因素但ERS的腫瘤細(xì)胞如何調(diào)控微環(huán)境中浸潤的巨噬細(xì)胞M1/M2型轉(zhuǎn)化尚不清楚。IRE1α-XBP1是UPR反應(yīng)中最保守的通路,有文獻(xiàn)[12]報(bào)道,IRE1α-XBP1通路在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮至關(guān)重要的調(diào)控作用。如急性肝損傷期間,敲除XBP1損害線粒體自噬激活巨噬細(xì)胞中的mtDNA-cGAS-STING信號加劇損傷。此外,XBP1s高表達(dá)與腫瘤進(jìn)展、不良預(yù)后和耐藥呈正相關(guān)[13]。因此,通過靶向調(diào)控IRE1α-XBP1下游關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子XBP1s調(diào)控巨噬細(xì)胞表型重塑,恢復(fù)微環(huán)境免疫平衡狀態(tài)值得深入研究。

靶向調(diào)控微環(huán)境巨噬細(xì)胞及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平,重塑巨噬細(xì)胞極化狀態(tài),進(jìn)而恢復(fù)免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)一直是腫瘤及炎癥相關(guān)疾病治療中面臨的巨大挑戰(zhàn)。腫瘤細(xì)胞和活化的巨噬細(xì)胞表面均過表達(dá)葉酸受體(folic acid receptor,FRs),且這些受體表現(xiàn)出高親和力、低免疫原性,而FRs在正常的組織中含量較少[14],這提示可以用葉酸(FA)修飾的納米載體荷載藥物或核酸等物質(zhì)發(fā)揮治療作用。TPGS是天然維生素E的兩親性衍生物,包含親脂性部分和聚乙二醇(PEG)的親水性部分,具有高滲透性,已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)應(yīng)用于食品和藥物的安全輔助劑。研究[7]表明TPGS不僅可以作為納米顆粒的基質(zhì)材料,用于疏水藥物的高效封裝,而且它與藥物聚合成膠束的時(shí)候,會提高胃腸道的吸收率,因此,可以明顯地提高利用率。更重要的是,TPGS不僅具有小粒徑、低毒性、緩釋性以及轉(zhuǎn)染效率高等特點(diǎn),而且對癌細(xì)胞有選擇性的細(xì)胞毒性活性。因此,TPGS可能是遞送 siRNA的理想載體。該研究通過交聯(lián)作用制備葉酸修飾的TPGS納米載體,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建有效包載、穩(wěn)定釋放XBP1 siRNA的納米載藥系統(tǒng)FT@XBP1,體外研究表明FT@XBP1可被巨噬細(xì)胞有效攝取,在不影響細(xì)胞增殖和凋亡的情況下即可顯著抑制XBP1s表達(dá),為開發(fā)以巨噬細(xì)胞和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1α-XBP1通路為靶點(diǎn)的治療策略提供依據(jù)。