基于能量代謝分析白藜蘆醇對(duì)H2O2誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用

王淑靜,黃冬梅,王立,謝雯

(1.廈門醫(yī)學(xué)院,福建 廈門 361023;2.機(jī)能與臨床轉(zhuǎn)化福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361023)

目前,人口老齡化已成為社會(huì)性問(wèn)題,包括阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)、帕金森病(Parkinson′s disease,PD)以及亨廷頓病(Huntington disease,HD)等在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative disease,NDDs)的發(fā)病率隨著人口老齡化問(wèn)題的嚴(yán)重,呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。研究表明,神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生常常伴隨神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的發(fā)生,而氧化應(yīng)激與能量產(chǎn)生密切相關(guān),神經(jīng)細(xì)胞具有獨(dú)特的能量代謝方式,其主要依靠葡萄糖有氧氧化和糖酵解提供能量,且糖酵解占有相當(dāng)大的比重,研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)能量代謝障礙是阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經(jīng)退行性變的啟動(dòng)因素和核心環(huán)節(jié)[2],而神經(jīng)細(xì)胞能量代謝障礙與氧化損傷之間的關(guān)系還不十分清楚。多酚類化合物白藜蘆醇(Res)廣泛存在于多種植物中,其具有一定的抗氧化作用,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[3]。近期一些研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠通過(guò)影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá),從而影響神經(jīng)退行性疾病模型中大鼠的糖代謝產(chǎn)能[4],且其抗氧化作用與線粒體的功能密切相關(guān),而線粒體又是機(jī)體主要的產(chǎn)能細(xì)胞器,因此推測(cè)白藜蘆醇的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其影響大腦能量供應(yīng)有關(guān)。本課題在體外通過(guò)H2O2致SH-SY5Y細(xì)胞損傷來(lái)模擬體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷,通過(guò)白藜蘆醇組和H2O2氧化損傷組比較,檢測(cè)用藥后細(xì)胞活力的變化,能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)、酶活力及代謝產(chǎn)物的含量,探究白藜蘆醇對(duì)神經(jīng)細(xì)胞糖代謝產(chǎn)能的影響及氧化損傷保護(hù)作用,為白藜蘆醇神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制的研究提供新的思路。

1 材料

1.1 試劑、試藥SH-SY5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院凍存);白藜蘆醇(純度≥98%,美國(guó)Sigma公司);己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)、丙酮酸激酶(PK)、乳酸脫氫酶(LDH)、三磷酸腺苷(ATP)含量測(cè)定,葡萄糖測(cè)定等試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)抗體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLUT-1)、β-actin抗體為美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 主要儀器Mco-15AC型 CO2培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司);CKX 41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司);3K30型高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司);Model 680 型酶標(biāo)儀、Mini-Protean 電泳儀、TRANS OT-SD電轉(zhuǎn)槽(美國(guó)Bio-Rad公司);TanonGIS -2019凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞用0.25%的胰酶消化,制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為6×104個(gè)/mL。每孔100 μL接種于96孔板,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)24 h。吸棄培養(yǎng)液,白藜蘆醇組加入白藜蘆醇使其終濃度分別為1、2、4、6、8、10、20 μmol·L-1,空白組和H2O2氧化損傷組加入等量培養(yǎng)基,溶劑對(duì)照組加入0.2‰ DMSO,培養(yǎng)24 h。棄原液,H2O2氧化損傷組和白藜蘆醇組加入終濃度為1.2 mmol·L-1H2O2進(jìn)行氧化損傷,空白組加入等量無(wú)血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,每孔加10 μL MTT(5 mg·mL-1)培養(yǎng)4 h,加入150 μL DMSO振蕩混勻,酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度(OD)值,計(jì)算抑制率。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)Annexin V單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SH-SY5Y細(xì)胞用0.25%胰酶消化,制成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL。6孔板每孔加1 mL細(xì)胞懸液,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)24 h。

細(xì)胞進(jìn)行分組和加藥處理:白藜蘆醇分為4組,加入白藜蘆醇,使其終濃度分別為20、10、5、1 μmol·L-1,EDA(依達(dá)拉奉)組作為陽(yáng)性對(duì)照組,其終濃度為10 μmol·L-1,空白對(duì)照組和H2O2氧化損傷組加等量培養(yǎng)基,37 ℃,5% CO2培養(yǎng)24 h,吸棄原液,白藜蘆醇不同濃度組、H2O2氧化損傷組和EDA組每孔加入H2O2使其終濃度為1.2 mmol·L-1,空白對(duì)照組加入等量無(wú)血清培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

采用流式細(xì)胞術(shù)Annexin V單染法分別檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,具體方法見文獻(xiàn)和試劑盒說(shuō)明[5]。

2.3 細(xì)胞能量代謝相關(guān)酶活力及代謝物含量檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行分組和加藥處理具體操作同“2.2”項(xiàng)下,取2 mL細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸取部分培養(yǎng)液上清備用,胰酶消化后,吹打成細(xì)胞懸液并收集,4 ℃,3 000 r·min-1離心10 min。棄上清,1 mL生理鹽水重懸,3 000 r·min-1離心10 min,重復(fù)2次,收集備用。

葡萄糖消耗量和LDH樣品:直接收集培養(yǎng)液上清進(jìn)行測(cè)定。

HK、PFK、PK、SDH樣品:按照說(shuō)明書加入提取液重懸細(xì)胞,超聲破碎后, 取20 μL破碎后的樣品用于蛋白濃度測(cè)定,其余樣品-80 ℃保存待測(cè)。

ATP樣品:熱水浴中使用玻璃勻漿器手動(dòng)勻漿破碎3 min,吸取懸液于沸水浴中加熱10 min,渦旋混勻后,20 μL樣品用于蛋白濃度測(cè)定,其余樣品-80 ℃保存待測(cè)。

樣品制備完成后,測(cè)定計(jì)算葡萄糖消耗量、ATP含量、HK、PFK、PK、LDH、SDH酶活力,具體方法均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行[6]。

2.4 Western blot法檢測(cè)HIF-1α、GLUT-1蛋白表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行分組和加藥處理具體操作同“2.2”項(xiàng)下,冷PBS(4 ℃)洗滌細(xì)胞3次,每瓶加入100 μL細(xì)胞裂解液冰上裂解5 min;4 ℃,12 000×g,離心5 min,取上清-20 ℃保存,BCA法進(jìn)行蛋白定量。10% SDS-PAGE電泳分離蛋白,半干轉(zhuǎn)膜后,將膜用奶粉封閉液封閉,60 r·min-1搖床室溫孵育15 h。選用TBST稀釋一抗(β-actin:1∶3 000、GLUT-1:1∶500、HIF-1α:1∶500)將稀釋好的抗體和膜一起孵育,60 r·min-1搖床室溫孵育1 h,4 ℃過(guò)夜。TBST洗滌3次后將NC膜放入封膜袋中,加入二抗,60 r·min-1室溫孵育1 h。ECL顯色,凝膠成像系統(tǒng)拍照顯影。使用AzureSpot和Image J軟件分析條帶并計(jì)算蛋白表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響MTT結(jié)果顯示,加入1.2 mmol·L-1H2O2的氧化損傷組SH-SY5Y細(xì)胞抑制率為29.57%。與H2O2氧化損傷組相比,4～20 μmol·L-1的白藜蘆醇處理氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.01),在1～10 μmol·L-1范圍內(nèi),隨著白藜蘆醇濃度的增加,抑制率逐漸降低,其中10 μmol·L-1的白藜蘆醇抑制率最低為8.31%,在1～2 μmol·L-1范圍內(nèi),白藜蘆醇組細(xì)胞抑制率明顯降低(P<0.05),根據(jù)以上結(jié)果,選取20、10、5、1 μmol·L-1的白藜蘆醇進(jìn)行預(yù)處理氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞24 h,探究其對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用。

圖1 不同濃度白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力影響 注:與H2O2損傷組相比,#P<0.05,##P<0.01。

3.2 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率,與對(duì)照組相比, H2O2氧化損傷組SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01),為33.9%,與H2O2氧化損傷組比較,20、10、5 μmol·L-1的白藜蘆醇及EDA預(yù)處理后細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.01),其中10 μmol·L-1的白藜蘆醇的凋亡率為21.5%,均低于20 μmol·L-1和5 μmol·L-1白藜蘆醇組,說(shuō)明10 μmol·L-1的白藜蘆醇作用效果較好。1 μmol·L-1的白藜蘆醇組細(xì)胞凋亡率與H2O2氧化損傷組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

3.3 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞葡萄糖消耗量和ATP含量影響細(xì)胞主要依靠葡萄糖分解,產(chǎn)生大量能量ATP,滿足生理活動(dòng)需要。與對(duì)照組相比,H2O2氧化損傷組細(xì)胞的葡萄糖消耗量、ATP含量顯著降低(P<0.01),說(shuō)明H2O2降低細(xì)胞的葡萄糖分解產(chǎn)能;與氧化損傷模型組比較,20、10以及5 μmol·L-1白藜蘆醇預(yù)處理組細(xì)胞葡萄糖消耗量、ATP含量顯著升高(P<0.01),1 μmol·L-1白藜蘆醇預(yù)處理組葡萄糖消耗量與損傷組無(wú)顯著性差異(P>0.05),20、10以及5 μmol·L-1白藜蘆醇可提高氧化損傷SH-SY5Y葡萄糖的分解,促進(jìn)能量ATP的生成,其中白藜蘆醇10 μmol·L-1的作用效果較好。

表1 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞葡萄糖消耗量和ATP含量影響

3.4 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞糖酵解酶活力影響與對(duì)照組相比,H2O2氧化損傷組SH-SY5Y細(xì)胞HK活力、細(xì)胞外LDH活力顯著升高(P<0.01);PFK活力、PK活力顯著降低(P<0.01);與H2O2氧化損傷組相比,20、10、5 μmol·L-1的白藜蘆醇預(yù)處理后SH-SY5Y細(xì)胞HK活力、細(xì)胞外LDH活力明顯降低(P<0.01),PFK活力、PK活力顯著升高(P<0.01)。1 μmol·L-1的白藜蘆醇的作用較弱,其可引起氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞PFK明顯升高(P<0.05),PK活力無(wú)顯著性差異(P>0.05),其中10 μmol·L-1白藜蘆醇預(yù)處理組HK活力、LDH活力低于其他3個(gè)濃度,PFK活力、PK活力高于其他3個(gè)濃度。PFK、PK是糖酵解中可調(diào)節(jié)得最主要的關(guān)鍵酶,說(shuō)明不同濃度白藜蘆醇可不同程度提高氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞的糖酵解產(chǎn)能,其中10 μmol·L-1白藜蘆醇組作用較強(qiáng)。

表2 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞糖酵解酶活力的影響

圖2 白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響 注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與H2O2氧化損傷組相比,#P<0.05,##P<0.01。

3.5 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞三羧酸循環(huán)酶SDH活力影響琥珀酸脫氫酶(SDH)是三羧酸循環(huán)中唯一嵌入到線粒體內(nèi)膜上的酶,能夠反映線粒體的結(jié)構(gòu)和功能,其催化反應(yīng)后脫下的氫可進(jìn)入氧化磷酸化生成ATP,與能量生成密切相關(guān)。與對(duì)照組相比,H2O2氧化損傷模型組SH-SY5Y細(xì)胞中SDH的活力顯著降低(P<0.01);與H2O2氧化損傷模型組相比,20、10、5、1 μmol·L-1的白藜蘆醇及陽(yáng)性藥EDA預(yù)處理后SDH活力顯著增高(P<0.01),說(shuō)明不同濃度的白藜蘆醇及EDA可提高SDH的活力,提高細(xì)胞三羧酸循環(huán)產(chǎn)能水平,其中10 μmol·L-1的SDH活力高于其他濃度白藜蘆醇組。

表3 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞SDH活力的影響

3.6 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比,H2O2氧化損傷組SH-SY5Y細(xì)胞GLUT-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01),HIF-1α的表達(dá)顯著升高(P<0.01);與H2O2氧化損傷組相比,20、10和5 μmol·L-1的白藜蘆醇預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞中GLUT-1表達(dá)量顯著升高(P<0.01),1 μmol·L-1的白藜蘆醇GLUT-1表達(dá)量無(wú)顯著變化(P>0.05);Res 20 μmol·L-1預(yù)處理組HIF-1α的表達(dá)量明顯降低(P<0.05),10 μmol·L-1的白藜蘆醇組HIF-1α的表達(dá)量非常顯著性降低(P<0.01),5和1 μmol·L-1組HIF-1α的表達(dá)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。說(shuō)明不同濃度白藜蘆醇對(duì)GLUT-1和HIF-1α蛋白表達(dá),葡萄糖的代謝影響不同,其中10 μmol·L-1的白藜蘆醇作用較強(qiáng)。

圖3 白藜蘆醇對(duì)H2O2氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 注:與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01;與H2O2損傷組相比,#P<0.05,##P<0.01。

4 討論

神經(jīng)退行性疾病具有年齡依賴性,隨著人口老齡化程度加劇,發(fā)病率逐年上升,神經(jīng)退行性疾病患病時(shí)間長(zhǎng)、難治愈,嚴(yán)重危害老年人的生理和心理,給家庭和社會(huì)帶來(lái)巨大負(fù)擔(dān)。氧化損傷是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病最常見的因素,H2O2是體內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物,能夠穿透細(xì)胞膜,轉(zhuǎn)化為ROS,造成氧化損傷,被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)元氧化應(yīng)激模型的建立中。人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞的生理功能、形態(tài)以及生化特點(diǎn)等與人神經(jīng)元細(xì)胞相似[7],因此選用H2O2體外損傷SH-SY5Y細(xì)胞作為神經(jīng)元細(xì)胞氧化損傷的模型。

前期實(shí)驗(yàn)采用MTT法體外檢測(cè)不同濃度的H2O2對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的增殖抑制作用,當(dāng)H2O2濃度高于1.3 mmol·L-1時(shí),抑制率超過(guò)60%,低于1.2 mmol·L-1時(shí),抑制率低于30%,根據(jù)抑制率和IC50值,選取1.2 mmol·L-1作為后續(xù)氧化損傷濃度。結(jié)合細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn),證明1.2 mmol·L-1的H2O2可造成SH-SY5Y細(xì)胞氧化損傷。

白藜蘆醇具有改善中樞神經(jīng)退行性病變,降低炎癥因子的釋放,抗氧化損傷,保護(hù)神經(jīng)元等活性,其可影響葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)及線粒體功能,對(duì)糖代謝及能量生成有一定影響,但白蘆藜醇具有雙重性,在一定濃度范圍可發(fā)揮保護(hù)作用,但在超過(guò)一定的濃度就有細(xì)胞毒性,結(jié)合文獻(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室之前的研究,選用40 μmol·L-1作為最大給藥濃度進(jìn)行關(guān)于SH-SY5Y細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),MTT結(jié)果顯示,隨白藜蘆醇濃度升高,抑制率也隨之升高,但當(dāng)濃度在低于20 μmol·L-1范圍內(nèi),抑制率在8%以下,細(xì)胞毒性較低,因此,初步選取濃度20 μmol·L-1以下作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥濃度。與氧化損傷組相比,4～20 μmol·L-1白藜蘆醇細(xì)胞抑制率顯著降低(P<0.01)。當(dāng)白藜蘆醇濃度為10 μmol·L-1時(shí),抑制率最低,根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,初步選取20、10、5以及1 μmol·L-1的白藜蘆醇進(jìn)行預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h,探究其H2O2氧化損傷的保護(hù)作用。流式細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與H2O2氧化損傷組相比,20、10以及5 μmol·L-1白藜蘆醇抑制細(xì)胞凋亡,具有保護(hù)作用,其中10 μmol·L-1白藜蘆醇作用較強(qiáng)。

腦內(nèi)能量主要來(lái)源于葡萄糖,研究人員通過(guò)利用正電子發(fā)射斷層顯像技術(shù),對(duì)健康成年人腦內(nèi)的氧和糖代謝速率進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在大腦前額皮質(zhì)、外側(cè)頂葉皮質(zhì)等部位發(fā)現(xiàn)了有氧糖酵解的高速運(yùn)行,在海馬、小腦等組織內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了低速糖酵解的發(fā)生[8]。糖酵解和有氧氧化是糖分解產(chǎn)能的主要途徑,當(dāng)神經(jīng)元供能不足時(shí)會(huì)引起功能障礙,白藜蘆醇影響糖代謝及能量生成,但其對(duì)神經(jīng)元退行性改變是否與能量生成有關(guān)還不清楚,因此選用HK、PFK、PK以及LDH活力檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)氧化損傷SH-SY5Y細(xì)胞中糖酵解影響。選用SDH活力檢測(cè)其對(duì)線粒體氧化磷酸化產(chǎn)能影響,選用葡萄糖消耗及ATP含量檢測(cè)其對(duì)葡萄糖攝取、產(chǎn)能影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與氧化損傷組比較,20、10以及5 μmol·L-1白藜蘆醇預(yù)處理后,糖酵解和氧化磷酸化相關(guān)酶活力具有顯著變化,葡萄糖消耗量及ATP含量顯著升高(P<0.01)。以上數(shù)據(jù)顯示,20,10以及5 μmol·L-1白藜蘆醇通過(guò)調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)酶活力,促進(jìn)葡萄糖攝取,提高葡萄糖產(chǎn)生能量ATP,對(duì)H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞的氧化損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。其中10 μmol·L-1的白藜蘆醇作用較強(qiáng)。

神經(jīng)元通過(guò)多種途徑調(diào)控GLUT-1的表達(dá),影響攝取葡萄糖,進(jìn)而影響糖酵解和糖有氧氧化產(chǎn)能過(guò)程[9],HIF-1α是能量代謝的重要調(diào)控蛋白,有研究表明,當(dāng)缺氧或者神經(jīng)細(xì)胞受到刺激時(shí),HIF-1α升高,抑制線粒體功能及產(chǎn)能過(guò)程[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,H2O2氧化損傷后HIF-1α的表達(dá)量顯著升高,GLUT-1表達(dá)顯著降低。經(jīng)過(guò)20、10 μmol·L-1白藜蘆醇預(yù)處理后,HIF-1α的表達(dá)量顯著降低,GLUT-1的表達(dá)顯著升高。說(shuō)明白藜蘆醇可通過(guò)影響能量代謝相關(guān)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)能量代謝過(guò)程,從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以得出,一定濃度的白藜蘆醇可通過(guò)影響能量代謝相關(guān)蛋白表達(dá),促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn),提高葡萄糖氧化分解代謝,促進(jìn)產(chǎn)能,對(duì)氧化損傷的SH-SY5Y細(xì)胞具有保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)為神經(jīng)退行性疾病的作用機(jī)制研究提供新的思路,對(duì)白蘆藜醇等相關(guān)藥物開發(fā)具有指導(dǎo)意義。