苯醚甲環(huán)唑?qū)煵莩嘈遣【囊志钚约盁熑~葉際微生物的影響

張 藝，汪漢成，張興紅，張 林，郭沫言，3，向立剛，3，蔡劉體，王 豐

（1.貴州大學 農(nóng)學院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省煙草科學研究院，貴州 貴陽 550081；3.長江大學 農(nóng)學院，湖北 荊州 434025）

由子囊菌亞門鏈格孢屬真菌（Alternariasp.）引起的煙草赤星病（Tobacco brown spot）是煙草成熟期的主要病害[1]，在溫濕度適宜的條件下，短時間內(nèi)可大面積流行[2]，危害嚴重時多個病斑可連接成片，形成黑褐色大面積病斑。該病害常引起煙葉產(chǎn)質(zhì)量下降，給煙農(nóng)造成嚴重經(jīng)濟損失，其防治以化學防治為主。苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）作為三唑類殺菌劑的典型代表，被全球多個國家登記用來防治鏈格孢屬真菌引起的植物病害[3]。該藥劑對煙草褐斑病[4]、蘋果黑星病[5]、小麥紋枯病[6]均有較好的防治效果。它主要通過抑制羊毛甾醇轉(zhuǎn)化為麥角甾醇過程中的羊毛甾醇或24-亞甲基二氫羊毛甾醇的C-14 去甲基化，抑制真菌甾醇的生物合成，破壞真菌細胞膜結(jié)構(gòu)功能，達到殺菌目的，具有高效、廣譜、低毒、用量低、內(nèi)吸性強等特點[7-8]。苯醚甲環(huán)唑在我國西部煙葉產(chǎn)區(qū)已開始用于煙草赤星病和白粉病的防治。

煙葉葉際微生物與煙草葉斑類病害的發(fā)生密切相關(guān)，葉片作為微生物的主要棲息地，為葉際微生物的定殖提供了良好的生存環(huán)境[9-10]。目前，關(guān)于煙草赤星病危害期葉際真菌和細菌的菌群組成已有報道。劉亭亭等[11]研究發(fā)現(xiàn)，赤星病發(fā)生時不同成熟度煙葉葉際優(yōu)勢真菌均為鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬，優(yōu)勢細菌均為假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。劉暢等[12]研究發(fā)現(xiàn)，感赤星病煙葉葉際細菌群落中存在大量泛菌屬。DAI 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，感赤星病煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)與煙葉葉位空間及煙葉成熟時間密切相關(guān)，但優(yōu)勢真菌主要為鏈格孢屬、Symmetrospora、莖點霉屬等。病害的發(fā)生會改變?nèi)~際微生物的群落結(jié)構(gòu)與多樣性，葉際微生物的菌群組成也會影響病害的發(fā)生；同時，葉際微生物的菌群結(jié)構(gòu)也會受到外界環(huán)境的影響，特別是煙葉生產(chǎn)中施用的化學農(nóng)藥。已有研究發(fā)現(xiàn)，菌核凈可顯著抑制煙葉葉際鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬菌群的豐度[14]，甲氧基丙烯酸酯類的醚菌酯在防治煙草赤星病的過程中可顯著抑制鏈格孢屬、假單胞菌屬、泛菌屬等菌屬的豐度[15]。作為三唑類殺菌劑的典型藥劑，苯醚甲環(huán)唑在煙草上正逐步推廣應用，其對煙草赤星病菌的生物活性及對煙葉葉際微生物的影響規(guī)律仍不明確。為此，采用菌絲生長速率法測定了苯醚甲環(huán)唑?qū)Τ嘈遣【亩玖Γ⒉捎酶咄繙y序技術(shù)和Biolog 代謝表型技術(shù)，分析苯醚甲環(huán)唑施藥后健康煙葉與感赤星病煙葉葉際真菌和細菌的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及代謝功能，旨在了解苯醚甲環(huán)唑?qū)Τ嘈遣【纳锘钚约捌涫┯煤蟛煌瑫r間煙葉葉際微生物的變化規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試品種云煙105，購自云南省煙草公司玉溪市公司；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑（WDG），購自浙江一帆生物公司；煙草赤星病菌菌株CXB、A42及A54，均由貴州省煙草研究院真菌實驗室提供；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Biolog ECO 代謝板，購自美國Biolog 公司（USA，CA，Hayward）；GeneJET 膠回收試劑盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒，均購自Thermo Scientific公司。

1.2 苯醚甲環(huán)唑?qū)煵莩嘈遣【亩玖y定

采用菌絲生長速率法[16]測定苯醚甲環(huán)唑?qū)煵莩嘈遣【z生長的毒力。配制含系列質(zhì)量濃度苯醚甲環(huán)唑的PDA 平板，苯醚甲環(huán)唑的最終測試質(zhì)量濃度為0、0.01、0.05、1.25、6.25、31.25 mg/L，用直徑6 mm 打孔器在赤星病菌菌落邊緣打制菌餅，將菌餅接種至含藥平板，每個處理設4 次重復。接菌后將其置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照菌落長至2/3 平皿時，采用十字交叉法量取菌落直徑，計算不同劑量苯醚甲環(huán)唑下的抑制率。以藥劑質(zhì)量濃度對數(shù)為橫坐標，以抑制率概率值為縱坐標，建立苯醚甲環(huán)唑抑制煙草赤星病菌菌絲生長的毒力回歸方程，計算藥劑半數(shù)最大效應質(zhì)量濃度（EC50）和相關(guān)系數(shù)。

1.3 施用苯醚甲環(huán)唑后煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)與代謝功能分析

1.3.1 試驗設計 田間試驗于2020 年8 月29 日至9 月16 日在貴州省威寧縣黑石頭鎮(zhèn)進行，試驗設置噴施10%苯醚甲環(huán)唑WDG和對照2個處理，選取煙株長勢一致的煙田劃分小區(qū)，各試驗小區(qū)隨機排列，每小區(qū)60 株煙株，每列20 株，共3 行，小區(qū)設3次重復，各小區(qū)之間設保護行。于煙葉底部葉片零星出現(xiàn)病斑時開始用藥，試驗地環(huán)境和煙株情況如圖1 所示。10%苯醚甲環(huán)唑WDG 的用量為900 g/hm2，用水量為900 L/hm2，于早上9：00 采用多功能噴霧施肥器將配制的農(nóng)藥均勻噴施于葉片表面，直至液滴流失。并分別于施藥前0 d 和施藥后5、10、15 d在各小區(qū)隨機選取10株煙株進行取樣。

圖1 煙草赤星病的田間癥狀Fig.1 Field symptoms of tobacco brown spot disease

1.3.2 樣品采集 利用消毒剪刀分別剪取煙株中下部相同部位的感病與健康煙葉樣品，分別裝入50 mL 無菌離心管中，每個處理3 組重復。樣品采集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實驗室開展試驗，樣品編號如表1所示。

表1 煙葉樣品編號Tab.1 Tobacco leaf sample number

1.3.3 煙葉葉際真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析 采用CTAB[17]法提取煙葉葉際微生物基因組DNA，使用NanoDrop 2000 測定提取的DNA 濃度和純度，檢測合格后用于構(gòu)建文庫。以上述提取的總DNA 為 模 板，以 真 菌 引 物ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS1-1FR（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）對葉際微生物基因組DNA ITS1 區(qū)域進行PCR 擴增。以細菌引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ ）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對葉際微生物基因組DNA 16S-V4 區(qū)域進行PCR 擴增。PCR 擴增體系與反應程序參照HUANG 等[18]、CHEN等[19]的方法進行。擴增產(chǎn)物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒構(gòu)建文庫，采用Illumina MiSeq 測序平臺對PCR 擴增產(chǎn)物進行雙端測序，以上分析均在北京諾致源科技股份有限公司完成。

1.3.4 煙葉葉際微生物代謝功能分析 分別取施藥前后中下部相同部位的感病與健康煙葉樣品各1 g，將其置于盛有50 mL 0.8%無菌生理鹽水的100 mL三角瓶中，28 ℃下以180 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，取出后靜置30 min，取100 μL 上清液依次分別加至ECO 代謝板的測試孔中，將ECO 代謝板置于OmniLog 恒溫培養(yǎng)箱，28 ℃培養(yǎng)7 d，采用Biolog D5E_OKA_data.exe 軟件收集煙葉葉際微生物在生長過程中代謝孔內(nèi)顏色變化值，收集后使用HemI軟件制作熱圖，分析樣品葉際微生物的代謝功能[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

使用Excel 2019、SAS 2019 軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。測序數(shù)據(jù)通過FLASH 和Trimmomatie軟件進行過濾優(yōu)化和雙端序列連接。過濾優(yōu)化后的序列使用UPARSE 軟件（Version 7.1）對相似度≥97%的序列進行OTU（Operational taxonomic units）聚類，并在聚類過程去除單序列和嵌合體。真菌和細菌分別通過Unit（7.2）和SILVA 132 的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行注釋。采用Qime（Version19.1）軟件計算Alpha 多樣性指數(shù)，運用SAS 9.3 對真菌和細菌的Alpha 多樣性指數(shù)進行差異顯著性分析。利用R 語言工具統(tǒng)計并繪制物種積累箱形圖、門屬水平相對豐度圖，分析樣品微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯醚甲環(huán)唑?qū)煵莩嘈遣【亩玖?/h3>

如表2 所示，苯醚甲環(huán)唑?qū)? 株煙草赤星病菌菌絲生長均具有較強的抑制活性，隨著藥劑質(zhì)量濃度的增加，其抑制作用逐漸增強。苯醚甲環(huán)唑抑制菌絲生長的EC50值為0.09～0.26 mg/L，平均值為0.17 mg/L，其相關(guān)系數(shù)均大于0.98。

表2 苯醚甲環(huán)唑?qū)煵莩嘈遣【亩玖ab.2 Toxicity of difenoconazole to Alternaria alternata

2.2 施用苯醚甲環(huán)唑后煙葉葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)與代謝功能

2.2.1 真菌和細菌群落結(jié)構(gòu) 在門水平上，施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的真菌群落優(yōu)勢菌群均為子囊菌門（Ascomycota），其次是擔子菌門（Basidiomycota），施藥前后感赤星病煙葉的子囊菌門相對豐度均高于施藥前后的健康煙葉。施藥前感赤星病煙葉子囊菌門相對豐度為93.79%，施藥5、15 d 時，其相對豐度分別降低6.34、1.40 百分點，施藥10 d 時升高2.47 百分點。施藥前健康煙葉子囊菌門相對豐度為63.26%，施藥5、10 d 時，其相對豐度分別降低16.90、21.84 百分點，施藥15 d 時升高9.75 百分點。感赤星病煙葉施藥5、15 d 時，擔子菌門相對豐度升高，10 d 時降低，健康煙葉施藥5 d 時擔子菌門相對豐度降低，10、15 d 時相對豐度均升高（圖2A）。

圖2 施用苯醚甲環(huán)唑后煙葉葉際真菌、細菌門和屬水平的群落組成Fig.2 Community composition of phyllospheric fungi and bacteria at phylum and genus levels in tobacco leaves after application of difenoconazole

在屬水平（圖2B）上，施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的真菌群落主要菌屬為鏈格孢屬（Alternaria）、Boeremia、枝孢霉屬（Cladosporium）、Symmetrospora、亞隔孢殼屬（Didymella）、附球菌屬（Epicoccum），其中鏈格孢屬為優(yōu)勢菌屬，施藥前感赤星病煙葉中鏈格孢屬相對豐度（84.24%）遠高于健康煙葉（36.27%）。施藥5 d 時，感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為鏈格孢屬（分別降低14.06、18.37 百分點）、枝孢霉屬（5.88、13.63 百分點）、Symmetrospora（1.74、4.21 百分點）、附球菌屬（0.07、0.07百分點）、亞隔孢殼屬（0.07、1.98百分點）及感病煙葉中Boeremia（0.33 百分點）；感病與健康煙葉中相對豐度升高的菌屬為圓孢霉屬（Staphylotrichum，分別升高5.21、12.96 百分點）、曲霉屬（Aspergillus，3.01、0.33 百分點）、Chlamydomyces（2.07、0.87 百分點）及健康煙葉中的Boeremia（3.61百分點）。施藥10 d 時，感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為Boeremia（0.33、5.21 百分點）、枝孢霉屬（6.15、13.96 百分點）、Symmetrospora（1.94、2.61百分點）、亞隔孢殼屬（0.33、1.27 百分點）及健康煙葉中的鏈格孢屬（24.51 百分點）、附球菌屬（0.60 百分點）；感病煙葉中相對豐度升高的菌屬為鏈格孢屬（10.17 百分點）、附球菌屬（0.13 百分點），健康煙葉中為圓孢霉屬（19.70 百分點）、Chlamydomyces（0.20百分點）、曲霉屬（0.47百分點）。施藥15 d時，感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為枝孢霉屬（4.94、9.22 百分點）、Boeremia（0.13、0.13 百分點）及感病煙葉中的鏈格孢屬（4.23 百分點）；感病與健康煙葉中相對豐度升高的菌屬為Symmetrospora（2.14、4.34 百分點）、亞隔孢殼屬（2.45、0.07 百分點）、附球菌屬（3.21、2.54 百分點）及健康煙葉中的鏈格孢屬（19.10百分點）、曲霉屬（1.07百分點）。

在門水平上，施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的細菌群落優(yōu)勢菌群均為變形菌門（Proteobacteria），其次是厚壁菌門（Firmicutes），且施藥前后感赤星病煙葉的變形菌門相對豐度均高于施藥前后的健康煙葉。施藥前感赤星病煙葉變形菌門相對豐度為38.37%，施藥5、10 d 時，其相對豐度分別降低22.03、12.64百分點，施藥15 d時升高53.02 百分點；施藥前健康煙葉變形菌門相對豐度為6.71%，施藥5、10 d時，其相對豐度降低3.25、1.90百分點，施藥15 d 時升高27.29 百分點。感赤星病煙葉施藥5、10 d 時，厚壁菌門相對豐度升高，15 d時降低，健康煙葉施藥5、10、15 d 時，厚壁菌門相對豐度均降低（圖2C）。

在屬水平上，施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的細菌群落主要菌屬為泛菌屬（Pantoea）、假單胞菌 屬（Pseudomonas） 、鞘 脂 單 胞 菌 屬（Sphingomonas）、馬賽菌屬（Massilia），其中泛菌屬為優(yōu)勢菌屬，施藥前感赤星病煙葉中泛菌屬相對豐度（22.93%）遠高于健康煙葉（6.48%）。施藥5 d 時，感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為泛菌屬（分別降低22.14、6.49 百分點），感病煙葉中的馬賽菌屬（1.68百分點）、鞘脂單胞菌屬（6.04百分點），以及健康煙葉中的魏斯氏菌屬（15.55 百分點）；感病與健康煙葉中相對豐度升高的菌屬為假單胞菌屬（分別升高5.21、1.56 百分點）及健康煙葉中的馬賽菌屬（0.22 百分點）。施藥10 d 時，感病與健康煙葉中相對豐度降低的菌屬為泛菌屬（22.60、6.27 百分點）及感病煙葉中的馬賽菌屬（1.34 百分點）、鞘脂單胞菌屬（6.26 百分點）；感病與健康煙葉中相對豐度升高的菌屬為假單胞菌屬（14.99、2.01 百分點）。施藥15 d 時，感病與健康煙葉中相對豐度增加的菌屬為泛菌屬（14.32、2.46 百分點）、假單胞菌屬（24.72、4.14百分點）、鞘脂單胞菌屬（4.03、1.90百分點）、馬賽菌屬（3.24、1.79 百分點），主要菌屬相對豐度均增加（圖2D）。

2.2.2 真菌和細菌群落Alpha 多樣性 真菌群落中，苯醚甲環(huán)唑處理前后感病煙葉與健康煙葉的覆蓋度指數(shù)在0.92 以上；細菌群落中，苯醚甲環(huán)唑處理前后感赤星病煙葉與健康煙葉的覆蓋度指數(shù)在0.87 以上，表明樣本中序列被檢測出的概率高，測序結(jié)果能夠反映樣本中實際的真菌和細菌群落結(jié)構(gòu)。Chao1 指數(shù)反映真菌群落結(jié)構(gòu)的豐富度，Shannon 指數(shù)反映真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性。對煙葉微生物多樣性進行評估（表3）可知，在真菌群落結(jié)構(gòu)中，施藥前后感病煙葉的葉際微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉，且存在顯著差異。施藥5 d 時，感病煙葉與健康煙葉多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均升高；施藥10 d 時，感病煙葉多樣性指數(shù)降低，豐富度指數(shù)升高，健康煙葉多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)升高；施藥15 d 時，感病煙葉多樣性指數(shù)升高，豐富度指數(shù)降低，健康煙葉多樣性指數(shù)降低，豐富度指數(shù)升高。

表3 施用苯醚甲環(huán)唑后煙葉葉際真菌和細菌Alpha多樣性（OTU水平）Tab.3 Alpha diversity of phyllospheric fungi and bacteria in tobacco leaves after the application of difenoconazole（OTU level）

在細菌群落結(jié)構(gòu)中，感病煙葉與健康煙葉施藥后葉際微生物群落多樣性和豐富度指數(shù)均高于施藥前，施藥前后感病煙葉的多樣性指數(shù)均高于健康煙葉，且存在顯著差異。感病煙葉施藥5、10、15 d時，多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均升高（表3）。

由物種積累箱形圖可知，真菌OTU 數(shù)目接近400，細菌OTU 數(shù)目接近300 時，隨著樣本量的加大，箱形圖位置趨于平緩，表明此環(huán)境中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多，說明抽樣充分，可以進行數(shù)據(jù)分析（圖3）。

圖3 煙葉樣品真菌（A）、細菌（B）OTU水平物種積累箱形圖Fig.3 Box diagram of species accumulation of fungi（A）and bacteria（B）at OTU level in tobacco leaf samples

2.3 感赤星病煙葉葉際微生物代謝功能

采用Biolog-ECO 代謝板對施藥前后煙葉樣品進行代謝功能分析，Biolog-ECO 代謝板中含有碳水化合物類、羧酸類、酚酸類、氨基酸類、胺類、多聚物類共31 種碳源。施藥前，感病煙葉葉際微生物對L-蘇氨酸、D，L-α-甘油、α-丁酮酸、α-環(huán)式糊精代謝較弱，對其他碳源代謝相對高效，尤其是對D-甘露醇、L-天冬酰胺、吐溫80、吐溫40。施藥5 d時，感病煙葉葉際微生物對α-丁酮酸代謝增強，對其余碳源代謝均減弱，其中對D-木糖的代謝最弱。施藥10 d 時，相較于施藥前，感病煙葉葉際微生物對α-丁酮酸和L-蘇氨酸代謝增強，其余碳源代謝均減弱，對2-羥基苯甲酸代謝明顯減弱；相較于施藥5 d時，對α-丁酮酸、D，L-α-甘油、丙酮酸甲酯、D-葡萄糖胺酸、4-羥基苯甲酸、苯乙基胺6種碳源代謝程度保持不變，僅2-羥基苯甲酸代謝被抑制，其余碳源代謝程度均增強，但代謝程度一般。施藥15 d時，相較于施藥前，感病煙葉對葡萄糖-1 磷酸鹽、D-葡萄糖胺酸代謝保持不變，對α-丁酮酸、L-蘇氨酸、α-環(huán)式糊精3種碳源的代謝增強，對其余碳源的代謝被抑制，其中對D-木糖、4-羥基苯甲酸、2-羥基苯甲酸的代謝被抑制較為明顯；相較于施藥10 d時，感病煙葉對D-木糖、D，L-α-甘油代謝保持不變，對4-羥基苯甲酸的代謝被抑制，其余碳源代謝均增強（圖4）。

施藥前健康煙葉對α-丁酮酸、2-羥基苯甲酸代謝強度較弱，對其他碳源均可高效代謝。施藥5 d時，相較于施藥前，對所有的碳源代謝均降低，其中對α-丁酮酸、2-羥基苯甲酸、腐胺的代謝被抑制較為明顯。施藥10 d 時，相較于施藥前，對D-纖維二糖、D-葡萄糖胺酸的代謝程度保持不變，除α-丁酮酸，對其余碳源的代謝均減弱，以2-羥基苯甲酸代謝受抑制較為明顯；相較于施藥5 d 時，對所有碳源代謝均增強。施藥15 d 時，相較于施藥前，對D-纖維二糖、α-D-乳糖、I-赤蘚糖醇、L-精氨酸的代謝保持不變，對其余碳源的代謝均減弱；相較于施藥10 d時，對D-木糖、α-丁酮酸、D-葡萄糖胺酸、4-羥基苯甲酸的代謝減弱，對D-纖維二糖、D-半乳糖酸內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸等8種碳源的代謝強度保持不變，對其余碳源的代謝均增加（圖4）。

3 結(jié)論與討論

本研究中，苯醚甲環(huán)唑?qū)煵莩嘈遣【z生長的EC50值為0.17 mg/L，活性較高。這可能與苯醚甲環(huán)唑的作用機制有關(guān)，其通過抑制病原菌麥角緇醇的生物合成而干擾病菌的生長，對植物病原菌的菌絲生長具有較強的抑制作用，被廣泛應用于由子囊菌、擔子菌和半知菌引起的植物病害防治[21-22]。因此，該藥劑適合作為煙草赤星病的治療性藥劑，能高效抑制病斑的擴展。

葉際微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)平衡和葉片健康方面均具有重要作用[23]。已有研究發(fā)現(xiàn)[24，11]，煙草赤星病危害期其葉際優(yōu)勢真菌為鏈格孢屬，優(yōu)勢細菌有泛菌屬和假單胞菌屬。本研究采用Illumina 高通量測序技術(shù)對施用苯醚甲環(huán)唑前后感赤星病煙葉和健康煙葉葉際真菌與細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進行分析，發(fā)現(xiàn)施藥前后2 類煙葉的葉際優(yōu)勢真菌菌門均為子囊菌門，但感病煙葉子囊菌門相對豐度高于健康煙葉，其次優(yōu)勢菌門為擔子菌門；優(yōu)勢細菌菌門為變形菌門，其次為厚壁菌門。在真菌屬水平上，感赤星病煙葉和健康煙葉施藥前后的菌屬有鏈格孢屬、Boeremia、枝孢霉屬、Symmetrospora、亞隔孢殼屬、附球菌屬，其中鏈格孢屬為優(yōu)勢菌屬；在細菌屬水平上，施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉的主要菌屬為泛菌屬、假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬、馬賽菌屬，其中泛菌屬為優(yōu)勢菌屬。以上研究結(jié)果與向立剛等[24]、劉亭亭等[11]發(fā)現(xiàn)的感赤星病煙葉的優(yōu)勢真菌菌群結(jié)果一致。此外，前人[18]研究發(fā)現(xiàn)，煙草亞隔孢葉斑病危害期其葉際優(yōu)勢真菌有Boeremia、Meyerozyma、莖點霉屬和鏈格孢屬，優(yōu)勢細菌有假單胞菌屬和泛菌屬；煙葉霉爛病危害期其葉際優(yōu)勢真菌有米根霉、曲霉屬、鏈格孢屬、尾孢屬和莖點霉屬，優(yōu)勢細菌有假單胞菌屬和泛菌屬[25]。本研究結(jié)果與前人認為優(yōu)勢菌屬均為其致病菌的研究結(jié)果類似，同時也說明煙草在不同病害發(fā)生時，其葉際微生物菌落結(jié)構(gòu)均存在差異。

使用藥劑會使葉際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。CHEN 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，使用菌核凈會降低煙葉葉際細菌鞘脂單胞菌屬、黃色桿菌屬和沙雷氏菌屬的相對豐度；使用高效氯氰菊酯會降低植物葉際真菌生物量，增加細菌生物量[26]；高劑量阿維菌素改變了甘藍葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成，減少了葉際微生物生物量[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，應用苯醚甲環(huán)唑?qū)煵萑~際所有真菌和細菌菌屬均產(chǎn)生了影響，施藥后，感病煙葉葉際真菌鏈格孢屬相對豐度在施藥后5、15 d 降低，施藥后10 d 增加，枝孢霉屬在施藥后相對豐度持續(xù)降低，而感病和健康煙葉葉際亞隔孢殼屬相對豐度在施藥后5、10 d 降低，施藥后15 d 相對豐度增加，施藥后其余菌屬的相對豐度也呈現(xiàn)不規(guī)律的增減；感病煙葉葉際細菌泛菌屬、馬賽菌屬、鞘脂單胞菌屬相對豐度在施藥后5、10 d 降低，施藥后15 d 均上升，假單胞菌屬的相對豐度在施藥后一直保持上升狀態(tài)。研究結(jié)果進一步驗證，應用化學藥劑會改變植物葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)。此外，苯醚甲環(huán)唑作為三唑類殺菌劑的典型代表，已在多種作物的病害防治上登記，防治對象包括小麥赤霉病、葡萄白粉病、甜菜褐斑病等。本研究發(fā)現(xiàn)，除主要病原菌外，苯醚甲環(huán)唑還會影響煙葉包括枝孢霉屬、Symmetrospora、亞隔孢殼屬等在內(nèi)的多種病原真菌，同時也會影響包括假單胞菌屬在內(nèi)的多種非致病菌菌群結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果進一步驗證了苯醚甲環(huán)唑的廣譜性與選擇性。

植物健康與其葉際微生物菌群平衡緊密聯(lián)系。本研究利用Shannon 指數(shù)和Chao1 指數(shù)分別表征微生物群落多樣性和微生物群落豐富度，研究發(fā)現(xiàn)，感赤星病煙葉的葉際真菌群落多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均低于健康煙葉，結(jié)果與煙草赤星病[24]、亞格孢殼葉斑病[18]等真菌性病害對葉際微生物多樣性與豐富度的影響研究結(jié)果一致，推測真菌性病害的發(fā)生均會降低葉際真菌的多樣性。與施藥前相比，施用苯醚甲環(huán)唑后，感病與健康煙葉葉際真菌群落的多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均發(fā)生了改變，感病煙葉在施藥5 d時多樣性和豐富度指數(shù)均升高，施藥10 d時，感病煙葉多樣性指數(shù)降低，豐富度指數(shù)升高，施藥15 d 時，感病煙葉多樣性指數(shù)升高，豐富度指數(shù)降低；健康煙葉在施藥5、10 d 時多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)均升高，施藥15 d 時多樣性指數(shù)降低，豐富度指數(shù)升高。說明藥劑處理改變了葉際微生物群落多樣性與豐富度，本研究結(jié)果與劉天波等[28]、黃闊等[29]發(fā)現(xiàn)施用拮抗菌群、微生物制劑會改變感野火病煙葉葉際微生物群落結(jié)構(gòu)的結(jié)果類似。

葉際微生物菌群對碳源代謝活性的強弱能反映其代謝功能的強弱。本研究利用Biolog-ECO 技術(shù)分析了施藥前后感赤星病煙葉與健康煙葉對常見31 種碳源的利用差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施藥前感病煙葉對個別碳源代謝程度較低，如D，L-α-甘油、α-丁酮酸、L-蘇氨酸，α-環(huán)式糊精；健康煙葉葉際微生物對除α-丁酮酸和2-羥基苯甲酸碳源外的供試碳源代謝活性均較強，推測感赤星病煙葉葉際微生物不喜好偏酸性的碳源。施用苯醚甲環(huán)唑后，感病與健康煙葉葉際微生物對供試碳源的利用均較弱，隨時間延長，對碳源的代謝逐漸升高，表明苯醚甲環(huán)唑能快速降低感赤星病煙葉與健康煙葉葉際微生物的代謝活性，很大程度上改善了煙葉葉際微環(huán)境。但隨著施藥時間的增加，葉際微生物代謝活性緩慢增強，表明苯醚甲環(huán)唑在煙葉上的持效期有限。在赤星病的防控上，可以結(jié)合藥劑的持效期增加施藥次數(shù)，以持續(xù)發(fā)揮藥劑的葉際微生態(tài)調(diào)控效果。