基于ITS 和ISSR 的靈芝種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

許 琳，張 瑞，王 勝，李金濤，劉琳玲，閆梅霞

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118）

靈芝（Ganoderma lucidum）是擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，為我國傳統(tǒng)名貴藥材，被稱為“仙草”，在我國已有上千年的栽培及應(yīng)用歷史。我國是世界上最大的靈芝生產(chǎn)國和消費(fèi)國，2020 年靈芝和靈芝孢子粉合計年產(chǎn)量約1.7 萬t，產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值超過80 億元[1]。靈芝子實體開展藥食同源試點(diǎn)管理[2]、破壁靈芝孢子粉保健食品實施備案制[3]等利好政策的實施將進(jìn)一步促進(jìn)靈芝產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。目前，我國靈芝主栽區(qū)包括武夷山及龍泉、東北吉林長白山、安徽大別山、山東魯西四大區(qū)域[4]。吉林作為靈芝主要栽培區(qū)之一，主要栽培品種為赤芝、松杉靈芝、韓芝等[5]，存在靈芝種源引進(jìn)隨意、來源不清晰的問題，不利于靈芝良種選育工作的開展。因此，有關(guān)栽培菌株的鑒定及遺傳多樣性分析的研究亟需提上日程。

核糖體DNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Ribosomal DNA internal transcribed spacer，rDNA-ITS）基因是目前真菌屬內(nèi)種間鑒定可靠的基因片段[6]，在物種和亞種水平上的識別信息最為豐富[7]。研究表明，ITS 對于靈芝多數(shù)種類來說是可靠的區(qū)分方法，我國具有ITS 分子序列的靈芝種類有39 種[8]，因此，近年來被廣泛應(yīng)用于靈芝種質(zhì)資源的鑒定及評價[9-10]。拮抗試驗操作簡單且成本低，常用于菌株的初步鑒定及分類[11]，也可有效反映遺傳多樣性[12-13]。簡單序列重復(fù)間隔區(qū)（Inter-simple sequence repeat，ISSR）標(biāo)記是對2 個彼此相近、方向相反的簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR）之間DNA 區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增[14]，其模板質(zhì)量要求低，具有很好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，常用于菌株的篩選、鑒定及遺傳多樣性分析[15]等。目前，在對食用菌進(jìn)行鑒定及遺傳多樣性分析時，常采用上述拮抗試驗、ITS 序列分析與分子標(biāo)記手段中的2 種或3 種方法相結(jié)合進(jìn)行，其結(jié)果也更加準(zhǔn)確可靠[16-19]。

目前尚未見關(guān)于吉林地區(qū)靈芝遺傳多樣性研究的報道，鑒于此，擬通過拮抗試驗結(jié)合ITS 序列對供試菌株進(jìn)行鑒定，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并利用ISSR分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳聚類圖譜，對吉林主栽的18種靈芝菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為吉林栽培靈芝的遺傳育種及生產(chǎn)利用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

18 個靈芝供試菌株由吉林省5 個靈芝產(chǎn)區(qū)所取子實體分離純化所得，菌株現(xiàn)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所食藥用菌團(tuán)隊保存，靈芝菌株編號見表1。

表1 供試菌株Tab.1 Tested strains

1.2 試劑與儀器

主要試劑：Ezup 真菌基因組DNA 抽提試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）、ITS 引物及ISSR 引物（上海生工生物工程股份有限公司）、2×TaqPCR Master Mix（上海生工生物工程股份有限公司）、DL2000 DNA Marker（日本寶生物工程株式會社）、50×TAE 緩沖液（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）。

主要儀器：D3024R 高速冷凍離心機(jī)（美國賽洛捷克公司）、T100 PCR 儀（美國伯樂公司）、JW300C電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國伯樂公司）、OSE-260 超微量紫外可見分光光度計（天根生化科技有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基（PDA）:馬鈴薯200 g（浸汁）、葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀1.5 g、磷酸氫二鉀1.5 g、無水硫酸鎂2 g、瓊脂20 g，加水定容至1 L，pH值自然。

1.4 菌絲培養(yǎng)與DNA提取

將活化的18 種靈芝菌株接種到鋪有玻璃紙的PDA培養(yǎng)基平皿上，3次重復(fù)，25 ℃避光培養(yǎng)。待菌絲長滿平皿后刮取菌絲，按照試劑盒方法逐一提取DNA，并檢測DNA質(zhì)量，A260/A280值為1.8～2.0則質(zhì)量合格，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 ITS擴(kuò)增

選 擇 真 菌 通 用 引 物 ITS1 （5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ ） 和 ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′）對樣品DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，包含2×PCR Mix 12.5 μL、上下游引物各1.25 μL、DNA 模板1.25 μL、ddH2O 8.75 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s、54 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，終止溫度為4 ℃。配制1%的瓊脂糖凝膠、1×TAE 電極緩沖液，上樣量3 μL，120 V 電壓恒流30 min，檢測是否有目的條帶。

1.6 拮抗試驗

18 種靈芝菌株在PDA 培養(yǎng)基活化后，采用陳強(qiáng)[20]等的方法使用直徑6 mm 的打孔器打取各菌株種塊，接種于直徑90 mm 的培養(yǎng)皿內(nèi)25 ℃對峙培養(yǎng)，每個菌株至少3 次重復(fù)。菌絲接觸3 d 后，觀察記錄菌株兩兩之間的拮抗情況。

1.7 ISSR引物篩選及擴(kuò)增

參照徐凱[21]、邢志偉[22]、RAMAN 等[23]的方法，對20 個常用ISSR 引物進(jìn)行分析，篩選出12 條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的引物，同時篩選各引物適宜的退火溫度。篩選的引物序列及確定的適宜退火溫度見表2。

表2 ISSR引物參數(shù)Tab.2 ISSR primer parameters

反應(yīng)體系為20 μL，包含2×PCR Mix 10 μL、引物1 μL、DNA 模板1 μL、ddH2O 8 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min、退火1 min、72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，終止溫度為4 ℃。配制1.5%的瓊脂糖凝膠、1×TAE 電極緩沖液，上樣量5 μL，以DL 2000 Marker 為指示標(biāo)量，120 V 電壓恒流1 h，于凝膠成像系統(tǒng)上檢測并拍照記錄。

1.8 數(shù)據(jù)處理

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，所測得的ITS 序列使用SnapGene v5.5.3軟件檢查質(zhì)量，并檢查峰圖，人工校正后用MEGA X 軟件以鄰接（Neighbor-joining，NJ）法對所得序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并計算遺傳距離，以Bootstrap 方法對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行評估，Bootstrap 次數(shù)設(shè)置為1 000。依據(jù)ISSR 擴(kuò)增電泳圖，選擇清晰可辨的電泳條帶，分別讀取數(shù)據(jù)，相同遷移率處有帶為1，無帶為0，建立0/1矩陣，應(yīng)用NTSYS-pc 2.10軟件基于DICE 系數(shù)計算遺傳相似系數(shù)，按照非加權(quán)平均法（UPGMA）聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 18種靈芝菌株的ITS系統(tǒng)發(fā)育分析

測序獲得18 種靈芝菌株的ITS 序列，經(jīng)對位排列，人工矯正后長度為576～580 bp，在GenBank中下載 多 孔 菌 目 香 菇 屬（Lentinus arcularius，MH142022.1）ITS 序列，長度為648 bp。將其作為外群，將經(jīng)測序的18種靈芝菌株和GenBank 中已登錄的12 條靈芝菌株ITS 序列通過NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。靈芝屬內(nèi)12 條ITS 序列同一種不同菌株很好地聚在一起；赤芝（Ganoderma lingzhi）與柯蒂斯靈芝（Ganoderma curtisii）聚在一支，支持率為86%；18 種靈芝菌株均與赤芝聚為一類，并可進(jìn)一步分為2個類群，即類群Ⅰ和類群Ⅱ，支持率為96%。在類群Ⅰ進(jìn)化分支中可繼續(xù)分為組a（LZ-2、LZ-13、LZ-15、LZ-16、LZ-18）和組b（LZ-4、LZ-11、LZ-12、LZ-14、LZ-17），支持率為64%；類群Ⅱ被分為組c（LZ-7、LZ-8）和組d（LZ-1、LZ-3、LZ-5、LZ-6、LZ-9、LZ-10），支持率為47%。經(jīng)各菌株間及組間序列對比發(fā)現(xiàn)，18種靈芝菌株各組內(nèi)各菌株序列相似性為100%，組間序列相似性在99.29%～99.65%。

圖1 基于18種靈芝菌株ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed based on the ITS sequences of 18 Ganoderma lucidum strains

2.2 18種靈芝菌株的拮抗試驗結(jié)果分析

對18 種靈芝菌株共設(shè)計拮抗試驗153 組，其中有拮抗現(xiàn)象的有122 組，占比79.7%；無拮抗現(xiàn)象的31 組，占比20.3%。多數(shù)拮抗現(xiàn)象表現(xiàn)為形成一條溝帶。根據(jù)ITS 分組結(jié)果對組內(nèi)及組間拮抗現(xiàn)象進(jìn)行分析（表3）。組a 與組b 之間均有拮抗現(xiàn)象；組a內(nèi)LZ-13、LZ-15、LZ-18 之間無拮抗現(xiàn)象；LZ-2 與LZ-7 之間無拮抗；LZ-16 與組d 內(nèi)LZ-3、LZ-9 拮抗不明顯，但與組d 內(nèi)LZ-1、LZ-5、LZ-6、LZ-10 拮抗明顯；組b 組內(nèi)5 個菌株之間均無拮抗現(xiàn)象；組c 與組d 之間均有拮抗現(xiàn)象；組c 內(nèi)兩菌株同樣有拮抗現(xiàn)象；組d 內(nèi)6 個菌株之間均無拮抗現(xiàn)象。拮抗試驗結(jié)果與ITS 試驗結(jié)果大體一致。組a 內(nèi)LZ-13、LZ-15、LZ-18，組b、組d 各組內(nèi)菌株親緣關(guān)系均較近，可初步判斷為同一菌株；LZ-8 與其余各菌株均有拮抗現(xiàn)象，可判斷為單一菌株；LZ-2、LZ-7、LZ-16 疑似單一菌株，但需進(jìn)一步鑒定。通過ITS 擴(kuò)增和拮抗試驗，將18種靈芝菌株分成7組：LZ-13、LZ-15、LZ-18 為一組，組b、組d、LZ-2、LZ-7、LZ-8、LZ-16各自為一組）。

表3 18種靈芝菌株的拮抗試驗結(jié)果Tab.3 Results of antagonism tests of 18 Ganoderma lucidum strains

2.3 18種靈芝菌株的ISSR遺傳多樣性分析

2.3.1 ISSR 引物多態(tài)性 通過對20 條ISSR 引物進(jìn)行溫度梯度試驗后，確定的12 條ISSR 引物的退火溫度在43～56 ℃，其在18種靈芝菌株中擴(kuò)增出91條清晰穩(wěn)定的條帶（表4），DNA 片段大小在100～2 000 bp（圖2）。其中，ISSR-6 引物擴(kuò)增條帶最多（12條），ISSR-4和ISSR-12引物擴(kuò)增條帶最少（4條），平均為7.6 條。各ISSR 引物的多態(tài)性條帶數(shù)為3～12條，平均為6.8條，多態(tài)性位點(diǎn)百分率為87.2%。

圖2 18種靈芝菌株ISSR-3（A）、ISSR-5（B）引物的ISSR擴(kuò)增圖譜Fig.2 ISSR fingerprints generated using primers ISSR-3（A）、ISSR-5（B）of 18 Ganoderma lucidum strains

表4 18種靈芝菌株的ISSR引物多態(tài)性Tab.4 ISSR primer polymorphisms of 18 Ganoderma lucidum strains

2.3.2 18 種靈芝菌株的聚類分析 18 種靈芝菌株的遺傳相似系數(shù)在0.382 4～0.974 4，平均為0.652 9，遺傳范圍差異較大（表5）。其中，LZ-14和LZ-17之間的遺傳相似系數(shù)最大，為0.974 4，表明兩者的親緣關(guān)系最近，遺傳差異最小；其次是LZ-11和LZ-12，遺傳相似系數(shù)為0.970 6；LZ-8和LZ-11的遺傳相似系數(shù)最小，為0.382 4，表明兩者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳差異較大。

表5 18種靈芝菌株的遺傳相似系數(shù)Tab.5 Genetic similarity coefficient of of 18 Ganoderma lucidum strains

基于18 種靈芝菌株的ISSR 遺傳多樣性結(jié)果進(jìn)行聚類分析，可將18 種菌株分開（圖3）。在遺傳相似系數(shù)約0.550 處，所有菌株被分為2 個類群；在遺傳相似系數(shù)約0.569 處，所有菌株被分為4 個類群，除LZ-7 外，其余分組與ITS 結(jié)果相同。當(dāng)相似系數(shù)約0.679 時，18 種靈芝菌株可分為7 個類群：LZ-2、LZ-7、LZ-8、LZ-16各自成為一個類群，LZ-1、LZ-3、LZ-5、LZ-6、LZ-9、LZ-10 為 一 個 類 群，LZ-13、LZ-15、LZ-18 為一個類群，LZ-4、LZ-11、LZ-12、LZ-14、LZ-17 為一個類群。該聚類結(jié)果與基于ITS擴(kuò)增和拮抗試驗分類的結(jié)果相同。

圖3 18種靈芝菌株的ISSR聚類分析Fig.3 ISSR cluster diagram of 18 Ganoderma lucidum strains

3 結(jié)論與討論

目前，多種方法可用于食用菌的鑒定及遺傳多樣性分析[24-25]，每種方法所提供的遺傳信息不同，因此，對于其遺傳關(guān)系的反映有所差異，多種方法相結(jié)合可以更加準(zhǔn)確可靠地反映分析結(jié)果。ITS 技術(shù)可以有效對靈芝菌株進(jìn)行分類，研究認(rèn)為，當(dāng)序列相似性達(dá)99%以上，可認(rèn)為是同一個種[26]。湯坤鵬[27]利用ITS 技術(shù)將18 種野生靈芝菌株分為六大類，其中包括赤芝、紫芝、松杉靈芝等。既往研究中，對于菌株分類常用樣本序列進(jìn)行Blast 對比，但由于18 種靈芝菌株親緣關(guān)系較近，ITS 序列差距較小，且GenBank 數(shù)據(jù)庫中有關(guān)靈芝ITS 的序列多、質(zhì)量參差不齊[8]，可靠性有待進(jìn)一步查證。因此，本研究選擇親緣關(guān)系較近的5 個不同種，參考現(xiàn)有文獻(xiàn)[28]中分類學(xué)已明確的12 條靈芝菌株ITS 序列，與經(jīng)測序的樣本序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，赤芝與柯蒂斯靈芝聚為一類，支持率為86%，其親緣關(guān)系較其他種更近，與前人研究結(jié)果相同[28-29]；18種靈芝菌株均與赤芝聚為一類，可進(jìn)一步分為2 個類群，支持率為96%，2 個類群各自獨(dú)立進(jìn)化為2 個分支。體細(xì)胞的非親和性往往導(dǎo)致菌絲體間出現(xiàn)明顯的分界線，即出現(xiàn)拮抗反應(yīng)，表現(xiàn)為色素沉淀、形成一條拮抗線、溝帶或隆起[30]。拮抗反應(yīng)操作簡單、便捷，結(jié)果直觀，是14 種食用菌新品種DUS 測試指南中的測試項目之一。研究認(rèn)為，2 個菌株對峙培養(yǎng)，若沒有拮抗反應(yīng)，不能判定為同一菌株，需進(jìn)一步鑒定[20]，拮抗試驗常用于輔助其他手段進(jìn)行菌株的鑒定及分析親緣關(guān)系[13，31]。崔筱等[32]在對河南主產(chǎn)區(qū)香菇進(jìn)行種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析時認(rèn)為，ITS+拮抗試驗法可以明確區(qū)分遺傳距離的差異及親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，與本研究結(jié)果相似，通過ITS+拮抗法將18種靈芝菌株分為7個類群。

分子標(biāo)記是以DNA 多態(tài)性為基礎(chǔ)反映遺傳多樣性的一種手段。王艷等[33]采用ISSR 和相關(guān)序列擴(kuò) 增 多 態(tài) 性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）綜合分析灰樹花遺傳多樣性時發(fā)現(xiàn)，ISSR擴(kuò)增檢測到的位點(diǎn)數(shù)比SRAP多，多態(tài)性比率比SRAP 高，相比于其余分子標(biāo)記手段，其具有多態(tài)性豐富、操作簡單、無需提前知道基因組相關(guān)序列信息等優(yōu)點(diǎn)[29]。通過ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)，陳小敏等[34]將四川省12 個野生靈芝菌株在相似系數(shù)為0.54 時聚為兩大類，張彬彬等[35]將河南省30 個野生靈芝菌株在相似系數(shù)為0.728 時分為六大類。王錦鋒等[36]利用拮抗、ITS 和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)對21 株靈芝菌株進(jìn)行研究，認(rèn)為3種方法結(jié)果一致，且能準(zhǔn)確鑒定其親緣關(guān)系。本研究采用ITS+拮抗試驗法和ISSR 技術(shù)相結(jié)合對吉林地區(qū)18 種栽培靈芝菌株進(jìn)行鑒定及遺傳多樣性分析?；贗SSR結(jié)果，在遺傳相似系數(shù)約0.550 時，分為2 個類群；在遺傳相似系數(shù)約0.569 時，分為4個類群。ISSR 分類結(jié)果表明，其在遺傳相似系數(shù)約0.679 處與ITS+拮抗試驗法分類結(jié)果一致。本研究中，18種靈芝菌株具有豐富的遺傳多樣性。