保水劑和抗蒸騰劑配施對(duì)土壤水分和云煙87 化學(xué)成分、碳氮代謝的影響

韓雅婷，郭天驕，賈國(guó)濤，趙紅朝，黃五星

（1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450000；3.三門峽市煙草公司澠池縣分公司，河南 澠池 472400）

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，對(duì)土壤水分的需求很高，土壤持水量低于50%時(shí)其質(zhì)量將受到嚴(yán)重影響[1-2]。豫西煙區(qū)屬于山地丘陵地區(qū)，是我國(guó)重要的煙葉產(chǎn)區(qū)，是國(guó)內(nèi)多家重要煙草加工企業(yè)的主要煙葉原料產(chǎn)地[3]。近年來(lái)，受前期干旱和后期低溫影響，當(dāng)?shù)乜緹煶霈F(xiàn)大田生育期延長(zhǎng)、煙葉成熟過(guò)晚、品質(zhì)下降等問(wèn)題[4-6]。因此，發(fā)展抗旱技術(shù)措施對(duì)促進(jìn)煙株早生快發(fā)，提升煙葉品質(zhì)具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

保水劑、抗蒸騰劑等抗旱物質(zhì)近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。保水劑是一種具有高吸水、反復(fù)吸水特性的化合物，其吸水后形成水凝膠，能夠在干旱時(shí)向土壤釋放水分[7]；根據(jù)其使用原料，保水劑可分為淀粉-聚丙烯酸型保水劑、纖維素型保水劑、復(fù)合型保水劑等[8]。梅雅楠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，施用保水劑能夠改善土壤理化性質(zhì)，改善烤后煙葉化學(xué)物質(zhì)的協(xié)調(diào)性，使煙葉品質(zhì)提高；陳芳泉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，施用保水劑可以降低煙株活性氧物質(zhì)，增強(qiáng)煙株抗旱能力?？拐趄v劑是一類抑制植物蒸騰作用、減少水分揮發(fā)的抗旱化學(xué)物質(zhì)[11]；根據(jù)其作用機(jī)制，抗蒸騰劑可分為成膜型抗蒸騰劑、代謝型抗蒸騰劑、反射型抗蒸騰劑[12]。樸春紅等[13]研究發(fā)現(xiàn)，噴施抗蒸騰劑能夠降低玉米葉片的蒸騰作用，提高水分利用率；劉廣成等[14]發(fā)現(xiàn)，對(duì)小麥?zhǔn)┯每拐趄v劑可以降低葉片氣孔導(dǎo)度，提高土壤含水量，同時(shí)產(chǎn)量相比對(duì)照提高15%左右。

近年來(lái)，人們對(duì)保水劑的研究多集中在對(duì)土壤及煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響上，然而保水劑受自身材質(zhì)、外界環(huán)境等因素的影響[7]，無(wú)法徹底解決煙株貪青晚熟的問(wèn)題；抗蒸騰劑廣泛應(yīng)用于瓜果蔬菜、園林作物的栽培生產(chǎn)中[15-19]，在烤煙上施用抗蒸騰劑的研究相對(duì)匱乏；且保水劑與抗蒸騰劑同時(shí)施用鮮見報(bào)道，二者配施能否達(dá)到更佳效果尚不清楚。因此，結(jié)合豫西煙區(qū)生態(tài)環(huán)境及栽培技術(shù)，研究保水劑和抗蒸騰劑配施對(duì)土壤含水率和云煙87 大田生育期、烤后煙葉化學(xué)成分、碳氮代謝關(guān)鍵酶活性以及相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響，為當(dāng)?shù)乜緹熀底髟耘嗵峁┈F(xiàn)實(shí)參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2021 年在河南省三門峽市朱陽(yáng)鎮(zhèn)梁家莊（34°25′N，110°71′E）進(jìn)行，該地區(qū)年平均氣溫13.2 ℃，無(wú)霜期184～218 d，煙葉大田生育期日照時(shí)數(shù)750 h 以上。土壤基礎(chǔ)理化性質(zhì)：堿解氮含量96.8 mg/kg、速效磷含量11.34 mg/kg、速效鉀含量132.46 mg/kg、有機(jī)質(zhì)含量10.03 g/kg，pH 值7.76。供試烤煙品種為云煙87；試驗(yàn)所用保水劑由山東寶莫生物化工股份有限公司提供，主要成分為丙烯酰胺；抗蒸騰劑由四川潤(rùn)爾科技有限公司提供，該抗蒸騰劑為含腐植酸水溶性物質(zhì)。

試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，分別設(shè)置當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培方式（CK）、單獨(dú)施用保水劑（T1）、單獨(dú)施用抗蒸騰劑（T2）、保水劑和抗蒸騰劑配施（T3）4 個(gè)處理，3次重復(fù)，共12 個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，行距1.2 m，株距0.5 m。擬設(shè)定每個(gè)小區(qū)種5 行，每行16 株，每個(gè)小區(qū)的面積48 m2，除 去 保 護(hù) 行，所 有 小 區(qū) 用 地48×4×3=576 m2。煙苗于5 月5 日移栽。在煙苗移栽時(shí)將保水劑與細(xì)土按1∶10體積比混合拌勻，均勻施入種植穴內(nèi)；在移栽后30～60 d，將抗蒸騰劑用清水稀釋800～1 000 倍，每3～5 d 早晚各噴1 次，共噴施8 次，整株噴施（包括主干，主噴葉片背部），以噴濕不滴水為度。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 土壤含水率、烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分、大田生育期 煙苗移栽后第30（伸根期）、60（旺長(zhǎng)期）、90 天（成熟期），按照五點(diǎn)取樣法分別采集各小區(qū)20 cm 土層根際土壤樣品20 g，裝入自封袋中，土樣混勻后用烘干稱質(zhì)量法[20]測(cè)定土壤含水率；煙葉采收烘烤后，不同處理隨機(jī)取上部煙葉（頂三葉），用連續(xù)流動(dòng)分析法進(jìn)行化學(xué)成分的測(cè)定[21]；并記錄烤煙下、中、上部葉采收結(jié)束時(shí)間及大田生育期天數(shù)。

1.2.2 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性和相關(guān)基因表達(dá)量

煙苗移栽后第120 天，于各小區(qū)分別采集3 株具有代表性的煙株，取上部葉（頂3葉）葉中部位，剔除主脈和支脈，錫紙包裹，液氮速凍，超低溫冰箱保存。氮代謝關(guān)鍵酶[硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）]活性分別采用相應(yīng)的試劑盒（北京索萊寶生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測(cè)定；碳代謝關(guān)鍵酶[蔗糖合成酶（SS）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）]活性分別采用相應(yīng)試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行測(cè)定，具體操作步驟按照相應(yīng)酶試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。采用EastepSuper 總RNA 提取試劑盒提取煙葉總RNA，采用Novoprotein 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用軟件Primer 6.0 為所有候選基因設(shè)計(jì)qRT-PCR 引物，引物序列見表1。設(shè)計(jì)原則：每條引物堿基數(shù)18～23 bp，產(chǎn) 物 長(zhǎng) 度150～250 bp，退 火 溫 度60～70 ℃，GC 含量為40%～60%。采用AceQTM qPCR SYBR? Green Master Mix 試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，以上3 個(gè)試劑盒均由武漢賽弗瑞科技有限公司提供。試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt算法[22]進(jìn)行分析。在試驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程中，應(yīng)借助超凈工作臺(tái)，佩戴無(wú)菌手套與口罩，確保無(wú)菌環(huán)境。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 26.0軟件處理和分析，使用Origin 2021軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)云煙87成熟采收結(jié)束時(shí)間和大田生育期的影響

不同處理各部位煙葉成熟采收結(jié)束時(shí)間和大田生育期如表2所示。根據(jù)當(dāng)?shù)卦耘喙芾砬闆r，4個(gè)處理下部葉采收結(jié)束時(shí)間一致；T1、T2、T3處理中部葉采收結(jié)束時(shí)間相比CK 分別提前了6、6、13 d；T3處理上部葉采收結(jié)束時(shí)間最早，分別比CK、T1、T2處理提前19、6、6 d。整個(gè)大田生育期以T3 處理最短，為126 d，T1、T2 處理烤煙大田生育期一致，相比CK 縮短了13 d?？梢?，保水劑、抗蒸騰劑能夠使云煙87中、上部葉提前采收，縮短大田生育期。

表2 不同處理下、中、上部葉成熟采收時(shí)間Tab.2 Harvest time of tobacco leaves in different parts under different treatments

2.2 不同處理對(duì)云煙87烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

不同處理烤后上部煙葉常規(guī)化學(xué)成分如表3所示。4個(gè)處理之間烤后煙葉煙堿、總氮、氯含量均有顯著差異，其關(guān)系為CK＜T1＜T2＜T3，表明保水劑、抗蒸騰劑能夠降低烤煙中煙堿、總氮、氯含量；在還原糖、總糖、鉀、鉀氯比和糖堿比指標(biāo)上均表現(xiàn)為T1、T2、T3處理顯著高于CK，T3處理最高，表明保水劑、抗蒸騰劑能夠提高還原糖、總糖、鉀含量以及鉀氯比、糖堿比?？偟膩?lái)看，施加保水劑和抗蒸騰劑處理（T3）最優(yōu)，最能改善烤后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的協(xié)調(diào)性。

表3 不同處理烤后上部煙葉常規(guī)化學(xué)成分Tab.3 Conventional chemical components of upper flue-cured tobacco leaves under different treatments

2.3 不同處理對(duì)云煙87移栽后土壤含水率的影響

3 個(gè)時(shí)期的土壤含水率如圖1 所示，烤煙移栽后30 d，各處理的土壤含水率差異不顯著；移栽后60 d，CK、T2 處理的土壤含水率相對(duì)栽后30 d 有所降低，T1、T3 處理土壤含水率則有所提高，T1、T2、T3 處理與CK 差異顯著，且T3 處理顯著高于T2 處理，說(shuō)明保水劑、抗蒸騰劑一定程度上能夠減少水分消耗，保水劑比抗蒸騰劑更能提高土壤含水率，且保水劑和抗蒸騰劑配施效果更好；移栽后90 d，土壤含水率下降，CK、T1、T2、T3 處理土壤含水率相對(duì)移栽后60 d 分別降低了20.47%、31.67%、33.09%、24.17%，T3 處理土壤含水率顯著高于CK和T1、T2 處理，CK、T2 處理無(wú)顯著差異，說(shuō)明保水劑、抗蒸騰劑在后期作用相對(duì)減小?？傮w來(lái)看，保水劑、抗蒸騰劑對(duì)土壤含水率均有影響，保水劑影響較大，且主要在旺長(zhǎng)期發(fā)揮作用，保水劑和抗蒸騰劑配施效果最好。

圖1 烤煙移栽后30、60、90 d的土壤含水率Fig.1 Soil moisture content at 30，60，90 days after transplanting of flue-cured tobacco

2.4 不同處理對(duì)云煙87碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

烤煙移栽后120 d，不同處理上部葉碳氮代謝關(guān)鍵酶活性如圖2所示。由圖2A可知，3個(gè)處理NR活性與CK 有顯著差異，T1、T2、T3 處理NR 活性分別為CK 的46.82%、39.92%、20.16%；由圖2B 可看出，各處理GS 活性差異情況與NR 活性類似，T1、T2、T3 處理GS 活性分別是CK 的54.88%、53.83%、30.99%，T3 處理的GS 活性最低?？梢姡Ｋ畡?、抗蒸騰劑能夠在烤煙成熟期降低NR、GS 活性，以T3處理最優(yōu)。

圖2 烤煙移栽后120 d上部葉NR（A）、GS（B）、SPS（C）、SS（D）活性Fig.2 Activities of NR（A），GS（B），SPS（C），SS（D）in the upper leaves of flue-cured tobacco at 120 days after transplanting

由圖2C 可知，CK SPS 活性最高，顯著高于T1、T2、T3 處理，T1、T2 處理間無(wú)顯著差異，T3 處理SPS活性最低，分別比CK、T1、T2 處理降低62.29%、32.35%、34.28%；由圖2D 可知，各處理SS 活性差異與SPS 活性相似，T3 處理SS 活性最低，分別比CK、T1、T2處理降低69.23%、44.83%、42.86%。

2.5 不同處理對(duì)云煙87碳氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響

烤煙移栽后120 d 不同處理碳氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量如圖3 所示。由圖3A 可知，CK 的NtNR相對(duì)表達(dá)量顯著高于T1、T2、T3處理，T1、T2處理間差異不顯著，T3 處理的NtNR相對(duì)表達(dá)量最低，分別是CK、T1、T2 處理的25.74%、40.62%、44.07%；由圖3B可知，T1、T2、T3 處理的NtGS相對(duì)表達(dá)量顯著低于CK，T1、T2 處理間無(wú)顯著差異，T1、T2、T3 處理的NtGS相對(duì)表達(dá)量分別是CK 的58.42%、54.46%、25.74%。

圖3 烤煙移栽后120 d上部葉中NtNR（A）、NtGS（B）、NtSPS（C）、NtSS（D）相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression of NtNR（A），NtGS（B），NtSPS（C）and NtSS（D）in the upper leaves of flue-cured tobacco at 120 days after transplanting

由圖3C可知，T3處理的NtSPS相對(duì)表達(dá)量顯著低于CK、T1、T2 處理，T1、T2 處理間無(wú)顯著差異，各處理的NtSPS相對(duì)表達(dá)量為CK＜T2＜T1＜T3；由圖3D可知，CK 的NtSS相對(duì)表達(dá)量最高，T3 處理最低，各處理NtSS相對(duì)表達(dá)量為CK＜T1＜T2＜T3。

2.6 不同處理云煙87碳氮代謝關(guān)鍵酶活性、相關(guān)基因表達(dá)量與煙葉常規(guī)化學(xué)成分的相關(guān)性

烤煙移栽后120 d 碳氮代謝酶活性與基因表達(dá)量的相關(guān)性如表4、5 所示。結(jié)果表明，NR、GS 活性與NtNR、NtGS相對(duì)表達(dá)量之間呈顯著或極顯著正相關(guān)，其中GS 活性與NR 活性、NtGS相對(duì)表達(dá)量間呈極顯著相關(guān)，NtNR與NtGS相對(duì)表達(dá)量之間相關(guān)性達(dá)極顯著水平；SPS、SS 活性與NtSPS、NtSS相對(duì)表達(dá)量四者之間呈顯著正相關(guān)水平，其中SPS、SS活性之間和NtSPS、NtSS相對(duì)表達(dá)量之間達(dá)極顯著水平。

表4 云煙87移栽后120 d氮代謝酶活性與基因表達(dá)量的相關(guān)性Tab.4 Correlation between enzyme activity of nitrogen metabolism and gene expression of Yunyan 87 at 120 days after transplanting

表5 云煙87移栽后120 d碳代謝酶活性與基因表達(dá)量的相關(guān)性Tab.5 Correlation between carbon metabolic enzyme activity and gene expression of Yunyan 87 at 120 days after transplanting

烤煙移栽后120 d 碳氮代謝酶活性及基因表達(dá)量與常規(guī)化學(xué)成分的相關(guān)性如表6所示。碳氮關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量與煙堿、總氮、氯含量呈顯著或極顯著正相關(guān)水平，與還原糖、總糖、鉀含量以及鉀氯比、糖堿比、氮堿比呈負(fù)相關(guān)水平，其中碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量與鉀含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

表6 云煙87移栽后120 d碳氮代謝酶活性及基因表達(dá)量與常規(guī)化學(xué)成分的相關(guān)性Tab.6 Correlation between carbon and nitrogen metabolizing enzyme activities and gene expression levels and conventional chemical components of Yunyan 87 at 120 days after transplanting

綜上所述，碳氮代謝關(guān)鍵酶活性與相關(guān)基因表達(dá)量呈顯著正相關(guān)水平，說(shuō)明碳氮代謝基因調(diào)控?zé)熑~碳氮代謝；碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及基因表達(dá)量與煙堿、總氮、氯、鉀含量顯著相關(guān)，說(shuō)明碳氮代謝對(duì)烤煙常規(guī)化學(xué)成分有顯著影響。

3 結(jié)論與討論

在烤煙遇到干旱時(shí)，施加保水劑能夠減少土壤水分流失，提高水分利用率[23]，施加抗蒸騰劑能夠降低葉片蒸騰速率，減少水分蒸發(fā)，提高烤煙抗旱能力。前人研究[24-26]發(fā)現(xiàn)，適宜用量的保水劑能夠?qū)ν寥篮势鸬揭欢ǖ摹熬彌_作用”，加快烤煙生長(zhǎng)，縮短生育期；噴施抗蒸騰劑可以有效減少煙葉蒸騰作用導(dǎo)致的水分蒸發(fā)，使煙株正常落黃成熟，提高煙葉產(chǎn)量品質(zhì)；但也有研究[27-28]表明，施加保水劑在前期對(duì)土壤含水率影響較大，能夠推遲煙株現(xiàn)蕾和采收期，延長(zhǎng)生育期。這可能是由于各地氣候條件以及土壤理化性質(zhì)不同所致。

本研究結(jié)果顯示，在豫西煙區(qū)施用保水劑、抗蒸騰劑能夠縮短大田生育期，緩解當(dāng)?shù)刎澢嗤硎靻?wèn)題，使烤煙適時(shí)成熟，這與崔德強(qiáng)[26]的研究結(jié)果一致；保水劑、抗蒸騰劑使云煙87烤后煙葉還原糖、總糖、鉀含量增加，煙堿、總氮、氯含量降低，糖堿比、鉀氯比提高，保水劑和抗蒸騰劑配施處理的烤后煙葉化學(xué)成分更協(xié)調(diào)，煙葉品質(zhì)更好。

豫西煙葉貪青晚熟的最大原因是前期土壤水分不足，根系吸收的水分不能補(bǔ)償煙株發(fā)育所需和蒸騰消耗。對(duì)烤煙各個(gè)時(shí)期土壤含水率的研究發(fā)現(xiàn)，移栽時(shí)施加保水劑對(duì)烤煙伸根期土壤含水率無(wú)顯著影響，這與劉世亮等[29]的研究結(jié)果相似。受其自身屬性、土壤微生物等因素的影響，保水劑在土壤中的作用效應(yīng)是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，關(guān)于保水劑在烤煙伸根期的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。在旺長(zhǎng)期和成熟期，保水劑、抗蒸騰劑均提高了土壤含水率，有助于煙葉快速生長(zhǎng)，適時(shí)成熟，這與梅亞楠等[9]的研究結(jié)果一致。

碳氮代謝作為煙葉中最基本、最重要的代謝，其協(xié)調(diào)性對(duì)烤煙的生長(zhǎng)發(fā)育和煙葉的產(chǎn)量、品質(zhì)有很大影響[30-32]。隨著烤煙成熟衰老，氮代謝能力逐漸降低[33]，碳代謝的固定和轉(zhuǎn)化能力減弱[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，在烤煙生長(zhǎng)后期，保水劑與抗蒸騰劑的施用使碳氮代謝關(guān)鍵酶活性與基因表達(dá)量降低，進(jìn)而促進(jìn)煙葉落黃，加速烤煙成熟；碳氮代謝相關(guān)基因參與調(diào)控碳氮代謝，碳氮代謝不僅能反映煙葉成熟衰老程度，對(duì)煙葉常規(guī)化學(xué)成分也有重要影響，隨著碳氮代謝的減弱，煙葉中煙堿、總氮、氯含量降低，還原糖、總糖、鉀含量升高，鉀氯比、糖堿比得到提高，施加保水劑和抗蒸騰劑使烤煙化學(xué)成分協(xié)調(diào)，煙葉品質(zhì)提高，這與康雪莉[35]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，保水劑和抗蒸騰劑配施更能提高土壤含水率，單獨(dú)施用保水劑比單獨(dú)施用抗蒸騰劑效果好，二者在旺長(zhǎng)期發(fā)揮作用較大；煙株的可利用水分提高使其在前中期得到充分發(fā)育，從而適時(shí)成熟，大田生育期提前；施用保水劑、抗蒸騰劑可以使成熟期云煙87的碳氮代謝能力減弱，進(jìn)而促進(jìn)淀粉轉(zhuǎn)化，使烤后煙葉化學(xué)成分更協(xié)調(diào)，品質(zhì)更佳；保水劑和抗蒸騰劑配施處理效果最優(yōu)，能夠緩解豫西煙區(qū)降雨與烤煙生長(zhǎng)需水不協(xié)調(diào)、煙葉貪青晚熟等問(wèn)題，符合當(dāng)?shù)乜緹熢耘啻胧?/p>