利用CRISPR/Cas9 技術(shù)創(chuàng)制小麥耐低肥Taaap3 突變體

李 艷，陳艷艷，華 夏，方宇輝，王玉民，鞏 晨，齊學(xué)禮，胡 琳

（1.河南省作物分子育種研究院/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省麥類種質(zhì)資源創(chuàng)新與改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2.神農(nóng)種業(yè)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

氮素在植物光合作用中起著關(guān)鍵作用，氮素的吸收利用程度與植物生長(zhǎng)發(fā)育狀況密切相關(guān)。無(wú)機(jī)氮主要以硝酸鹽和銨的形式被植物吸收，然后直接在根中或轉(zhuǎn)移到葉子后轉(zhuǎn)化為氨基酸[1]，氨基酸被輸送到根、葉、花和籽粒中[2]。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Amino acid transporters，AAT）是位于生物膜上吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的蛋白質(zhì)，是植物代謝過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子[3-6]，對(duì)植物氮素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要貢獻(xiàn)[7]。氨基酸透性酶家族（Amino acid permeases，AAPs）是氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（Amino acid transporter family，ATF）中的亞家族，在氮匯和氮供應(yīng)氨基酸的裝載中起著重要作用[8]。

AAPs 基因最早在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中被發(fā)現(xiàn)，擬南芥中有8 個(gè)AAPs 基因（AtAAP1—AtAAP8），AtAAPs 基因優(yōu)先在維管組織中表達(dá)，負(fù)責(zé)酸性、中性及堿性氨基酸的長(zhǎng)距離運(yùn)輸[7]。AtAAP1基因在根尖和根毛的表皮細(xì)胞中表達(dá)，在土壤中介導(dǎo)谷氨酸和中性氨基酸的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[9-10]。AtAAP2基因定位在韌皮部，能將葉片中的氨基酸裝載到韌皮部進(jìn)而轉(zhuǎn)運(yùn)至種子，對(duì)氨基酸在源庫(kù)不同器官中的分配發(fā)揮重要作用[11]。AtAAP3和AtAAP5基因主要在根部表達(dá)，介導(dǎo)堿性氨基酸的吸收[7]。AtAAP6基因主要在木質(zhì)部薄壁細(xì)胞中表達(dá)，調(diào)節(jié)韌皮部的氨基酸組成[12]。AtAAP8基因主要在未成熟的種子和成熟角果中表達(dá)，定位于質(zhì)膜，負(fù)責(zé)將氨基酸運(yùn)輸?shù)脚呷橹泄┓N胚發(fā)育[13-14]。OsAAP6基因顯著增強(qiáng)根系對(duì)一系列氨基酸的吸收，并影響各種氨基酸的分布[3]。OsAAP4基因過(guò)表達(dá)可以提高轉(zhuǎn)基因水稻植株中性氨基酸濃度，增加分蘗數(shù)，進(jìn)而提高籽粒產(chǎn)量[15]。OsAAP3基因主要轉(zhuǎn)運(yùn)堿性氨基酸賴氨酸和精氨酸[16]，在水稻中抑制OsAAP3基因表達(dá)，可以降低賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、蘇氨酸和酪氨酸濃度，促進(jìn)發(fā)芽，增加分蘗數(shù)，進(jìn)而提高籽粒產(chǎn)量[1]。小麥（Triticum aestivumL.）中關(guān)于TaAAPs 基因功能的研究報(bào)道甚少，僅有研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)TaAAP3基因可提高轉(zhuǎn)基因小麥的耐鹽能力[17]，關(guān)于其耐低肥方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，以生產(chǎn)上大面積推廣的小麥品種鄭麥1860、鄭麥1342 和鄭麥7698 為背景材料，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除TaAAP3基因，創(chuàng)制小麥Taaap3突變體，為耐低肥小麥新品種的培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2022—2023 年在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗(yàn)示范基地（新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣，113°42′4″E、35°0′17″N）進(jìn)行。供試小麥品種為河南省作物分子育種研究院小麥分子育種團(tuán)隊(duì)選育的鄭麥1860、鄭麥1342 和鄭麥7698?；蚓庉嬢d體TaU6-sgRNA 和Cas9基因載體pJIT163-ubirCas9由北京吉諾沃公司提供；限制性內(nèi)切酶BstⅪ和Q5 PCR 擴(kuò)增酶均購(gòu)自NEB 有限公司；引物合成及測(cè)序由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司完成。

1.2 基因編輯載體的構(gòu)建

根據(jù)水稻OsAAP3基因（LOC_Os06g36180）序列，通過(guò)Gramene 網(wǎng)站（https://archive.gramene.org/）BLAST 獲得TaAAP3基因A、B、D 亞基因組DNA 和cDNA 序 列（Triticum_aestivum_TRIAE_CS42_7AL_TGACv1_557545_AA1782830、Triticum_aestivum_TRIAE_CS42_7BL_TGACv1_576825_AA1856230、Triticum_aestivum_TRIAE_CS42_U_TGACv1_640866_AA2077760），利 用 網(wǎng) 站http://crispor.tefor.net/在TaAAP3基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)4 個(gè)sgRNA 引物sgRNA1—sgRNA4（圖1），引物序列見(jiàn)表1。在sgRNA 正向引物5′端均加上黏性末端CTTG，在反向引物5′端均加上黏性末端AAAC。將4 個(gè)sgRNA 引物的sgRNA-F 和sgRNA-R 分別退火形成有黏性末端的雙鏈DNA，將該雙鏈DNA 連接到經(jīng)BpiⅠ酶切的TaU6-sgRNA 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，挑取單克隆，利用引物M13F/sgRNA-R 進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，測(cè)序無(wú)誤后，編輯載體便構(gòu)建完成。將構(gòu)建好的4個(gè)TaU6-sgRNA 載體分別與pJIT163-ubi-rCas9載體共轉(zhuǎn)化小麥原生質(zhì)體，轉(zhuǎn)化方法按照小麥原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒（北京酷來(lái)搏科技有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，23 ℃黑暗條件下培養(yǎng)2 d后，提取原生質(zhì)體DNA，sgRNA 活性檢測(cè)采用突變位點(diǎn)檢測(cè)通用引物（TaAAP3-T）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，對(duì)PCR 擴(kuò)增出的700 bp 目的片段進(jìn)行BstⅪ酶切，若未被BstⅪ限制性內(nèi)切酶切開(kāi)，則證明sgRNA 有活性，可用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

圖1 設(shè)計(jì)的sgRNA靶向TaAAP3基因編碼區(qū)的位置Fig.1 The location of the designed sgRNAs targeting the coding sequence of TaAAP3 gene

1.3 遺傳轉(zhuǎn)化

在小麥開(kāi)花后12～14 d，取穗中部、大小一致的未成熟種子，用70%乙醇表面消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3 次，然后用0.1%HgCl2消毒6 min，無(wú)菌水沖洗3～4 次。在超凈工作臺(tái)上剝出幼胚，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+2 mg/L 2，4-D+4 g/L 瓊脂+30 g/L 蔗糖，pH值6.2）上，培養(yǎng)1 d 后用于遺傳轉(zhuǎn)化。利用基因槍介導(dǎo)法將構(gòu)建好的TaU6-sgRNA 與pJIT163-ubirCas9共轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織，具體轉(zhuǎn)化方法參照HU等[18]的方法并稍作改進(jìn)。經(jīng)基因槍轟擊后的愈傷組織在高滲培養(yǎng)基（MS+2 mg/L 2，4-D+7 g/L 瓊脂+0.4 mol/L 甘 露 醇+30 g/L 蔗 糖，pH 值5.8）上 培 養(yǎng)16 h，轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)、分化和生根，獲得再生植株。待再生苗根系較健壯時(shí)，移載入花盆中，放置于溫室中培養(yǎng)，獲得T0植株。提取T0植株的基因組DNA，用突變位點(diǎn)檢測(cè)通用引物（TaAAP3-T）進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增，對(duì)PCR 擴(kuò) 增 出 的700 bp 目的片段進(jìn)行BstⅪ酶切，目的片段未被BstⅪ限制性內(nèi)切酶切開(kāi)的植株即為T(mén)0突變植株。T0突變植株自交獲得T1種子。

1.4 田間肥力試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用T3Tappp3突變體和野生型進(jìn)行田間試驗(yàn)，設(shè)置正常和低肥2種處理，其中，正常處理基礎(chǔ)肥力為有機(jī)質(zhì)11.32 g/kg、全氮0.76 g/kg、堿解氮71.84 mg/kg、有效磷53.51 mg/kg、速效鉀212.43 mg/kg，施肥量為尿素（含N 46%）493.65 kg/hm2、磷酸二銨（含N 17%、P2O540%）89.25 kg/hm2；低肥處理基礎(chǔ)肥力為有機(jī)質(zhì)11.98 g/kg、全氮0.64 g/kg、堿解氮65.52 mg/kg、有效磷22.39 mg/kg、速效鉀149.60 mg/kg，施肥量為尿素257.55 kg/hm2、磷酸二銨115.5 kg/hm2。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)0.3 hm2，正常田間管理。成熟時(shí)，收獲整個(gè)小區(qū)小麥用于測(cè)產(chǎn)。

1.5 TaAAP3基因靶點(diǎn)序列突變檢測(cè)

提取T2幼苗葉片DNA，先用TaAAP3基因靶點(diǎn)序列的通用引物（TaAAP3-T）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后用限制性內(nèi)切酶BstⅪ對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，篩選突變植株。分別采用含有TaAAP3基因靶點(diǎn)序列的A、B、D 亞基因組特異引物對(duì)獲得的突變體進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測(cè)序，利用BioXM 2.6 軟件比對(duì)分析突變位點(diǎn)。所用引物序列見(jiàn)表1。

1.6 TaAAP3基因表達(dá)量分析

采用植物RNA 提取試劑盒（天根生物科技有限公司）提取T2Taaap3突變體和野生型葉片總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega公司）將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使 用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix Q711（諾唯贊生物有限公司）在Bio-Rad iQ5 上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）擴(kuò)增。用TaAAP3基因靶點(diǎn)序列的通用引物擴(kuò)增TaAAP3基因，以小麥Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃復(fù)性30 s，40 個(gè)循環(huán)。所有試驗(yàn)樣品均3 次重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 氨基酸序列比對(duì)分析

利用Geneious 軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸序列比對(duì)分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaAAP3基因編輯載體的構(gòu)建

將4 個(gè)靶標(biāo)TaAAP3基因編碼區(qū)的sgRNA 引物sgRNA-F 和sgRNA-R 分別退火形成雙鏈DNA，將該雙鏈DNA 連接到經(jīng)BpiⅠ酶切的TaU6-sgRNA 載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行菌落PCR 擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示在400 bp 處出現(xiàn)目的條帶（圖2）。對(duì)菌落PCR擴(kuò)增陽(yáng)性的菌斑進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示4 個(gè)sgRNA 引物均連入TaU6-sgRNA 載體（圖3），經(jīng)原生質(zhì)體活性檢測(cè)后確定sgRNA4（517—535 bp）為靶點(diǎn)序列，536—538 bp 作 為PAM（Protospacer adjacent motif）序列，將其構(gòu)建好的載體命名為T(mén)aU6-AAP3-sgRNA，用于小麥遺傳轉(zhuǎn)化。

圖2 4個(gè)基因編輯載體的單克隆菌落PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Monoclonal PCR detection results of four gene editing vectors

圖3 4個(gè)基因編輯載體的陽(yáng)性單克隆測(cè)序結(jié)果Fig.3 Positive monoclonal sequencing results of four gene editing vectors

2.2 不同遺傳背景下Taaap3 突變體的獲得及TaAAP3基因靶點(diǎn)序列突變類型分析

以鄭麥1860、鄭麥1342 和鄭麥7698 為受體材料，利用基因槍介導(dǎo)法將TaU6-AAP3-sgRNA 與pJIT163-ubi-rCas9載體共轉(zhuǎn)化小麥愈傷組織，獲得再生植株。經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證共篩選獲得3個(gè)突變體，鄭麥1860、鄭麥1342 和鄭麥7698 各獲得1 個(gè) 突 變 體，分 別 為T(mén)aaap3-1、Taaap3-2 和Taaap3-3（圖4—圖5）。分別采用A、B、D 亞基因組靶位點(diǎn)檢測(cè)引物通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序分析T2突變體的突變類型。測(cè)序結(jié)果顯示（圖6），突變體Taaap3-1 為三突變類型，A、B、D 3 個(gè)亞基因組均為純合突變，A 亞基因組在靶點(diǎn)處有26 bp 缺失，B 亞基因組插入1 bp，D 亞基因組插入51 bp；突變體Taaap3-2也為三突變類型，A、B、D亞基因組亦均為純合突變，A 亞基因組在靶點(diǎn)處插入1 bp，B 亞基因組缺失23 bp，D亞基因組插入1 bp；突變體Taaap3-3為單突變類型，僅A 亞基因組發(fā)生突變，插入2 bp堿基，B和D亞基因組均未突變。

圖4 Taaap3突變體的PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR detection results of Taaap3 mutants

圖5 突變體Taaap3的Bst Ⅺ酶切結(jié)果Fig.5 Bst Ⅺdigestion results of Taaap3 mutants

2.3 Taaap3突變體編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列分析

對(duì)Taaap3突變體編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖7），與野生型TaAAP3蛋白氨基酸序列相比，突變體Taaap3-1 A 亞基因組自第174 個(gè)氨基酸開(kāi)始發(fā)生突變，之后的氨基酸序列完全被改變；B 亞基因組和D 亞基因組均在第178 個(gè)氨基酸處發(fā)生突變，并產(chǎn)生移碼突變，導(dǎo)致翻譯提前終止，編碼氨基酸數(shù)由野生型的490 個(gè)分別縮短為177 個(gè)和182 個(gè)。突變體Taaap3-2 A、D 亞基因組均從第178 個(gè)氨基酸開(kāi)始發(fā)生突變，B 亞基因組自第175 個(gè)氨基酸開(kāi)始發(fā)生突變，之后的氨基酸序列完全被改變。突變體Taaap3-1和Taaap3-2 A、B、D亞基因組突變均導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域發(fā)生改變，可能使TaAAP3 蛋白喪失了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的活性。突變體Taaap3-3 A亞基因組自第178個(gè)氨基酸開(kāi)始發(fā)生突變，之后的氨基酸序列亦完全被改變；B亞基因組和D亞基因組均未發(fā)生突變。

2.4 Taaap3突變體中TaAAP3基因的表達(dá)分析

TaAAP3基因核苷酸序列和表達(dá)水平在鄭麥1860、鄭麥1342 和鄭麥7698 中無(wú)明顯差異。因此，以鄭麥1860 為對(duì)照，利用qRT-PCR 方法分析突變體Taaap3-1、Taaap3-2 和Taaap3-3 幼 苗 葉 片 中TaAAP3基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖8），3 個(gè)突變體幼苗葉片中TaAAP3基因表達(dá)水平均極顯著低于野生型；突變體Taaap3-1 和Taaap3-2 中TaAAP3基因表達(dá)水平極顯著低于Taaap3-3。說(shuō)明TaAAP3基因A、B、D 亞基因組堿基的缺失和插入極顯著降低了TaAAP3基因的表達(dá)量，且三突變類型突變體的TaAAP3基因表達(dá)水平極顯著低于單突變類型。因此，通過(guò)CRISPR/Cas9 技術(shù)已成功對(duì)鄭麥1860、鄭麥1342 和鄭麥7698 中TaAAP3基因進(jìn)行了編輯，堿基的插入、缺失導(dǎo)致了該基因移碼突變，從而影響了其正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。

圖8 Taaap3突變體葉片中TaAAP3基因的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of TaAAP3 gene in leaves of Taaap3 mutants

2.5 Taaap3突變體的籽粒產(chǎn)量分析

在大田正常和低肥條件下，對(duì)突變體Taaap3的籽粒產(chǎn)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（圖9），正常條件下，突變體Taaap3-1、Taaap3-2 和Taaap3-3 籽粒產(chǎn)量均高于其野生型，分別較野生型增產(chǎn)2.29%、3.40% 和0.93%，但均未達(dá)到顯著水平；低肥條件下，3個(gè)突變體籽粒產(chǎn)量均顯著或極顯著高于其野生型，Taaap3-1、Taaap3-2 和Taaap3-3 分別較野生型增產(chǎn)6.89%、5.90% 和4.59%。綜上，低肥條件下TaAAP3基因表達(dá)水平降低可提高小麥籽粒產(chǎn)量。

圖9 Taaap3突變體田間籽粒產(chǎn)量分析Fig.9 Analysis of grain yields of Taaap3 mutants in field

3 結(jié)論與討論

氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要的作用，并直接或間接參與對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要的氮代謝過(guò)程。目前，有關(guān)植物氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能的研究主要集中在ATF（Amino acid transporter family）和APC（Amino acid polyamine and choline transporters）2 個(gè)家族。AAPs 是ATF 家族中的亞家族，已在植物中進(jìn)行了廣泛的功能研究。水稻中有19個(gè)AAPs基因，其中OsAAP6基因影響水稻中各種氨基酸的分布，并正向調(diào)控稻米蛋白質(zhì)含量和品質(zhì)[3]。有些研究發(fā)現(xiàn)，OsAAP3或OsAAP5基因被抑制表達(dá)后，通過(guò)調(diào)控賴氨酸和精氨酸濃度來(lái)提高籽粒產(chǎn)量[1，19]。OsAAP1基因通過(guò)調(diào)控中性氨基酸的吸收和再分配來(lái)影響植株生長(zhǎng)和產(chǎn)量[20]。還有些研究發(fā)現(xiàn)，AtAAP3基因的T-DNA 插入突變體和AtAAP1基因的RNAi突變體的表型與野生型均沒(méi)有明顯差異，推測(cè)其原因是AtAAP2、AtAAP5和AtAAP6基因可能在某種程度上與AtAAP3基因功能互補(bǔ)[5，21-22]，且AtAAP5基因可能還與AtAAP1基因功能互補(bǔ)。本研究結(jié)果表明，在小麥中敲除TaAAP3基因后，正常條件下，突變體Taaap3較野生型增產(chǎn)幅度較小，未達(dá)到顯著水平，這與前人研究結(jié)果相似[5，21-22]；低肥條件下，突變體Taaap3較野生型顯著增產(chǎn)，且TaAAP3基因表達(dá)水平越低，增產(chǎn)幅度越大，即A、B、D 3 個(gè)亞基因組均發(fā)生突變比單個(gè)亞基因組發(fā)生突變?cè)霎a(chǎn)明顯。推測(cè)抑制TaAAP3基因表達(dá)可以提高小麥養(yǎng)分利用效率。今后將進(jìn)一步深入研究TaAAP3基因在小麥中的功能。

目前，CRISPR/Cas9 技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水稻[23-25]、玉米[26-27]和小麥[28-29]等多種農(nóng)作物性狀改良研究。由于普通小麥?zhǔn)怯葾、B、D 3 個(gè)亞基因組組成的六倍體作物，具有龐大的基因組和功能冗余的基因。因此，同時(shí)突變位于多個(gè)亞基因組位點(diǎn)的多個(gè)等位基因是比較困難的。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)已創(chuàng)制了抗病、優(yōu)質(zhì)專用和高產(chǎn)等小麥新種質(zhì)。研究人員利用CRISPR/Cas9 技 術(shù) 定 點(diǎn) 敲 除TaEDR1（Enhanced disease resistance 1）和TaMLO（Mildew resistance locus）基因后，均獲得了抗白粉病小麥新種質(zhì)[30-31]。TaNFXL1（Nuclear transcription factor X box-binding-like 1）基因和TaSBEIIa（Starch branching enzyme Ⅱa）基因被定點(diǎn)敲除后，分別獲得了抗赤霉病和高抗性淀粉小麥新種質(zhì)[28，32]。本研究以生產(chǎn)上大面積推廣的小麥品種鄭麥7698、鄭麥1860 和鄭麥1342 為背景材料，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除了TaAAP3基因，分別獲得了A 亞基因組純合單突變類型和A、B、D 3個(gè)亞基因組純合突變的三突變類型的突變體。TaAAP3基因在突變體中的表達(dá)量顯著低于野生型，在三突變類型突變體Taaap3-1 和Taaap3-2 中的表達(dá)量均顯著低于單突變類型突變體Taaap3-3。另外，低肥條件下，突變體Taaap3-1 和Taaap3-2 較野生型的增產(chǎn)幅度大于突變體Taaap3-3，突變體Taaap3-1增產(chǎn)幅度最大。說(shuō)明小麥中TaAAP3基因突變類型不同，突變體產(chǎn)量表現(xiàn)亦有差異。在小麥中精準(zhǔn)高效編輯該基因，可創(chuàng)制出高產(chǎn)高效突破性小麥新種質(zhì)。CRISPR/Cas9技術(shù)雖可定點(diǎn)敲除目標(biāo)基因，但無(wú)法高效地誘導(dǎo)點(diǎn)突變等編輯類型。引導(dǎo)編輯技術(shù)相比CRISPR/Cas9技術(shù)具有更高的特異性和安全性，將在未來(lái)農(nóng)作物遺傳改良中發(fā)揮重要作用。