沒食子酸改性竹粉的制備及抑菌性能

葉金枝，徐 涓，楊 靜，楊海艷，王大偉，史正軍,

（1.西南林業(yè)大學 國家林業(yè)和草原局叢生竹工程技術研究中心，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學 西南地區(qū)林業(yè)生物質(zhì)資源高效利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，云南 昆明 650224）

竹材因孔隙層次多，含有豐富的多糖、蛋白質(zhì)和水分等營養(yǎng)物質(zhì)，極易受微生物侵染[1-2]。因此，通過技術手段改良竹材以增強竹材的抑菌性能尤為重要[3]。目前常用的木材、竹材抑菌改性劑有無機抑菌劑和有機抑菌劑2 類[4]。無機抑菌劑與纖維之間是物理吸附，相互作用力弱，容易流失；有機抑菌劑雖能與纖維形成化學聯(lián)接，卻容易對環(huán)境造成污染，使微生物產(chǎn)生抗藥性。植物多酚是天然植物原料中的有效成分，因其種類繁多、生產(chǎn)量大、能抗炎抑菌而備受關注[5]。天然多酚類化合物沒食子酸能通過接觸微生物造成細胞膜局部破裂成孔，破壞細胞膜完整性，使得細胞膜內(nèi)物質(zhì)泄漏，進而殺死細胞[6]，因此，近年來被廣泛應用于改良材料的抑菌性能。ZHANG 等[7]和ZARANDONA 等[8]使用沒食子酸制備的乙?；z和殼聚糖膜均表現(xiàn)出優(yōu)異的抑菌效果。龍竹Dendrocalamusgiganteus是滇東南地區(qū)廣泛分布的特色大型叢生竹材，常被應用于西南少數(shù)民族建筑和家具制品，但其抗生物侵害能力不足的特性嚴重影響了其使用周期和產(chǎn)品質(zhì)量[9]。本研究基于竹材細胞壁組分多羥基特性和沒食子酸的天然抑菌活性，用沒食子酸改性龍竹竹粉，并對改性竹粉的結構特性和抑菌性能進行分析表征，可為發(fā)展植物源竹材綠色防護技術提供方法借鑒和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試竹材為云南省臨滄市滄源縣3 年生無腐朽無霉變龍竹。供試菌種大腸埃希菌Escherichiacoli(革蘭氏陰性細菌)和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(革蘭氏陽性細菌)購自北京保藏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 龍竹預處理 將龍竹去節(jié)，去除竹青竹黃，劈成竹片，用粉碎機粉碎后過40～60 目篩，將該原料記作DG；用苯醇抽提(體積比為2∶1) 6 h 做脫蠟處理，放在60 ℃的烘箱內(nèi)干燥備用，抽提物料記作DG-E；稱取DG-E 物料10.00 g，加入質(zhì)量濃度為5%的氫氧化鈉溶液，固液比為1∶20，在80 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)磁力攪拌回流2 h，用蒸餾水洗滌至中性，冷凍干燥，制備得到堿處理的竹粉，堿處理物料記作DG-A。

1.2.2 龍竹改性處理 龍竹改性方法在文獻[10]的基礎上略有改動：稱取10.00 g 沒食子酸(GA)于燒杯中，加入100 mL N, N-二甲基甲酰胺(DMF)，攪拌完全溶解；加入DG-A 3.50 g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 12.00 g 和4-二甲氨基吡啶(DMAP) 1.45 g；水浴攪拌反應48 h，反應溫度為60 ℃，待反應結束后用蒸餾水和乙醇反復洗滌烘干備用，得到的物料標記為DG-GA。

1.2.3 菌液濃度測定及配制 參考GB/T 20944.3—2008[11]略有改動制備菌液。將第3 代菌液采用10 倍稀釋法稀釋到合適倍數(shù)后，取50 μL 涂布，培養(yǎng)24 h 觀察，確定菌液濃度達1×1012～5×1012CFU·L-1，菌液分別記作SA-1 和EC-1。將SA-1 和EC-1 菌液用10 倍稀釋法稀釋4 次，使菌液濃度達3×108～4×108CFU·L-1，分別記作SA-2 和EC-2，作為預接種菌液。

1.3 預處理前后及改性后的性能表征

1.3.1 可及度測定 使用直接紅染料(Direct red 28, DR28)對DG、DG-E、DG-A 進行可及度測定[12]。稱取0.1 g 待測樣品與10 mL 不同質(zhì)量濃度的染液(0、0.13、0.30、0.60、0.90、1.20、1.80、2.40、2.80 和3.00 mg·mL-1)混合。放置于恒溫振蕩器中，50 ℃，150 r·min-1保持24 h，收集上清液并用紫外可見分光光度計(UV-210 PC)在498 nm 條件下測定其吸光度，使用標準曲線計算殘液濃度。根據(jù)Langmuir 吸附等溫線擬合分析幾種物料對染料的吸附能力，對龍竹竹粉的可及范圍做出評估。

1.3.2 化學組分測定 參照美國能源再生實驗室NREL 法[13]對DG、DG-E、DG-A 和DG-GA 的化學成分進行分析。用體積分數(shù)為72%的硫酸對物料進行酸水解，使用高效液相色譜儀(Agilent 1200S)對4 種物料中的碳水化合物成分進行分析；使用紫外可見分光光度計在205 nm 處對酸溶木質(zhì)素進行分析，將剩余固體殘渣用G3 砂芯漏斗洗凈，65 ℃烘干，木質(zhì)素總量為酸溶木質(zhì)素與固體殘渣的總和。

1.3.3 結構特性分析 分析DG、DG-E、DG-A 和DG-GA 等4 種樣品的化學結構，使用傅里葉紅外光譜儀(Nexus 670，F(xiàn)TIR)進行掃描，掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數(shù)32 次的模式下采集數(shù)據(jù)。采用X 射線衍射分析儀(X Pert Powder，XRD)分析樣品的結晶結構，使用銅靶波長為0.154 18 nm，2θ掃描區(qū)間為5°～40°，電壓40 kV，電流40 mA。其中結晶指數(shù)可以根據(jù)Segal 公式進行計算：。其中，Icr為結晶指數(shù)，Iamorph指2θ為18°時無定形區(qū)衍射峰的強度，I002為主結晶峰002 的最大衍射強度。

使用掃描電子顯微鏡(Hitachi Regulus 8100，SEM)觀察樣品的表面形貌，加速電壓為2～5 kV，物料表面噴金處理。采用熱重分析儀(TG)，分別稱取4 種樣品約3.0 mg 于陶瓷坩堝中，利用高純度氮氣作為保護氣(氣體流量為20 mL·min-1)和吹掃氣(氣體流量為50 mL·min-1)，樣品升溫速率為10 ℃·min-1，溫度為35～600 ℃。

1.3.4 抑菌活性的測試 參照GB/T 20944.3—2008[11]，探究DG-A 和DG-GA 對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌性能。在三角燒瓶中稱取上述2 種樣品各(0.75±0.05) g，然后在燒瓶中各加入(70.00±0.03)mL 0.03 mol·L-1的PBS 緩沖溶液，再加入5.0 mL SA-2 菌液，每種樣品制備3 個平行樣，另準備3 個不加樣品的空白對照；將每個燒瓶蓋好透氣封口膜，置于恒溫振蕩器上，在(24±1) ℃，以150 r·min-1，振蕩18 h。到規(guī)定時間后，將燒瓶中的試液稀釋至合適的倍數(shù)，取(50.0±0.1) μL 移入固體培養(yǎng)基中，每個試液及不同的稀釋濃度制作3 個平行樣，倒置平板，在(37±1) ℃，培養(yǎng)24～48 h。選擇30～300 CFU 的平板進行計數(shù)，對DG-A 和DG-GA 的活菌濃度進行計數(shù)。按下式計算抑菌率(Y)：。其中，Wt為空白對照組3 組平行樣菌液濃度的平均值；Qt為每種試樣3 組平行樣菌液濃度的平均值。

2 結果與分析

2.1 龍竹預處理前后及改性后的表征

2.1.1 可及度分析 圖1 表明：經(jīng)過苯醇抽提處理后的竹粉(DG-E)對染料的吸附量從44.92 mg·g-1增加到78.66 mg·g-1；堿處理竹粉(DG-A)對染料的吸附量從78.66 mg·g-1增加到174.39 mg·g-1，增加了121.7%。可能是由于堿液進入竹纖維束內(nèi)部，將細胞壁內(nèi)的部分木質(zhì)素和半纖維素溶解，同時潤脹纖維，增大了竹粉的可及度。選擇最大可及度的條件下制備的竹粉樣品進行后續(xù)酯化改性。

圖1 竹粉樣品DG、DG-E 和DG-A 的Langmuir等溫吸附曲線Figure 1 Langmuir isothermal adsorption curves of bamboo powder samples DG, DG-E and DG-A

2.1.2 化學組分分析 由圖2 可見：經(jīng)過苯醇抽提脫蠟處理的竹粉(DG-E)的木質(zhì)纖維化學成分無明顯變化；堿處理竹粉(DG-A)的纖維素相對含量從48.63%增加到61.24%，半纖維素相對含量從15.29%減少到11.39%，木質(zhì)素相對含量從30.36 %減少到18.81%。該結果表明：堿處理去除了部分碳水化合物和木質(zhì)素，使得沒食子酸與竹材內(nèi)部的羥基接觸反應的可能性變大[14]。DG-A 與DG-GA 的化學組分比較結果顯示：纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的相對含量幾乎不變，可見沒食子酸與竹粉的酯化反應對其纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的相對含量影響不大。

圖2 竹粉樣品DG、DG-E、DG-A 和DGGA 的化學組分Figure 2 Chemical composition of bamboo powder samples DG, DGE, DG-A and DG-GA

2.1.3 FTIR 分析 由圖3 可知：3 401 和2 900 cm-1處分別出現(xiàn)O—H 和C—H 的伸縮振動峰，在1 592和1 511 cm-1處的苯環(huán)伸縮振動峰是木質(zhì)素的基本特征吸收峰[15]，在1 052 cm-1處是醚鍵(C—O—C)的吸收峰，894 cm-1是木糖單元之間的β-糖苷鍵的特征吸收[16]；對比DG-E 和DG-A，在1 724 cm-1處的酯鍵(C=O)消失，這是由于木質(zhì)素結構單元之間和木質(zhì)素與碳水化合物之間的聯(lián)接鍵是酯鍵，該鍵在堿性條件下非常容易被水解[14]，所以在堿處理之后，該峰位置的信號明顯減弱；經(jīng)過GA 改性后，1 724 cm-1處的C=O 的吸收峰又顯著增強，并且在1 150～1 200 cm-1處C—O 的伸縮振動也增強，說明竹粉表面可能生成酯鍵[17]。LIU 等[18]用GA 改性果膠，證實了在1 749 cm-1處，果膠的羥基基團與GA 末端的羧基形成酯鍵，該結果與GA 改性DG 的結果相符。

圖3 竹粉樣品DG、DG-E、DG-A 和DG-GA的FTIR 圖Figure 3 FTIR spectra of bamboo powder samples DG, DG-E, DG-A and DG-GA

2.1.4 XRD 分析 由圖4 可以看出：DG、DG-E、DG-A 和DG-GA 等4 種物料的峰形相似，均表現(xiàn)出纖維素Ⅰ型衍射峰。在2θ為16.0°的峰對應為纖維素(101)晶面衍射峰，在2θ為22.0°的峰對應為纖維素(002)晶面衍射峰[14]。與原竹粉相比較，隨著抽提、堿處理和酯化反應的進行，纖維素的結晶度逐漸降低，這是由于堿的潤脹作用會在一定程度上破壞纖維素的結晶結構，從而降低結晶度[19]。經(jīng)過酯化反應后，結晶度由54.93%降至50.73%，這一變化可能是酯基的引入將相對松散的區(qū)域破壞，使得結晶度下降。ZHU 等[20]在松香酸改性木質(zhì)纖維素的研究中，也證實了酯化之后的纖維素結晶度有所降低。

圖4 竹粉樣品DG、DG-E、DG-A 和DG-GA的XRD 圖Figure 4 XRD spectra of bamboo powder samples DG, DG-E, DG-A and DG-GA

2.1.5 SEM 分析 如圖5 所示：天然DG 表面有細微顆粒，纖維束之間黏結緊密；經(jīng)過抽提后，DGE 表面呈鱗狀較為粗糙，是因為解除了蠟質(zhì)的包裹作用；在堿處理后，竹纖維經(jīng)過潤脹，原本連接緊密的竹纖維束變得更加松散，說明堿液有效的浸透到竹材中，DG-A 細胞之間的連接物質(zhì)如木質(zhì)素和半纖維素等減少，這一現(xiàn)象與龍竹化學組分分析結果一致。由于部分低聚物溶出，讓原本致密的竹材變得松散，使得GA 更容易浸入到竹材內(nèi)部發(fā)生反應。改性后的物料DG-GA 更加光滑，無明顯的層次結構，表明纖維素與GA 酯化形成的產(chǎn)物可能形成了包裹物包裹在纖維上。

圖5 竹粉樣品DG、DG-E、DG-A 和DG-GA 的SEM 圖Figure 5 SEM images of bamboo powder samples DG, DG-E, DG-A and DG-GA

2.1.6 TG 分析 由圖6 所示：在初始升溫階段(30～200 ℃)，所有物料均無明顯降解，其質(zhì)量損失主要是由物料中的水等小分子揮發(fā)所導致。180～360 ℃階段為纖維素、半纖維素和部分木質(zhì)素的降解階段[21]。對比可知，DG 和DG-E 的初始降解溫度為190 ℃，DG-A 的初始降解溫度為280 ℃，說明堿處理竹材熱穩(wěn)定性明顯增強，這是由于DG-A 脫除了部分相對易熱解的半纖維素和木質(zhì)素所致。據(jù)報道[22]，GA 在260 ℃附近有明顯的熱化學轉(zhuǎn)變，但本研究在該溫度附近并未出現(xiàn)轉(zhuǎn)變，說明GA 并非簡單吸附在竹粉表面，而是通過與酯鍵與竹粉形成緊密結合。在纖維熱降解最劇烈階段(320～360 ℃)，DG-GA 的初始熱解溫度和最大降解速率溫度均高于DG，說明本研究中所采用的沒食子酸改性有助于提高竹材熱穩(wěn)定性。原因可能是由于酯化反應主要發(fā)生在竹纖維最外層，包裹在竹纖維表面的酯化產(chǎn)物可以有效地充當物理屏障，進而賦予竹粉較高的熱穩(wěn)定性。

圖6 竹粉樣品DG、DG-E、DG-A 和DG-GA 的TG 和DTG 曲線Figure 6 TG and DTG curves of bamboo powder samples DG, DG-E, DG-A and DG-GA

2.2 DG-GA 的抑菌活性結果

由圖7 可見：改性前物料(DG-A)對大腸埃希菌抑菌率為30.70%，改性后的物料(DG-GA)對大腸埃希菌抑菌率為93.24%，抑菌率提高了62.54%；DG-A 對金黃色葡萄球菌抑菌率為32.18%，DG-GA 對金黃色葡萄球菌抑菌率為75.29%，抑菌率提高了43.11%，抑菌效果明顯提升。改性后的竹粉的菌落變得稀少，這是由于沒食子酸與竹粉成功接枝，賦予了龍竹沒食子酸的抑菌能力。ZHANG 等[7]將天然果膠用沒食子酸酶法?；?，提高了對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率，這與本研究結果相似。

圖7 竹粉樣品DG-A 和DG-GA 對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果Figure 7 Antibacterial effect of bamboo powder samples DG-A and DG-GA on E.coli and S.ureus

由圖8 發(fā)現(xiàn)：DG-GA 對大腸埃希菌的抑制作用優(yōu)于金黃色葡萄球菌，這可能與革蘭氏陽性菌有較厚的肽聚糖層結構有關[23]，對比革蘭氏陰性菌的雙膜結構，這種肽聚糖層結構具有更高級的保護屏障，因此改性竹材表現(xiàn)出對大腸埃希菌的抑菌效果優(yōu)于金黃色葡萄球菌。改性得到的產(chǎn)物對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制效果，可能是因為竹粉和沒食子酸酯化后，其酚羥基能與細菌細胞上的金屬離子螯合，影響細胞膜的通透性，使細菌代謝紊亂而不能正常生長，從而起到抑菌作用[24]。

圖8 竹粉樣品DG-A 和DG-GA 對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率圖Figure 8 Antibacterial rate of bamboo powder samples DG-A and DGGA on E.coli and S.ureus

3 討論與結論

竹材由于含有營養(yǎng)物質(zhì)易被微生物感染，現(xiàn)存抑菌劑存在易流失和污染環(huán)境等問題，本研究使用沒食子酸對竹粉進行改性，結果發(fā)現(xiàn)竹粉的抑菌效果有明顯提升。通過振蕩法對改性前后竹材抑菌活性的測試可知：竹材對大腸埃希菌抑菌率為93.24%，對金黃色葡萄球菌抑菌率75.29%。該研究與已有研究結果相似，如HUANG 等[25]將沒食子酸改性果膠，對大腸埃希菌有11.41 mm 的抑菌圈，對金黃色葡萄球菌有12.52 mm 的抑菌圈，該產(chǎn)品作為涂層能有效地延長中國鱸魚Lateolabraxmuculatus魚片的整體質(zhì)量。ZHANG 等[7]用酶法酰化天然果膠，制備得到的樣品對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑制率也分別從2.93%和8.92%提高到26.95%和42.18%。改性后物料紅外分析表現(xiàn)出新的吸收峰，結晶度下降，纖維束表面變光滑，最大降解溫度增加，抑菌效力顯著增強，均表明沒食子酸與竹粉成功接枝。近些年，沒食子酸及其衍生物與竹材反應機制復雜，反應過程受多因素影響[26]。在后續(xù)研究中，可進一步闡明沒食子酸與竹材的反應及抑菌機制。

在處理顯著提高了龍竹粉可及度的基礎上，沒食子酸可以與竹粉組分之間通過酯化反應形成接枝共聚物，在竹纖維束表面形成一層包裹物，使其表面變得更加光滑；沒食子酸改性后，竹粉的熱穩(wěn)定性不僅沒有降低，反而提高約40 ℃；沒食子酸改性竹粉的抑菌效力明顯提高。