重組禽流感病毒細胞源滅活疫苗滅活工藝的研究及應(yīng)用

杜 鑫，付春杰，蘇 操，孟令偉，石 瑩，張 丹，曲艷嬌，宋海巖，朱長動，楊 柳

吉林冠界生物技術(shù)有限公司，吉林梅河口 135000

禽流感是引起水禽、野禽、家禽的一種急性高度接觸性傳染病，我國將其列為一類疫病[1,2]。防控禽流感的重要途徑是疫苗免疫，滅活疫苗不僅要求能夠產(chǎn)生高水平的抗體，還應(yīng)具備安全性良好，無不良反應(yīng)，因此生產(chǎn)安全高效的滅活疫苗意義重大。滅活是疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，滅活效果與滅活劑的選擇密切相關(guān)，理想的滅活劑不但免疫原性良好，且無任何毒副作用[3]。

本試驗用β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基胍滅活劑對重組禽流感病毒細胞毒的滅活效果進行了研究，確定了不同滅活劑的滅活的最佳條件并配苗，比較其免疫效果和安全性，篩選出了安全、高效的重組禽流感病毒細胞源滅活疫苗用滅活劑。

1 材料

1.1 病毒液

重組禽流感病毒H5 亞型Re-13 株、Re-14 株和重組禽流感病毒H7 亞型H7-Re4 株細胞毒(濃縮后HA 效價均為9log2)由吉林冠界生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 抗原、血清

禽流感病毒H5 亞型H5-Re13 株、H5-Re14 株和H7 亞型H7-Re4 株血凝抑制試驗抗原和陽性血清，購自哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司。

1.3 SPF 雞胚和SPF 雞

購自北京勃林格生物。

2 方法

2.1 病毒的滅活

2.1.1 甲醛滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加40%的甲醛溶液，使終濃度分別為 0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%，37 ℃ 130 r/min 滅活，作用至32 h，每隔8 h 取樣。

2.1.2 β-丙內(nèi)酯滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加稀釋后β-丙內(nèi)酯溶液，使終濃度分別為0.2%、0.15%、0.1%、0.05%、0.025%，4 ℃ 130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣，37 ℃作用2 h 終止。

2.1.3 N-乙酰乙烯亞胺滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加稀釋后的N-乙酰乙烯亞胺溶液，使終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37 ℃130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣，加入等量10%硫代硫酸鈉終止。

2.1.4 二乙烯亞胺滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加稀釋后二乙烯亞胺溶液，使終濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37 ℃ 130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣，加等量10%硫代硫酸鈉終止。

2.1.5 鹽酸聚六亞甲基胍滅活最佳條件：在病毒液中緩慢滴加鹽酸聚六亞甲基胍溶液，使終濃度分別為1%、2%、3%、4%和5%，37 ℃ 130 r/min 滅活，32 h 內(nèi)每隔8 h 取樣。

2.2 無菌檢驗

取滅活病毒液，進行無菌檢驗。

2.3 HA 效價

取滅活病毒液，進行HA 效價測定。

2.4 滅活檢驗

將滅活病毒液通過尿囊腔接種10 枚10 日齡SPF 雞胚，每枚0.1 mL。36 ℃孵育72 h，2 ～8 ℃冷卻，并盲傳1 代，測定HA 效價，若均為陰性，則滅活完全，反之亦然。

2.5 效力檢驗

取30 只3 周齡SPF 雞，每只胸部肌肉或頸部皮下接種疫苗0.3 mL，同時設(shè)對照雞15 只。接種21 日后采血，分離血清，用禽流感病毒H5 亞型H5-Re13 株、H5-Re14 株和H7 亞型H7-Re4 株血凝抑制試驗抗原測定HI 抗體效價。

2.6 安全性檢驗

取10 只3 周齡的SPF 雞，各胸部肌肉或頸部皮下接種疫苗2.0 mL，每日觀察，連續(xù)14 d，觀察是否有疫苗引起的不良反應(yīng)。

3 結(jié)果

3.1 病毒的滅活

3.1.1 甲醛最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定甲醛滅活的最佳條件為37 ℃0.025%濃度滅活24 h。

3.1.2 β-丙內(nèi)酯最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定β-丙內(nèi)酯滅活的最佳條件為4 ℃ 0.05%濃度滅活24 h。

3.1.3 N-乙酰乙烯亞胺最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定N-乙酰乙烯亞胺滅活的最佳條件為37 ℃ 0.5%濃度滅活24 h。

3.1.4 二乙烯亞胺最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定二乙烯亞胺滅活的最佳條件為37℃ 0.5%濃度滅活24 h。

3.1.5 鹽酸聚六亞甲基胍最佳滅活條件的確定：依據(jù)最佳滅活條件的判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定鹽酸聚六亞甲基胍滅活的最佳條件為37 ℃ 1%濃度滅活24 h。

3.2 效力檢驗

甲醛滅活疫苗組、β-丙內(nèi)酯滅活疫苗組和二乙烯亞胺組滅活疫苗組免疫21 d 后H5-Re13株、H5-Re14 株和H7-Re4 株抗體效價（GMT）均在8log2 以上。N-乙酰乙烯亞胺滅活疫苗組和鹽酸聚六亞甲基胍滅活疫苗組免疫21 d 后H5-Re13株、H5-Re14 株和H7-Re4 株抗體效價（GMT）均在7log2 以上。結(jié)果表明，抗體效價甲醛滅活疫苗組、β-丙內(nèi)酯滅活疫苗組、二乙烯亞胺滅活疫苗組抗體效價高于N-乙酰乙烯亞胺滅活疫苗組、鹽酸聚六亞甲基胍滅活疫苗組。

3.3 安全性檢驗

結(jié)果表明，β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基滅活疫苗免疫雞后，連續(xù)觀察14 d，免疫部位均無炎癥反應(yīng)，疫苗均吸收良好，采食、飲水和精神狀態(tài)均正常，無不良臨床癥狀。

4 討論

多年來,通常都是用甲醛作為動物用滅活疫苗滅活劑。但其存在強刺激性、強致癌、殘留過多易產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)等缺陷[3]。國內(nèi)外學(xué)者一直在探尋更理想的滅活劑用于AIV 滅活疫苗的生產(chǎn)。施維松等［4］使用二乙烯亞胺對禽流感病毒Re-5 株進行滅活，并篩選出了滅活的最佳條件，制苗免疫后二乙烯亞胺滅活疫苗抗體效價高于甲醛滅活疫苗。黃文科等［5］使用β-丙內(nèi)酯對禽流感病毒H9N2 進行了滅活，配苗后免疫抗體效價與甲醛相當(dāng)。

疫苗生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)病毒的種類，選擇不同的滅活劑用于滅活，在選用滅活劑時以較低濃度、溫度和較短作用時間處理為好，以保證疫苗安全與效價。以此為依據(jù)，本研究設(shè)計了不同濃度的β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基胍作為滅活劑，在不同作用時間下對AIV 進行的滅活，通過血凝（HA）試驗、滅活和無菌檢驗確定了β-丙內(nèi)酯、甲醛、二乙烯亞胺、N-乙酰乙烯亞胺、鹽酸聚六亞甲基最佳的滅活條件。將滅活后的病毒液配苗，進行安全性檢驗，結(jié)果表明接種SPF 雞后均無不良反應(yīng)。效力檢驗結(jié)果表明，甲醛、β-丙內(nèi)酯、二乙烯亞胺抗體效價均在8log2以上，N-乙酰乙烯亞胺和鹽酸聚六亞甲基體效價均在7log2 以上，均遠高于國家標(biāo)準(zhǔn)（6log2）。從5 種滅活劑對AIV 滅活,通過HA 試驗、無菌檢驗、滅活檢驗結(jié)果以及對SPF 雞的抗體效價綜合分析，再從毒性及試劑穩(wěn)定性來考慮，最好的滅活劑為β-丙內(nèi)酯，其次為二乙烯亞胺和甲醛，最后為N-乙酰乙烯亞胺和鹽酸聚六亞甲基,本研究為禽流感病毒的滅活提供參考依據(jù)，為規(guī)?；a(chǎn)重組禽流感病毒細胞源滅活疫苗所需的理想滅活劑應(yīng)用提供了依據(jù)?？紤]到β-丙內(nèi)酯成本較高，不同的疫苗企業(yè)可根據(jù)自己的實際情況進行選擇。